Avaliação quantitativa de PCR em tempo real de expressões de microRNA no rim do rato com obstrução ureteral unilateral

Este método permite fornecer expressão de microRNA em rins de camundongos com uma ampla gama de condições patológicas, como a fibrose renal. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o perfil de expressão microRNA com alta precisão e sensibilidade usando um processo simples que economiza tempo e previne erros técnicos. Para realizar a falsa cirurgia, use tesoura cirúrgica e pinça para fazer uma incisão na pele no abdômen e cortar a membrana muscular e peritoneal da bexiga até a borda inferior esquerda das costelas.

Umedeça dois cotonetes de algodão com PBS e puxe cuidadosamente os intestinos para o lado. Coloque os cotonetes umedecidos para identificar o rim esquerdo e o ureter. Feche a membrana peritoneal e, em seguida, a incisão com 4-0 nylon.

Para realizar a obstrução uretral unilateral, ou UUO, faça uma incisão na pele no abdômen e corte a membrana muscular e peritoneal como demonstrado para a cirurgia falsa. Coloque uma seringa de 2,5 mililitros debaixo do mouse. Umedeça dois cotonetes de algodão com PBS, depois puxe os intestinos cuidadosamente para o lado com a pinça e coloque os cotonetes para identificar o ureter esquerdo.

Use a pinça para levantar o rim esquerdo. Use 4-0 de seda para ligar o ureter esquerdo em dois lugares com aproximadamente um centímetro de distância. Corte o ureter no ponto central das duas ligaduras e, em seguida, use suturas de nylon 4-0 para fechar a membrana peritoneal e incisão.

Depois de cortar a membrana peritoneal, como demonstrado anteriormente, levante-a com pinças e use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão lateral na borda superior, em seguida, continuar a incisão ao longo da borda mais baixa das costelas. Identifique o rim esquerdo e refluxeá-lo com PBS até que o rim fique amarelo-branco. Remova o rim cortando a artéria renal esquerda e a veia com a tesoura cirúrgica e coloque-o em uma placa de Petri, em seguida, lave-o cuidadosamente com PBS.

Corte o rim em aproximadamente 10 miligramas de amostras com a tesoura cirúrgica e a pinça, coloque cada pedaço do rim em seu próprio tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e feche a tampa do tubo. Coloque uma amostra de rim no homogeneizador de silicone e adicione 700 microliters de um reagente de lise à base de fenil/guanidina. Pressione lentamente e torça o pilão do homogeneizador contra a amostra de rim para homogeneizá-lo.

Repita a prensagem e a torção até que a amostra esteja completamente dissolvida no reagente de lise. Para homogeneizar ainda mais a amostra, transfira o lise homogeneizado para a coluna de rotação biopolímera e gire-a a 14.000 vezes G por três minutos, depois transfira o lysato precipitado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro nãoutilizado. Misture o lise no tubo com 140 microliters de clorofórmio e tampe o tubo firmemente.

Para misturar o liseto e o clorofórmio, inverta o tubo 15 vezes. Incubar as amostras por dois a três minutos em temperatura ambiente, depois gire-as a 12.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Sem perturbar o precipitado, transfira o supernascer para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, e adicione 1,5 vezes seu volume de 100% de etanol.

Vórtice a mistura por cinco segundos. Carregue 700 microliters da amostra em uma coluna de spin ancorada em membrana em um tubo de coleta de dois mililitros. Feche a tampa da coluna e gire a coluna a 15.000 vezes G por 15 segundos, depois jogue fora o lise precipitado no tubo de coleta.

Lave bem a amostra adicionando 700 microliters de tampão de lavagem um na coluna de giro ancorado na membrana em um tubo de coleta de dois mililitros. Em seguida, repita a centrifugação e jogue fora o tubo de coleta. Repita a lavagem duas vezes com 500 microliters de tampão de lavagem dois por lavagem.

Após a última lavagem, gire a coluna de giro ancorada em membrana em um tubo de coleta de dois mililitros a 15.000 vezes G por um minuto e jogue fora o lise precipitado. Transfira a coluna de giro ancorada na membrana para um novo tubo de 1,5 mililitro. Dissolva o RNA total adicionando 30 microliters de água sem RNase à coluna, feche a tampa da coluna e deixe-a por cinco minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, gire a coluna a 15.000 vezes G por um minuto. Transfira a amostra contendo RNA total para um novo tubo de microcentrifuuge no gelo, e meça a concentração de RNA total por espectrofotometria. Prepare uma solução de mistura mestre de acordo com as instruções do manuscrito e adicione oito microliters a cada tubo de uma tira de tubo de oito poços.

Depois de ajustar a densidade total de RNA, coloque uma alíquota de 12 microliter de RNA total em cada tubo e feche a tampa. Centrifugar os tubos por 15 segundos. Coloque os tubos no termociclador e incuba-os por 60 minutos a 37 graus Celsius.

Quando terminar, incuba-os imediatamente por cinco minutos a 95 graus Celsius para a síntese de cDNA. Transfira o cDNA para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e dilui-o 10 vezes com água destilada. Vórtice e centrífuga do tubo por cinco segundos, em seguida, executar PCR quantitativo em tempo real, como descrito no manuscrito do texto.

Este protocolo foi usado para criar um modelo unilateral de rato de obstrução uretral através de ligadura ureteral esquerda em camundongos machos de oito semanas de idade pesando de 20 a 25 gramas. Os ureteres foram completamente obstruídos por ligadura dupla com suturas de seda 4-0. Os rins foram coletados aos oito dias após a cirurgia.

Os dados do microRNA qRT-PCR indicaram que o nível de microRNA 3070-3p foi significativamente aumentado e os níveis de microRNA, 7218-5p e microRNA 7219-5p foram diminuídos nos rins dos camundongos UUO em comparação com os controles. Ao tentar este protocolo, lembre-se de repetir torção da amostra de rim até que ela seja completamente dissolida em reagente de lise à base de fenil/guanidina para obter uma boa extração de RNA.