Name: Neisseria meningitidis Infecção de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Derivadas do Endotélio Cerebral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a usar células endoteliais cerebrais derivadas de iPSC para estudar interações patógeno-hospedeiro na barreira hematoencefálica com Neisseria meningitidis. Este modelo humano avança a compreensão de infecções do SNC.

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O L.M.E. é apoiado pelo programa de treinamento em pesquisa da DFG GRK2157 intitulado "3D Tissue Models for Studying Microbial Infections by Human Pathogens" concedido a A. S-U. B.J.K. é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da Fundação Alexander von Humboldt. Além disso, agradecemos a Lena Wolter por sua assistência técnica na geração dos iPSC-BECs na cultura.

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<li>Kim, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+induction+of+Snail1+contributes+to+blood-brain+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A modelagem de BECs e do BBB tem tido desafios, pois as CEBs humanas primárias e imortalizadas, in vitro, tendem a carecer de fenótipos de barreira robustos. O advento das tecnologias de células-tronco humanas permitiu a geração de células BEC-like derivadas de iPSC que retêm fenótipos BBB característicos esperados, como marcadores endoteliais, expressão de tight junction, propriedades de barreira, resposta a outros tipos de células do SNC e transportadores funcionais de efluxo 12,13,14,15, </s...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1 
Sarah F. Hathcock2 
Alexandra Schubert-Unkmeir1 
Brandon J. Kim1,2 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of W&#252;rzburg 
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61400">Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

A barreira hematoencefálica (BHE) e a barreira meníngea sangue-LCR (mBCSFB) são barreiras celulares extremamente apertadas que separam a circulação do sistema nervoso central (SNC) e são compostas principalmente por células endoteliais cerebrais (CEBs) altamente especializadas1,2. Juntas, as CEBs mantêm a homeostase cerebral adequada, regulando nutrientes e resíduos dentro e fora do cérebro, enquanto excluem muitas toxinas, drogas e patógenos 1,2. A meningite bacteriana ocorre quando as bactérias transmitidas pelo sangue são capazes de interagir e penetrar na barreira formada pelas CEBs e causar inflamação. Neisseria meningitidis (Nm, meningococo) é uma bactéria Gram-negativa que coloniza a nasofaringe de 10% a 40% dos indivíduos saudáveis, mas em alguns casos pode causar doença sistêmica grave3. Nos indivíduos afetados, o Nm pode ter acesso à corrente sanguínea, onde pode causar púrpura fulminante, bem como penetrar nas CEBs que têm acesso ao SNC, causando meningite3. O Nm é uma das principais causas de meningite bacteriana em todo o mundo e, apesar dos esforços de vacinação, ainda é uma causa primária de meningite4. A intervenção médica moderna, como o tratamento com antibióticos, tem tornado essas condições sobreviventes, no entanto, aqueles afetados com meningite muitas vezes ficam com danos neurológicos permanentes 5,6.
Estudos prévios identificaram fatores bacterianos e sinalização do hospedeiro que contribuem para as interações Nm-BEC 7,8,9,10,11. As adesinas e invasinas identificadas, como a proteína de opacidade Opc e pili tipo IV, bem como receptores como CD147, têm sido conduzidas em vários modelos de BEC in vitro, porém esses modelos carecem de muitas propriedades definidoras de BHE7,9,11,12. A compreensão completa das interações Nm-BEC permanece indefinida devido parcialmente à incapacidade de utilizar modelos in vivo, proteção vacinal incompleta e falta de modelos BEC humanos robustos in vitro.
A modelagem de hBECs in vitro tem sido um desafio devido às propriedades únicas das CEBs. Comparadas às células endoteliais periféricas, as CEBs apresentam uma série de fenótipos que potencializam suas propriedades de barreira, como a alta resistência elétrica transendotelial (TEER) devido às tight junctions complexas12. Uma vez removidas do microambiente cerebral, as CEBs perdem rapidamente suas propriedades de barreira, limitando a utilidade de modelos primários ou imortalizados in vitro, que formam apenas uma barreira fraca12,13. A combinação da especificidade humana de infecções por Nm, a falta de modelos robustos in vivo e os desafios para modelar as CEBs humanas in vitro criam a necessidade de melhores modelos para entender a complexa interação patógeno-hospedeiro entre Nm e CEBs. Recentemente, utilizando tecnologias modelo de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC), células semelhantes a ECEC têm sido derivadas de iPSCs que melhor mimetizam as CEBs in vivo12,13,14,15. As iPSC-BECs são de origem humana, facilmente escaláveis e possuem fenótipos BEC esperados em comparação com suas contrapartes primárias ou imortalizadas12,13,14,15. Além disso, nós e outros demonstramos que as iPSC-BECs são úteis para modelar várias doenças do SNC, como interação patógeno-hospedeiro, doença de Huntington e deficiência de MCT8 que causa a síndrome de Allan-Hurndon-Dudley16,17,18,19,20,21. Aqui, demonstramos como derivar iPSC-BECs de fontes renováveis de iPSC e a infecção de iPSC-BECs com Nm levando à ativação da resposta imune inata. Acreditamos que este modelo é útil para interrogar a interação patógeno-hospedeiro que não pode ser recapitulada em outros modelos in vitro e é especialmente útil quando examinamos interações com patógenos humanos específicos, como o Nm.

<table><tbody><tr><td>Accutase (1x)</td> <td>Sigma</td><td>A6964</td><td>Reagente de dissociação de células enzimáticas</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Ácido all-trans retinóico (RA)</td> <td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 (PECAM-1)</td> <td>Thermo Scientific (Labvision)</td> <td>RB-10333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen</td><td>4C3C2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Glut-1</td><td>Thermo Scientific (Labvision)</td> <td>SPM498 (MA5-11315)</td><td></td></tr> <tr><td>Anti-Occludin</td><td>Invitrogen</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VE-caderina</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52751</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>33-9100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Proteose Peptona</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoetanol</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td> <td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Placas e frascos de cultura de células</td><td>Centrífuga Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Heraeus Megafuge 1.0R)</td><td>Gabinete de</td> biossegurança Thermo Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Classe II</td> Incubadora de CO2 <td>Nuaire</td><td>NU-437-400E</td><td></td></tr><tr><td>(Incubadora com camisa de ar DHD Autoflow CO2)</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Columbia ager + 5% de sangue de ovelha</td><td>Biomerieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwell filtros de poliéster (12 ou 24 poços)</td> <td>Corning</td><td>3460, 3470</td><td></td></tr><tr><td>D (+) -Glicose</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td> <td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de Volt-Ohm Epitelial (Millicell ERS-2) com eletrodo STX</td><td>Merck (Millipore)</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3</td><td>ROTH</td><td>5632.1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência (Eclipse Ti)</td><td>Hemacitômetro Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Neubauer)</td> <td>A. Hartenstein</td><td>ZK06</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos básicos humanos (bFGF)</td> <td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Soro Endotelial Humano Meio Livre (hESFM)</td> <td>Gibco</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido (Wilovert)</td> <td>Hund (Will Wetzlar)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>iPS (IMR90) -4 células</td><td>WiCell</td><td></td><td></td></tr><tr>Suplemento <td></td><td></td><td>Kellogg's</td><td>Para preparar 110 ml de suplemento Kellogg's, prepare 100 ml de 4 g/ml de glicose, 0,1 g/ml de glutamina e 0,2 mg/ml de pirofosfato de tiamina e 10 ml de 5 mg/ml de Fe(NO3)3 e combine as soluções. Filtre, esterilize e armazene aliquotados a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Reposição de soro knockout (KOSR)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (GlutaMAX)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>kit de síntese de cDNA</td></tr><tr><td>Matriz Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ROTH</td><td>4627,5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ROTH</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas (Research Plus)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>ROTH</td><td>6329</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de RNA NucleoSpin</td> Kit <td>de isolamento de RNA</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td></tr><tr><td>Pipeta boy (Accu-Jet Pro)</td><td>Marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro derivado de plasma pobre em plaquetas, bovino (PDS)</td><td>Fisher</td><td>50-443-029</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td>qPCR master mix</td></tr><tr><td>qPCR filme qPCR (Filme Adesivo Óptico MicroAmp)</td>Placas <td>4211971</td><td></td>qPCR da <td>Applied Biosystems</td></tr><tr><td>(MicroAmp Fast 96-well)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de ROCK, dicloridrato Y27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR termociclador (StepOnePlus)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StemFlex meio basal + suplemento 50x StemFlex</td><td>Gibco</td><td>A3349401</td><td>Meio de manutenção de células-tronco</td></tr><tr><td>Rotor de balde oscilante (Heraeus #2704)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução do azul do tripano do pirofosfato</td><td>Sigma</td><td>C8754-5G</td><td></td>da tiamina</tr><tr><td>, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Não-enzimático da dissociação da pilha de Versene</td><td></td> <td>Gibco</td><td>15040-033</td> (EDTA)</tr></tbody></table>

neisseria meningitidis infecção de células-tronco pluripotentes induzidas derivadas do endotélio cerebral

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

A meningite meningocócica é uma infecção com risco de vida que ocorre quando Neisseria meningitidis (meningococo , Nm) pode obter acesso ao sistema nervoso central (SNC) penetrando em células endoteliais cerebrais (CEBs) altamente especializadas. Como Nm é um patógeno humano-específico, a falta de sistemas modelo in vivo robustos torna o estudo das interações patógeno-hospedeiro entre Nm e CEBs desafiador e estabelece a necessidade de um modelo baseado em humanos que imite BECs nativas. As CEBs possuem propriedades de barreira mais apertadas quando comparadas às células endoteliais periféricas, caracterizadas por tight junctions complexas e elevada resistência elétrica transendotelial (TEER). No entanto, muitos modelos in vitro , como as CEBs primárias e as CEBs imortalizadas, não possuem ou perdem rapidamente suas propriedades de barreira após a remoção do microambiente neural nativo. Avanços recentes em tecnologias de células-tronco humanas desenvolveram métodos para derivar células endoteliais cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) que melhor fenocopiam as CEBs quando comparadas a outros modelos humanos in vitro . O uso de BECs derivadas de iPSC (iPSC-BECs) para modelar a interação Nm-BEC tem o benefício de usar células humanas que possuem propriedades de barreira BEC e pode ser usado para examinar a destruição de barreira, ativação imune inata e interação bacteriana. Aqui demonstramos como derivar iPSC-BECs de iPSCs, além de preparação bacteriana, infecção e coleta de amostras para análise.

O protocolo aqui descrito é adaptado de Stebbins e col. e destaca o processo de diferenciação de iPSCs em células endoteliais cerebrais que possuem propriedades BBB, e como utilizar esse modelo para estudos de infecção usando iPSC-BECs com Nm19,22. As iPSC-BECs, quando diferenciadas adequadamente, exibem propriedades de barreira apertadas medidas pelo TEER que são frequentemente maiores que 2000 Ω·cm2, e expressam marcadores endoteliais como VE-caderin...

O protocolo aqui descrito destaca as principais etapas na diferenciação de células endoteliais cerebrais derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas, na preparação de Neisseria meningitidis para infecção e na coleta de amostras para outras análises moleculares.

Neisseria meningitidis Infecção de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Derivadas do Endotélio Cerebral

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central ...

Este protocolo demonstra o uso de células endoteliais semelhantes ao cérebro derivadas de iPSC para examinar as interações do patógeno hospedeiro nas barreiras hematoencefálicas, como as barreiras meníngeas do sangue e do LCR, em um modelo que pode imitar melhor as células endoteliais cerebrais in vivo. O exame in vitro das propriedades da barreira das células endoteliais cerebrais e das interações com patógenos humanos específicos pode ser desafiador devido a limitações na modelagem. As células endoteliais cerebrais derivadas de iPSC são particularmente úteis para essas aplicações, pois possuem fenótipos de barreira superiores e são de origem humana.Manter as células-tronco pluripotentes induzidas, ou iPSCs, a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em placas de seis poços com dois mililitros de meio de manutenção de células-tronco. Para passar as células, aspirar o meio de um poço que não seja confluente e adicionar um mililitro de reagente de dissociação celular não enzimática. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por sete minutos.Enquanto isso, substitua a solução de gel de matriz em uma nova placa de seis poços por dois mililitros de meio de manutenção de células-

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este método descreve como isolar e imortalizar células endoteliais microvasculares de cérebro de rato. Descreve-se um protocolo de passo-a-passo a partir da homogeneização do tecido cerebral, as etapas de digestão, a semeadura e imortalização das células. Normalmente, leva cerca de cinco semanas, para se obter uma homogeneidade, linha celular imortalizada microvascular endotelial.

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sangue Cérebro Modelo Barreira

Este vídeo demonstra um protocolo para induzir a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas em células endoteliais cerebrais.

Geração de células endoteliais cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas

Este vídeo demonstra um processo de várias etapas para diferenciar iPSCs humanas em células endoteliais microvasculares cerebrais. As células diferenciadas resultantes imitam de perto as células endoteliais microvasculares cerebrais, caracterizadas por junções apertadas, tornando-as ideais para pesquisas sobre doenças cerebrais.

Diferenciando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em células endoteliais microvasculares cerebrais

Fonte: Parajuli, B., et.al. Transplante de microglia derivada de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos no cérebro de camundongos imunocompetentes por via transnasal não invasiva. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra o transplante transnasal de células da microglia humana derivada de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSMG) em um cérebro de camundongo. A hialuronidase é aplicada nas narinas de um camundongo com depleção microglial para aumentar a permeabilidade. A...

Transplante Transnasal de Células Microgliais Humanas Derivadas de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas no Cérebro de Camundongos

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

Segmentação células cerebrais residente linhagem-reprogramação direta oferece novas perspectivas de reparação do cérebro. Aqui nós descrevemos um protocolo de como preparar culturas enriquecido para pericitos cerebrais residente do córtex cerebral humano adulto e convertê-las em neurônios induzidos pela expressão mediada por retrovírus de fatores de transcrição Sox2 e Ascl1.

Lineage-reprogramação de células pericyte derivados do Adulto Cérebro Humano em neurônios induzidos

Aqui, descrevemos um método para induzir a meningite meningocócica através de uma via intracisternal de infecção em camundongos adultos. Apresentamos um protocolo passo a passo de infecção meningocócica desde a preparação do inóculo para a infecção intracisternal; registre então a sobrevivência animal e avalie as cargas bacterianas em tecidos do murine.

Indução meningocócica meningite sorogrupo C em camundongos via parto intracisternal

Descrevemos uma injeção intracisternal que emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada no crânio, eliminando assim o risco de dano ao parênquima subjacente. A abordagem pode ser usada para mapeamento do destino genético e manipulações de células leptomeningeais e para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano.

Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal

Este protocolo detalha um método adaptado para derivar, expandir e criopreservar células microvasculares microvasculares cerebrais obtidas pela diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e para estudar as propriedades da barreira cerebral no sangue em um modelo ex vivo.

Derivação, Expansão, Criopreservação e Caracterização de Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

O protocolo aqui apresentado permite o transplante de microglia humana derivada de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSMG) no cérebro através de uma rota transnasal em camundongos imunocompetentes. O método de preparação e transplante transnasal das células e a administração da mistura de citocinas para a manutenção do iPSMG é mostrado.

Transplante de Microglia Pluripotente Pluripotente Induzido Humano em Microglia De camundongos imunocompetentes através da Rota Transnasal Não Invasiva

Aqui, descrevemos um protocolo, o método de cultura de células endoteliais estendidas (EECM), que permite a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células cerebrais microvasculares semelhantes a células endoteliais (BMEC). Essas células apresentam expressão de moléculas de adesão de células endoteliais e são, portanto, um modelo de barreira hematoencefálica humana adequado para estudar interações de células imunes in vitro.

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Células Semelhantes a Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais com Fenótipo Imune Maduro;

Aprenda a usar células endoteliais cerebrais derivadas de iPSC para estudar interações patógeno-hospedeiro na barreira hematoencefálica com Neisseria meningitidis. Este modelo humano avança a compreensão de infecções do SNC.

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