Junção neuromuscular in vitro induzida de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Este sistema de indução de junção neuromuscular humana pode ser usado para induzir a formação de componentes pré e pós-sinápticos, incluindo neurônios motores, músculo esquelético e células schwann. Não só uma estrutura NMJ madura e complexa pode ser obtida em um único prato de cultura de uma única população de células iniciais, mas o NMJ resultante também possui a capacidade de contrair. Este método tem potencial para estudar doenças neuromusculares, como atrofia muscular espinhal, e para rastreamento composto terapêutico.

O NMJ diferenciado é um tecido muito grosso e complexo, e é difícil de visualizar. Ao demonstrar o procedimento, podemos instruir os leitores como identificar estruturas específicas. Lave as células com três mililitros de PBS antes de adicionar um mililitro de solução de descolamento celular a uma placa de Petri.

Após 10 minutos a 37 graus Celsius, adicione três mililitros de células-tronco embrionárias primatas para cada poço e pipeta suavemente três vezes para dissociar as células das fendas. Em seguida, acumule os supernacantes contendo células-tronco separadas em um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação e resuspenque a pelota de células-tronco em três mililitros de células-tronco embrionárias frescas complementadas com 10 inibidores Y-27632 ROCK micromolar para contar. Em seguida, dilua as células para duas vezes 10 a cinco células por mililitro de médio suplementado com concentração inibidora de ROCHA e devolva dois mililitros de células para cada deslizamento em cada poço da placa de seis poços revestidas de matriz extracelular.

Após 24 horas, substitua o supernatário em cada poço por dois mililitros de células-tronco embrionárias primatas frescas complementadas com um micrograma por mililitro de doxiciclina e devolva a placa à incubadora de cultura celular por 24 horas. Ao final da incubação, substitua os supernacantes por dois mililitros de meio de diferenciação suplementados com doxiciclina por poço e devolva a placa à incubadora de cultura celular por 10 dias. Ao final da incubação, substitua os supernacantes por dois mililitros de meio de diferenciação miogênica suplementado com doxiciclina por poço e devolva a placa à incubadora de cultura celular por mais 10 dias.

Ao final da incubação, substitua os supernacantes por dois mililitros de meio de junção neuromuscular por poço e devolva a placa à incubadora de cultura celular por 30 dias. Ao final da incubação, visualize as junções neuromusculares diferenciadas por microscopia invertida. Para desencadear as contrações do miotube, adicione 25 cloreto de cálcio milimila a cada poço de células de junção neuromusculares diferenciadas.

E dentro de um a dois minutos de tratamento, coloque a placa no palco de um microscópio invertido. Usando microscopia de células vivas, grave um filme da contração do miotube por 20 segundos. No final da gravação, adicione 300 nanogramas por mililitro de curare ao meio de cultura e grave o filme por mais 20 segundos antes de abrir o arquivo do filme em um programa de análise de vetores de movimento apropriado para análise.

A coloração imunofluorescente dos vasos sinápticos de neurofilamento e receptores de acetilcolina pode ser realizada para identificar os neurônios. Os neurônios motores podem ser identificados pela coloração tuj 1 e ilhota 1, enquanto os miótubos pós-sinápticos podem ser identificados pela coloração da cadeia pesada de miosina. As células Schwann podem ser rotuladas com anticorpo S-100.

Nestas imagens de microscopia eletrônica de varredura, a morfologia de junções neuromusculares maduras pode ser observada com visualização clara dos terminais de axônio expandidos, axônios e fibras musculares. A microscopia eletrônica de transmissão pode ser usada para visualizar a ultra estrutura madura dos componentes neuromusculares, incluindo o terminal de axônio pré-sináptico com vesículas sináptica e a região pós-sináptica, que é separada pela fissura sináptica. Dobras juncionais marcam a junção entre o neurônio e as fibras musculares.

Aqui, terminais de axônio maduros que contêm vesículas sinápticas são mostrados. Juntas, essas características morfológicas indicam que os componentes neuromusculares foram bem induzidos e amadurecidos. A avaliação funcional das células revela que sinais de movimento de junção neuromuscular proeminentes podem ser induzidos pelo cloreto de cálcio e que essas contrações podem ser interrompidas por curare confirmando que os sinais do neurônio motor são transmitidos através da junção neuromuscular para desencadear a contração muscular.

A densidade de semeadura celular influencia a eficiência da formação do NMJ. Pode ser modificado para se adaptar ao protocolo, de acordo com os propósitos experimentais. Esta cultura de junção neuromuscular contém vários tipos de células, e esses componentes podem ser usados para estudar as interações entre essas células durante o desenvolvimento da junção neuromuscular ou em resposta a patologias específicas da doença.