Name: Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 41 s
Description: Aprenda a técnica de hibridização Northern modificada para detectar e quantificar microRNAs vegetais de 20-24 nucleotídeos com alta resolução. Este método valida dados de sequenciamento de nova geração.

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Os autores reconhecem o acesso ao laboratório de radiação fornecido pelo instituto anfitrião e pelo BRIT para radioisótopos. O laboratório PVS é apoiado pelo Centro Nacional de Ciências Biológicas do Instituto Tata de Pesquisa Fundamental e bolsas (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia. MP reconhece DBT-Research Associateship, DBT, Governo da Índia.

1. Preparação de um gel de poliacrilamida de 15% de desnaturação
<ol><li>Pesar e adicionar 4,8 g de ureia, adicionar 3,75 mL de 40% de acrilamida: solução bisacrilamida (19:1) e 1 mL de 10x TBE pH 8.2 em um tubo estéril de 50 mL.</li>
	<li>Dissolva a ureia usando um banho de água a 60 °C em uma solução clara.</li>
	<li>Recarrege o volume para 10 mL usando água estéril recém-autoclavada e esfrie a mistura de gel à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare a solução fresca de persulfito de amônio de 10% (p/v).</li>
</ol>2. Montagem das placas de vidro e unidade de eletroforese
<ol><li>Lave todos os aparelhos necessários para a eletroforese do gel e eletro-blotting com detergente. Esfregue-os suavemente usando uma esponja macia para remover tampão residual e acrilamida, enxágue com água e deixe-os secar.</li>
	<li>Monte as duas placas de vidro juntas e coloque-as firmemente sobre a esponja. Use uma placa de 1 mm de espessura para esta configuração. Certifique-se de que as placas estão no mesmo nível para evitar vazamentos.</li>
	<li>Ao mix de gel de 10 mL, adicione 8 μL de TEMED e 80 μL de solução de persulgônio de amônio recém-preparada de 10% (w/v).</li>
	<li>Sem demora, misture delicadamente e despeje isso entre as placas de vidro montadas. Coloque o pente com cuidado. Evite gerar bolhas de ar nesta etapa.</li>
	<li>Deixe o gel polimerizar por aproximadamente 45 min.</li>
	<li>Lave o gel polimerizado com água estéril antes de colocar dentro da configuração de gel.</li>
	<li>Monte as placas dentro do de corrida e remova o pente suavemente.</li>
	<li>Despeje 1x TBE estéril recém-preparado, pH 8.2 no tanque.</li>
	<li>Lave os poços cuidadosamente, encanar o tampão para remover cristais de sal. Esta etapa ajuda a amostra de RNA a correr uniformemente através do gel.</li>
	<li>Faça uma pré-execução em 80 V por 30 minutos.</li>
</ol>3. Preparação de corante de carregamento e amostras
<ol><li>Para 10 mL de corante de carregamento de gel, pese 5 mg de azul bromofenol, 5 mg de cianol de xileno, adicione 10 mL de formamide desionizado cuidadosamente e misture-os bem.</li>
	<li>Aliquot 10 μg de RNA total em um tubo estéril de 1,5 mL e seque as amostras usando um speedvac. Não seque demais as amostras.</li>
	<li>Resuspend as amostras de RNA em 8 μL de carregamento.</li>
	<li>Aqueça as amostras a 98 °C por 2 min, esfrie por 1 min no RT, vórtice e gire as amostras, por 3 vezes. Esta etapa é essencial para a ressuspensão adequada e, por sua vez, ajuda no carregamento igual das amostras.</li>
</ol>4. Eletroforese de gel
<ol><li>Pare a pré-execução e lave os poços antes do carregamento da amostra.</li>
	<li>Aqueça as amostras a 98 °C por 1 min e carregue as amostras quentes no poço usando pontas capilares. Insira a ponta na parte inferior do poço, de modo que a amostra ocupe uma camada fina no poço.</li>
	<li>Carregamento completo de todas as amostras. Inclua carregar o marcador da década de RNA.</li>
	<li>Execute o gel a 80 V até que o corante azul bromofenol funcione quase completamente. Bromophenol azul funciona a 10 bp em um gel de acrilamida de 15% de desnaturação.</li>
</ol>5. Preparação para eletro-mancha
<ol><li>Corte a membrana N+nylon nas dimensões da placa de vidro e rotule a membrana em seu canto superior direito com um lápis HB.</li>
	<li>Coloque suavemente a membrana na superfície da água estéril, voltada para o lado rotulado em direção à superfície da água. Pré-mergulhe a membrana por 15 minutos.</li>
	<li>Corte 4 pedaços de papel manchado I nas dimensões da almofada de fibra.</li>
	<li>Prepare o sanduíche de gel para colocar o lado cinza do em uma bandeja limpa.</li>
	<li>Pré-molhar a almofada de fibra e colocá-la sobre o. Remova bolhas de ar.</li>
	<li>Pré-molhado um pedaço de papel de mancha em 1x TBE e coloque sobre a almofada de fibra. Remova as bolhas de ar rolando uma pipeta de plástico sobre o papel. Coloque outro pedaço de papel de mancha pré-molhado e remova bolhas de ar.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o gel do de corrida e coloque-o sobre a configuração do sanduíche, de tal forma que a primeira amostra de RNA carregada seja para a direita.</li>
	<li>Mergulhe suavemente a membrana pré-encharcada em 1x TBE e coloque-a sobre o gel, de frente para o lado rotulado para baixo. Role para fora para remover as bolhas de ar.</li>
	<li>Mergulhe um pedaço de papel manchado, coloque-o sobre a membrana, e remova as bolhas de ar. Mergulhe outro pedaço de papel manchado, coloque-o sobre a configuração do sanduíche e remova bolhas de ar.</li>
	<li>Complete o sanduíche colocando uma almofada de fibra pré-molhada sobre a configuração e feche firmemente o.</li>
	<li>Coloque o transblot no módulo e encha 1x TBE, pH 8.2 até a marca de manchas.</li>
	<li>Transfira a 10 V, durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Após a transferência, coloque a membrana úmida em uma folha de papel e transfira imediatamente o RNA à membrana por irradiação com luz UV de 254 nm (120.000 μjoules/cm²). A mancha transversal talvez armazenada a 4 °C para posterior hibridização.</li>
</ol>6. Preparação da sonda radiolabeled
<ol><li>Projete uma sonda completamente complementar ao pequeno RNA que deve ser detectado.</li>
	<li>Rotule a sonda final usando32ATP (obtida da BRIT) no final de 5' combinando os componentes conforme receita fornecida na Tabela 1.</li>
	<li>Incubar a mistura de reação acima a 37 °C por 30 min.</li>
	<li>Separe o ATP não rotulado de32ATP da sonda usando uma coluna Sephadex G-25 de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
</ol>7. Hibridização da mancha
<ol><li>Coloque a mancha cruzada, o lado RNA voltado para cima dentro de uma garrafa de hibridização.</li>
	<li>Misture vigorosamente o tampão de hibridização ultrassensível, adicione 10 mL dele e incubar a mancha dentro de um forno de hibridização mantido a 35 °C, com rotação.</li>
	<li>Realizar a pré-hibridização por 20 min.</li>
	<li>Retire a garrafa do forno e adicione a sonda rotulada no tampão de hibridização suavemente.</li>
	<li>Hibridize a mancha a 35 °C, com rotação para 12 h.</li>
	<li>Após a hibridização transfira cuidadosamente a solução de hibridização para tubo de 15 mL. Esta solução pode ser armazenada a 4 °C até reutilizar.</li>
	<li>Realize uma lavagem rápida da mancha por 2 minutos para remover a solução de hibridização em excesso adicionando tampão SSC 2x mais SDS de 0,5%. Descarte a solução.</li>
	<li>Incubar a mancha com tampão SSC 2x mais SDS de 0,5% para 35 °C, com rotação de 30 min.</li>
	<li>Lave a mancha novamente com tampão SSC de 0,5x mais SDS de 0,5% para 35°C, com rotação de 30 min.</li>
	<li>Coloque a mancha dentro de uma tampa de hibridização, remova o excesso de tampão e sele-a.</li>
	<li>Exponha-o a uma tela de imagem de fósforo livre de radiação durante a noite dentro de uma fita.</li>
	<li>Detecte o sinal de hibridização usando imager biomolecular e analise os resultados usando software adequado.</li>
	<li>Retire a mancha incubando-a a 80 °C, com rotação para 30 min com tampão SSC de 0,5 X mais 0,1% SDS e 0,1 X SSC tampão mais 0,1% SDS por 30 min.</li>
</ol>

<ol><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li>
<li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Indian+National+Science+Academy%22%5BJournal%5D)">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li>
<li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li>
<li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li>
<li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li>
<li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li>
<li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li>
<li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

Este método pode ser amplamente utilizado para detecção e quantificação de pequenos RNAs, incluindo miRNAs menos abundantes. O protocolo descreve principalmente os passos para desnaturar o RNA total em um buffer de carregamento, separação de tamanho por eletroforese de gel, transferência de RNA para uma membrana, cruzar o RNA para a membrana e hibridizar usando sondas oligo chamadas radiolabeled desejadas.
O passo crítico para qualquer experimento de manchas é o uso de RNA de boa qualidade par...

A recente descoberta de pequenas RNAs regulatórias, microRNAs, tem liderado pesquisas para entendê-las e seu papel em plantas e animais1. Precursores longos de miRNAs são processados em miRNAs maduros de 21 a 24 nt por HYL1 e proteínas específicas semelhantes a dicer2,,3. Um miRNA de 22 nt pode iniciar o silenciamento em cascata gerando siRNAssecundárias 4. Estudos têm mostrado o papel das miRNAs e siRNAs secundárias no desenvolvimento, destino celular e respostas ao estresse5,6.
A hibridização do norte é um método experimental rotineiramente empregado para detectar moléculas específicas de RNA. Este método personaliza seu uso na detecção de aproximadamente 19 -24 nt de comprimento pequeno RNAs de um pool de RNAs totais7. Nesta demonstração, ilustramos o uso desta técnica para a detecção e quantificação de miRNAs. Este método utiliza rotulagem de sondas usando radioisótopos; assim, os níveis de miRNA na amostra podem ser detectados com maior sensibilidade. Ao contrário dos métodos baseados em PCR, este método garante quantificação de expressão, bem como determinação de tamanho dos miRNAs. Neste protocolo, mostramos passos cruciais que melhoram a detecção de miRNA. Modificamos etapas em blotting e hibridização para obtenção de detecção de sinal de alta resolução de miRNAs. Esta técnica também pode ser usada para a detecção de outros RNAs pequenos endógenos, como siRNAs, RNAs tasi-secundários e snoRNAs.

<table><tbody><tr><td>Solução de acrilamida-bisacrilamida a 40%</td><td>Sigma</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Papel mata-borrão</td><td>whatmann papel mata-borrão I</td><td>1001-125</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de carregamento capilar</td><td>BioRad</td><td>2239915</td><td></td></tr><tr><td>Deionizado formamida</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento</td><td>Eppendorff</td><td>5350</td><td></td></tr><tr><td>Hybond N + membrana de nylon</td><td>GE</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de hibridização</td><td>Sigma</td><td>Z374792-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Forno de hibridização</td><td>Thermo Scientific</td><td>1211V79</td><td></td></tr><tr><td>N, N, N ', N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T7024-25ml</td><td></td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>GE- Scanner de tufão</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>tela e PhosphorImager</td><td>GE healthcare</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Gilson, modelos: P20 e P10</td><td>FA10002M, FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de plástico</td><td>Falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de gel de poliacrilamida</td><td>BioRad</td><td>1658003EDU</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 coluna</td><td>GE</td><td>27532501</td><td></td></tr><tr><td>Speed Speed Vac Concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td>20-548-130</td><td></td></tr><tr><td>Spinwin</td><td>Tarsons</td><td>1010</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td> <td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Transblot aparelho</td><td>BioRad</td><td>1703946</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAHyb tampão de hibridização</td><td>Ambion</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Fischer Scientific</td><td>15985</td><td></td></tr><tr><td>Reticulador UV UVP</td><td></td><td>CL-1000L</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Tarsons</td><td>3020</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>NEOLAB</td><td>D-8810</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol</td><td>Sigma</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de blot de rna para detecção e quantificação de micrornas vegetais

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de não codificação expressa endógenamente expressa, ~21 nt pequenos RNAs envolvidos na regulação da expressão genética em plantas e animais. A maioria dos miRNAs atuam como interruptores negativos de expressão genética visando genes-chave. Nas plantas, as transcrições miRNAs primárias (pri-miRNAs) são geradas pela polimerase RNA II, e formam diferentes comprimentos de estruturas estáveis de laço-tronco chamadas pré-miRNAs. Uma endonuclease, semelhante a Dicer1, processa os pré-miRNAs em duplexes miRNA-miRNA*. Um dos fios do duplex miRNA-miRNA* é selecionado e carregado na proteína Argonaute 1 ou seus homólogos para mediar o decote dos mRNAs alvo. Embora os miRNAs sejam moléculas-chave de sinalização, sua detecção é frequentemente realizada por métodos baseados em PCR menos que ideais em vez de uma análise sensível da mancha do norte. Descrevemos um método norte simples, confiável e extremamente sensível que é ideal para a quantificação dos níveis de miRNA com sensibilidade muito alta, literalmente de qualquer tecido vegetal. Além disso, este método pode ser usado para confirmar o tamanho, estabilidade e a abundância de miRNAs e seus precursores.

Nesta demonstração, detectamos e quantificamos a expressão do miR397 em diferentes tecidos de arroz indica var whiteponni(Figura 1). miR397 é um miRNA de 22 nt e miRNA conservado. A expressão do miR397 pode ser detectada em todas as amostras testadas. De acordo com os dados de sequenciamento de próxima geração, a amostra 1 (tecido de mudas) tem miR397 a 5 leituras por milhão (rpm). Detectamos seu sinal confortavelmente, indicando que o método é muito sensível e pode ser usa...

Este método demonstra o uso da técnica de hibridização do norte para detectar miRNAs a partir do extrato total de RNA.

Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Oi. Então este é um pequeno protocolo RNA norte. É uma derivada de protocolo originalmente otimizada pelo Dr. Rashid Akbergenov.Neste método, pode-se detectar pequenos RNA's de qualquer lugar entre 20-24 nucleotídeos de comprimento, muito precisamente e em alta resolução. O protocolo é basicamente uma forma modificada de análise tradicional do Norte, mas aqui, a porcentagem de acrilamida é bastante alta, é de 15%. Este norte pode ser usado para detectar RNA pequeno já conhecido, seja micro RNA ou outro conjunto de RNA pequeno, quando a sequência é conhecida ou pode ser usada para confirmação de abundância de RNA pequeno vindo de conjuntos de dados de sequenciamento de próxima geração.A vantagem deste método é que, não se pode apenas olhar para a abundância de micro RNA, mas também a abundância de precursores, por exemplo micro RNAs pode deixar de fora um precursor que é em torno de 30 a ser algumas centenas de nucleotídeos de comprimento, isso também pode ser detectado simultaneamente, juntamente com o micro RNA. O protocolo é muito simples, muito direto, mas é preciso ser muito cauteloso ao executar alguns passos críticos que estão listados no final deste protocolo. Para a preparação de 10 mL de mistura de gel, adicione 4,8 gramas de ureia, 3,75 mL de solução de acrilamida de 40% e 1 mL de 10X TBE recém-preparado, pH 8.2 e misture suavemente a solução.Dissolva completamente a ureia, aquecendo a mistura em um banho de água, até que a solução pareça clara. Coma o volume até 10 mL, usando água MilliQ estéril e esfrie a mistura de gel à temperatura ambiente. Lave o aparelho necessário com detergente, esfregue-os suavemente para remover TBE e Acrilamida residuais.Enxágüe-os ainda mais com água MilliQ e deixe-a secar. Monte a placa de vidro juntos, certifique-se de que ambos estão no mesmo nível. Coloque-os firmemente sobre a esponja.Adicione 8 micro litros de TEMED e 80 micro litros de APS 10% recém-preparados ao mix de gel. Misture delicadamente e despeje a mistura de gel nas placas montadas. Certifique-se de que o gel não vaze.Coloque o pente com cuidado. Deixe o gel polimerizar por aproximadamente 45 minutos. Após a polimerização do gel, remova as placas de vidro do conjunto.Lave as placas de vidro com água MilliQ. E coloque-os na fita de corrida. Coloque o funcionando dentro do tanque.Despeje recém-preparado 1X TBE, pH 8.2. Remova o pente cuidadosamente. Lave bem os poços do gel, encanar o tampão.Esta etapa remove precipitações de ureia do poço e facilita o RNA para correr uniformemente através do gel. Feche a tampa do aparelho e pré-execute o gel vazio a 80 volts por 30 minutos, para verificar se há algum vazamento de buffer. Para a preparação de 10 mL de corante de carga, pese 5 mg de azul bromofenol, 5 mg de cianol de xileno e adicione 10 mL de formamida deioinizada e misture-os bem.Aliquot o corante e armazene a 4 graus para uso posterior. Alíquota 10 microgramas de RNA total em tubos estéreis de 1,5 mL. Certifique-se de que a qualidade do RNA, ou seja.a proporção 260:230 é maior ou mais próxima de duas. Coloque o tubo dentro de uma velocidadeVac e seque as amostras. Suspenda as amostras de RNA secas em 8 micro litros de corante de carregamento.Aqueça as amostras a 98 graus por dois minutos. Esfrie-os por um minuto em temperatura ambiente. Vórtice as amostras de RNA resfriadas para garantir a suspensão adequada no corante de carregamento.Gire os tubos. Repita os passos de aquecimento, resfriamento e vórtice por três vezes para obter RNA fluindo livremente. Pare a pré-execução do gel.Lave bem os poços, antes de carregar a amostra, para remover os depósitos da ureia dentro dos poços. Aqueça as amostras de RNA re-suspensas a 98 graus por um minuto. Coloque as amostras quentes nos poços usando pontas capilares.Evite introduzir bolhas de ar. Carregamento completo de todas as amostras e montar a tampa. Execute o gel a 80 volts por três horas ou até que o azul bromofenol corra completamente.Use membrana de nylon carregada positivamente para a transferência. Corte-o nas dimensões da placa de vidro. Rotule a membrana no canto superior direito.Coloque suavemente a membrana na superfície da água MilliQ estéril certifique-se de colocar o lado da etiqueta para baixo, de frente para a superfície da água. Pegue uma bandeja limpa e prepare o sanduíche de gel para a transferência de eletro. Coloque o lado cinza da fita para baixo.Despeje 1X TBE ligeiramente acima do nível do. Pré-molhe a almofada de fibra em 1X TBE e esprema-a para remover bolhas de ar. Corte dois pedaços de papel manchado do tamanho de fibra.Pré-molhar um pedaço de papel manchado em 1X TBE e colocá-lo sobre a almofada de fibra. Remova as bolhas de ar rolando uma pipeta de plástico sobre o papel. Pré-molhar outro pedaço de papel manchado em 1X TBE e colocá-lo sobre o.Role para remover bolhas de ar. Agora a configuração do sanduíche está pronta para transferência de eletro. Após a conclusão da eletroforese, pare a corrida e remova a tampa do aparelho.Remova o de execução da configuração. Tire as placas de vidro do. Remova cuidadosamente o gel da montagem.Coloque-o sobre o papel de mancha de tal forma que a primeira amostra de RNA carregada seja para a sua direita. Mergulhe suavemente a membrana pré-encharcada em 1X TBE e coloque-a sobre o gel, de frente para o lado rotulado para baixo. Não deixe a membrana e o gel secarem.Role suavemente para remover a bolha de ar. Mergulhe um pedaço de papel manchado em 1X TBE e coloque-o sobre a membrana. Remova bolhas de ar.Coloque outro pedaço de papel manchado e remova as bolhas de ar. Complete o sanduíche colocando a almofada de fibra sobre o conjunto. Feche a fita com firmeza.Coloque o trans-blot no módulo. Encha o tanque com 1X TBE, pH 8.2, até a marca de manchas. Feche a tampa do aparelho e transfira a 10 volts durante a noite a 4 graus ou em uma sala fria.Mantenha o linker cruzado UV pronto e coloque-o em 1200, pouco antes da conclusão da transferência de eletro. Após a conclusão da transferência, remova o do módulo. Coloque a membrana úmida em uma folha A4, colocando o lado marcado para cima.Cruze o RNA à membrana por irradiação com 254 nanômetros de luz UV a 120 milissegundos. A mancha transversal pode ser armazenada em quatro graus ou usada para hibridização. Projete uma sonda que seja completamente complementar ao pequeno RNA que precisa ser detectado.Rotule a sonda em cinco extremidades prime usando enzima PNK e combine os componentes como mostrado. Incubar a mistura de reação a 37 graus por 30 minutos. Após 30 minutos de incubação use colunas G-25 para separar sondas não rotuladas da mistura de reação.Para uma rotulagem melhorada da sonda, prepare a coluna G-25 antes de usar. Coloque a mancha, lado RNA de frente para cima, dentro de uma garrafa de hibridização. Misture vigorosamente o tampão de hibridização antes de usar.Adicione 10 mL de tampão de hibridização dentro e coloque a garrafa de hibridização dentro do forno de hibridização, mantenha a 35 graus com rotação. Realizar a pré-hibridização por 20 a 30 minutos. Após a pré-hibridização, retire a garrafa do forno.Adicione a sonda rotulada no buffer de hibridização suavemente. Certifique-se de que as bolhas de ar não sejam criadas. Incubar a mancha dentro do forno a 35 graus com rotação por 12 horas.Após a hibridização, remova o tampão de hibridização da garrafa. Realize uma lavagem rápida das manchas, usando tampão de lavagem-I. Esta etapa é realizada para remover o excesso de solução de hibridização das manchas.Incubar ainda mais as manchas a 35 graus por 30 minutos usando tampão de lavagem-I. Realize outra lavagem usando buffer-II a 35 graus por 30 minutos. Após a lavagem da mancha, coloque-a dentro de uma tampa de hibridização, remova o excesso de tampão e sele-a.Coloque-o dentro de um e exponha-o a uma tela de imagem fosfo livre de radiação por 12 horas. Detecte o sinal de hibridização usando o imager biomolecular tufão e analise os resultados usando o software ImageJ. Para hibridização da mancha com outras sondas, execute etapas de descascamento como ilustrado.Com esta técnica pode-se estimar a abundância de micro RNA, bem como seu comprimento. A partir desta imagem, a expressão do micro RNA 397 pode ser detectada em todas as amostras. Nesta mancha, a abundância de amostra é de aproximadamente 5 leituras por milhão, conforme dados de sequenciamento de próxima geração, sugerindo que nossa técnica pode detectar micro RNAs menos abundantes também.Além disso, utilizando o software de quantificação ImageJ, pode-se quantificar a expressão do micro 397 entre as amostras. Aqui usamos U6 e micro RNA 168 como controles de carregamento. Falarei de alguns passos cruciais que devem ser considerados durante a realização do experimento.Certifique-se de usar RNA de boa qualidade para preparação da amostra. Enquanto o vácuo seca as amostras, evite secá-las demais. A re-suspensão do RNA no corante de carregamento é fundamental.Certifique-se de preparar uma amostra de fluxo livre. Deve-se tomar cuidado durante o carregamento do gel. Os poços do gel devem ser lavados e a amostra deve ser carregada em linha reta dentro dos poços.Durante a transferência de eletro, a disseminação da membrana na água, pouco antes de mergulhá-la em 1X TBE é essencial, melhora a transferência. A hibridização da mancha deve ser realizada a 35 graus. Mantenha a temperatura do forno de hibridização.Para o uso repetido das manchas, as membranas devem ser armazenadas em 4 graus. Eles devem ser mantidos úmidos em 2X SSE. Ao contrário de outros métodos baseados em PCR, este método garante a quantificação da expressão, bem como a determinação do tamanho das micro RNAs.

rna-blot-analysis-for-detection-quantification-plant

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste vídeo, demonstramos o northern blot, uma técnica de hibridização para detectar e quantificar microRNAs (miRNAs) do RNA total extraído do tecido vegetal.

Northern blot para detectar e quantificar microRNA específico no extrato total de RNA do tecido vegetal

Molecular sinalização através de estrogênio e microRNAs são fundamentais no desenvolvimento do câncer de mama e de crescimento. O estrogênio ativa os receptores de estrogênio, que são fatores de transcrição. Muitos fatores de transcrição pode regular a expressão de microRNAs e microRNAs regulados por estrogénios podem ser perfilado utilizando diferentes técnicas de larga escala.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

O objetivo desta publicação é visualizar e discutir os passos operatórios de um protocolo de Northern Blot em RNA extraído de Drosophila melanogaster avançado embriões, células e tecidos. Este protocolo é particularmente útil para a detecção eficiente de espécies de ARN pequenas.

Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em Drosophila melanogaster

MicroRNAs circulam surgiram recentemente como biomarcadores promissoras e inovadoras para vários tipos de câncer e outras doenças. O objetivo deste artigo é discutir três diferentes plataformas baseadas em sonda de PCR em tempo real e métodos que estão disponíveis para quantificar e determinar a abundância de microRNAs em circulação.

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Descrevemos o uso de uma plataforma de expressão gênica multiplexada de alto rendimento que quantifica a expressão gênica por código de barras e contagem de moléculas em substratos biológicos sem a necessidade de amplificação. Usamos a plataforma para quantificar a expressão de microRNA (miRNA) no sangue total em indivíduos com e sem síndrome do intestino irritável.

Perturbações de circulação miRNAs na Síndrome do Cólon Irritável detectada usando um multiplexado de alta capacidade: Plataforma Gene Expression

Este relatório descreve um método rápido e confiável para validar alvos de mRNA de miRNAs celulares. O método usa biotinilado sintético baseado no LNA de ácido nucleico trancado miRNA imita para capturar o alvo do mRNA. Posteriormente, grânulos magnéticos streptavidin-revestidas são empregados para pulldown o alvo mRNA para quantificação por qPCR reação em cadeia da polimerase.

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

Um pipeline de bioinformática, ou seja, miRDeep-P2 (miRDP2 para breve), com critérios de miRNA de plantas atualizados e um algoritmo revisado, poderia analisar com precisão e eficiência transcriptomas microRNA em plantas, especialmente para espécies com genomas complexos e grandes.

Um pipeline de bioinformática para analisar com precisão e eficiência os transcriptomas de MicroRNA em plantas

Aqui, descrevemos uma estratégia passo a passo para isolar pequenas RNAs, enriquecedora para microRNAs e preparando amostras para sequenciamento de alta taxa de transferência. Em seguida, descrevemos como processar leituras de sequência e alinhá-las ao microRNAs, usando ferramentas de código aberto.

Um pipeline completo para isolar e sequenciar MicroRNAs e analisá-los usando ferramentas de código aberto

O ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado é um método à base de anticorpos usado para enriquecer para fragmentos de RNA metilado. Juntamente com sequenciamento profundo, leva à identificação de transcrições carregando a modificação m5C.

Ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado para estudar m5C modificação em Arabidopsis

Aqui, apresentamos um novo e totalmente automatizado pipeline de miRNA, mirMachine, que 1) pode identificar miRNAs conhecidos e novos com mais precisão e 2) é totalmente automatizado e disponível gratuitamente. Os usuários agora podem executar um script de envio curto para executar o pipeline mirMachine totalmente automatizado.

mirMachine: Um balcão único para anotação de miRNA de planta

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Aprenda a técnica de hibridização Northern modificada para detectar e quantificar microRNAs vegetais de 20-24 nucleotídeos com alta resolução. Este método valida dados de sequenciamento de nova geração.

Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais

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