Entrega In Vitro e In Vivo de Hipertermia de Nanopartículas Magnéticas usando um Sistema de Entrega Personalizado
2 de julho de 2020
Este protocolo apresenta técnicas e metodologia necessárias para a entrega precisa de hipertermia de nanopartículas magnéticas usando um sofisticado sistema de entrega e monitoramento.
Este método é significativo porque fornece a maneira mais robusta e reprodutível de fornecer tratamento de hipertermia de nanopartículas magnéticas em modelos pré-clínicos. Esta técnica permite a entrega precisa e consistente da hipertermia de nanopartículas, monitorando e controlando com precisão o ambiente local, a fisiologia animal e a dose térmica. Ao tentar este protocolo, lembre-se de que o aquecimento de nanopartículas deve permanecer confinado ao tecido alvo.
É essencial o uso de termometria abundante e apropriada para garantir a reprodutibilidade e a segurança. 24 horas após o plaqueamento, as células de melanoma murino B16 F10 adicionam nanopartículas magnéticas a uma concentração final de três miligramas de íons por mililitro. Certifique-se de que as nanopartículas sejam distribuídas uniformemente por todo o poço, criando uma solução de estoque de meios e nanopartículas magnéticas com antecedência.
48 horas após adicionar as nanopartículas, adicione 0,5 mililitros de tripsina a cada poço que está sendo tratado e gire suavemente a placa. Use um microscópio para verificar se as células estão separadas. Em seguida, adicione um mililitro de meio a cada poço e colete todas as células em tubos de 1,5 mililitro usando um tubo separado claramente rotulado para cada poço.
Gire os tubos a 60G por dois a três minutos para pellet as células. Em seguida, coloque os tubos no espaçador cheios de água dentro da bobina. Defina a temperatura do banho-maria para manter o meio e o palete de células a 37 graus Celsius.
Configure sondas de temperatura de fibra óptica separadas para monitorar a temperatura dentro do tubo e do banho-maria. Ligue o chiller e verifique se o refrigerante está fluindo pela serpentina. Em seguida, ligue a fonte de alimentação e ajuste a porcentagem do máximo para o campo desejado.
Opere a bobina solenóide de 14 voltas alimentada por um gerador de 10 quilowatts a 165 quilohertz e 23.87 quiloamperes por metro. Trate as células até que uma dose térmica de protocolo previamente determinada seja atingida. Após o tratamento, ressuspenda as células peletizadas no meio dentro dos tubos e recoloque-as em novas placas de seis poços claramente marcadas.
Depois de anestesiar o camundongo, limpe o tumor com um lenço umedecido com álcool. Injete as nanopartículas magnéticas no tumor três horas antes do tratamento com AMF. Após três horas, anestesiar novamente o rato e verificar a falta de resposta aos reflexos de endireitamento.
Remova a etiqueta auricular ou qualquer outro objeto de metal do mouse e coloque suavemente uma sonda de temperatura de fibra óptica lubrificada em seu reto. Coloque o cateter no tumor. Remova a agulha.
Em seguida, corte o cateter para que ele não saia muito do tumor. Insira uma sonda de temperatura de fibra óptica de três sensores no cateter, que protegerá os sensores. Prenda a sonda retal e intratumoral na cauda do animal.
Coloque o mouse em um tubo de 50 mililitros que deve ter um orifício perto da cabeça onde a anestesia pode ser conectada e administrada. Coloque o tubo dentro da configuração da bobina e reconecte a anestesia. Coloque uma sonda de temperatura de fibra óptica frouxamente no tubo para medir a temperatura do ambiente.
Em seguida, ligue o chiller e certifique-se de que o refrigerante está circulando. Verifique se o software do computador está exibindo as várias temperaturas e comece a gravar para permitir que um cálculo de CEM43 seja exibido em tempo real, onde a dose necessária de CEM43 deveria ter sido previamente determinada. Ligue o ímã em uma porcentagem de baixa potência e certifique-se de que as sondas de temperatura de fibra óptica estejam registrando as mudanças de temperatura.
Em suma, que a temperatura central do animal permaneça em 38 graus Celsius, regulando-a com a jaqueta de ar condicionado. Ajuste a força do campo magnético alterando a potência que controla o nível de temperatura no tumor. Desligue o AMF assim que a dose desejada for alcançada.
Remova o tubo da bobina e remova o mouse do tubo. Em seguida, desligue o chiller. Extraia as sondas e cateteres e, se necessário, marque o animal com uma nova etiqueta de metal para a orelha.
Monitore o mouse durante a recuperação da anestesia, garantindo que ele retome o comportamento normal e que não haja complicações. Para hipotermia in vivo, é essencial colocar o maior número possível de sondas de temperatura de fibra óptica em locais estratégicos para avaliação de eficácia e segurança em tempo real. Essas sondas possibilitam registrar a temperatura durante todo o experimento, permitindo dosimetria e histórico térmico precisos.
As curvas geradas durante um experimento in vivo são mostradas aqui, destacando a capacidade de monitorar de perto a temperatura e ajustar o sistema para manter a temperatura do tumor dentro da faixa desejada. Os gráficos vulcânicos mostram genes diferenciais expressos após o tratamento de hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro e in vivo, demonstrando como as técnicas moleculares podem ser usadas para monitorar os efeitos da hipertermia. O monitoramento preciso da temperatura do tumor, da temperatura central dos animais e da dose térmica é necessário para a administração consistente do tratamento.
Após a hipertermia, diferentes análises podem ser realizadas para entender o efeito e o mecanismo do tratamento. E outras terapias podem ser implementadas para um maior efeito terapêutico.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta as técnicas e a metodologia necessárias para a administração precisa da hipertermia por nanopartículas magnéticas utilizando um sistema sofisticado de entrega e monitoramento. Este método é significativo porque fornece a maneira mais robusta e reprodutível de aplicar o tratamento de hipertermia por nanopartículas magnéticas em modelos pré-clínicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biotecnologia
- Terapia térmica
Antecedentes
- Entrega precisa e consistente da hipertermia com nanopartículas.
- Monitoramento e controle precisos do ambiente local e da fisiologia animal.
- Importância da termometria para reprodutibilidade e segurança.
- Aplicação em modelos pré-clínicos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para a entrega da hipertermia por nanopartículas magnéticas.
- Garantir segurança e reprodutibilidade no tratamento.
- Confinar o aquecimento ao tecido-alvo.
Métodos Utilizados
- Preparação de nanopartículas magnéticas numa concentração de três miligramas de íon por mililitro.
- Distribuição uniforme de nanopartículas em poços de cultura celular.
- Uso de uma solução estoque de meio e nanopartículas.
- Monitoramento da dose térmica durante o tratamento.
Resultados Principais
- Entrega bem-sucedida de hipertermia com nanopartículas magnéticas.
- Aquecimento consistente confinado aos tecidos-alvo.
- Reprodutibilidade dos resultados entre ensaios.
- Monitoramento eficaz do ambiente local e da fisiologia animal.
Conclusões
- O protocolo oferece um método robusto para hipertermia com nanopartículas.
- Garante segurança e eficácia em aplicações pré-clínicas.
- Destaca a importância da termometria no tratamento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A hipertermia por nanopartículas magnéticas (mNPH) permite uma dosagem térmica precisa em modelos pré-clínicos de oncologia, apoiando a validação de alvos por meio da ablação controlada de tumores e efeitos imunomoduladores subletais. O monitoramento em tempo real e em múltiplos pontos da temperatura pelo sistema, juntamente com a dosimetria baseada em CEM43, fornece resultados quantitativos e reprodutíveis, essenciais para a redução de riscos mecanicistas e para a confiabilidade preditiva das janelas terapêuticas. Essa capacidade conecta achados in vitro à eficácia in vivo, orientando decisões de avançar ou interromper projetos em estágios iniciais de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a aplicação de doses térmicas definidas para modular o microambiente tumoral e as respostas imunológicas.
- Valor Operacional: Confina o aquecimento ao tecido-alvo por meio de termometria com fibra óptica, reduzindo efeitos fora do alvo e melhorando a especificidade do ensaio.
- Valor Preditivo: Quantifica os efeitos biológicos ao longo de gradientes tempo-temperatura, apoiando a modelagem de resposta à dose para a priorização de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados (por exemplo, células de melanoma B16 F10) com captação padronizada de nanopartículas para resposta consistente de hipertermia.
- Valor Operacional: Utiliza soluções estoque e protocolos de distribuição uniforme para garantir reprodutibilidade entre poços e placas.
- Prontidão para Ensaios: Gera dados volumétricos de dose térmica (CEM43) compatíveis com triagem de alto conteúdo e análises posteriores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite a transição contínua de culturas celulares in vitro para modelos de tumor in vivo utilizando formulações idênticas de nanopartículas e monitoramento.
- Relevância para a Doença: Aplica-se a modelos de melanoma murino, permitindo a avaliação de alterações na expressão gênica induzidas por hipertermia (por exemplo, gráficos de vulcão) como possíveis biomarcadores.
- Avanço com Ajuste de Risco: O rastreamento em tempo real da dose térmica permite escalonamento controlado quanto à segurança e redução de riscos mecanicistas antes de estudos com terapias combinadas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Posiciona o mNPH como uma tecnologia habilitadora entre a validação de alvo e a otimização de compostos líderes, onde a precisão da dose térmica orienta a triagem fenotípica e os estudos de mecanismo de ação.
- Biologia da Descoberta: Apoia a elucidação de vias ao associar estresse térmico à expressão diferencial de genes e modulação imunológica.
- Triagem: Fornece saídas térmicas quantitativas e reprodutíveis (por exemplo, CEM43) para comparar formulações de nanopartículas e parâmetros de campo.
- Análises: Oferece curvas de temperatura em tempo real e perfis moleculares pós-tratamento (por exemplo, gráficos de vulcão) para análise comparativa de condições.
- Pesquisa Translacional: Mantém consistência na dosagem e monitoramento de nanopartículas de células a animais, apoiando a continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: O design do sistema permite conversão rápida entre configurações ex vivo, in vitro e in vivo, maximizando a utilização da plataforma em diversos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao correlacionar doses térmicas precisas com resultados moleculares.
- Valor Operacional: Padroniza a aplicação de hipertermia por meio de bobinas solenoides calibradas, chillers e sondas de fibra óptica em diferentes locais.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao definir janelas térmicas eficazes que equilibram eficácia e segurança tecidual.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos nanoterapêuticos com base em perfis reprodutíveis de ablação térmica.
Considerações sobre a Implementação
- Exige especialização na preparação de nanopartículas, dosimetria térmica e manejo de animais para procedimentos in vivo.
- Requer instrumentação especializada, incluindo geradores de 10 kW, bobinas solenoides de 14 voltas, chillers e monitoramento de temperatura por fibra óptica multiponto.
- Exige padronização entre equipes quanto à concentração de nanopartículas (3 mg íon/mL), protocolos de distribuição e métodos de cálculo de CEM43.
- Inclui considerações de adaptação para diferentes modelos de tumor, construtos de nanopartículas e parâmetros de campo (165 kHz, 23,87 kA/m).
- Envolve limitações práticas, como a necessidade de termometria extensiva para prevenir aquecimento fora do alvo e garantir a regulação da temperatura central dos animais.
