Name: Entrega In Vitro e In Vivo de Hipertermia de Nanopartículas Magnéticas usando um Sistema de Entrega Personalizado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprenda a entregar hipertermia de nanopartículas magnéticas em modelos pré-clínicos com precisão e segurança. Este método robusto permite monitorar a dose térmica e confinar o aquecimento ao tecido alvo.

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O estudo foi financiado por números de subvenção: NCI P30 CA023108 e NCI U54 CA151662.

O Dartmouth College Animal Care and Use Program é credenciado pela American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) e adere a todas as diretrizes e regulamentos da UDSA e do NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Todos os estudos in vivo foram aprovados pelo Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). O procedimento de eutanásia adere às Diretrizes da AVMA de 2020 para a Eutanásia de Animais.
1. Instrumentação/concepção do sistema
<ol><li>Projete a antena AMF personalizada (bobina) para ser um circuito fechado, escolhendo formas para criar o campo magnético desejado. Use fórmulas e características de indutância da escolha do gerador de energia para projetar bobinas compatíveis para gerar o campo desejado. Use diferentes projetos para experimentos in vitro e in vivo.</li>
	<li>Certifique-se de que a indutância da antena AMF esteja dentro do alcance aceitável do gerador de energia. Adicione ou subtraia capacitores para combinar (sintonizar) a antena com o gerador de energia.</li>
	<li>Para experimentos in vitro, projete uma bobina helicoidal de 14 voltas, diâmetro interno de 2 cm e comprimento de 14 cm, que pode conter tubos de 1,5 mL, permitindo o tratamento de múltiplas amostras simultaneamente. Isole a bobina com um polímero de vinil e use um espaçador de poliestireno para separar a bobina dos tubos. Detalhes da especificação e considerações do projeto estão presentes no Arquivo Suplementar 1.</li>
	<li>Para experimentos in vivo, adquira uma bobina helicoidal de corpo inteiro personalizada de um fabricante com informações de design proprietárias. Use tubos quadrados de 8 mm (pois cria um campo mais uniforme dentro do furo da bobina) e um concentrador na área de tratamento direcionada. Faça o concentrador 5,0 cm de comprimento, com um total de 5 voltas resultando em um diâmetro interno de 3,6 cm, 5,2 cm de diâmetro externo e tenha sua localização na área de tratamento alvo. Envolva a bobina com um invólucro de policarbonato.</li>
	<li>Use um gerador AMF com potência e frequência ajustáveis, avaliado em 10 kW ou mais como fonte de energia. A indutância corresponde à fonte de energia e às antenas/bobinas para uma faixa de 0,62 a 1,18 μHenries (μH), permitindo frequências que variam entre 30-300 kHz. Arrefecer o gerador utilizando água reciclada através de uma bomba centrífuga de impulso, pressão regulada para 50 psi.</li>
	<li>Resfrie as bobinas com um resfriador de capacidade de resfriamento de 5,6 toneladas que bombeia 25% de fluido de transferência de calor à base de etilenoglicol diluído com água através da antena AMF. Ajuste a temperatura do resfriador para que a antena não aqueça ou resfrie a amostra.</li>
	<li>Para a contenção do animal, construa um suporte tubular que possa ser suspenso no centro da bobina com um espaço de ar de 0,5 cm entre o suporte e a superfície da bobina. Conecte uma bomba de ar condicionado ajustável que circula o ar através do invólucro ao redor da bobina e configure-a para manter uma temperatura central normal do animal. Conecte a máquina de anestesia ao suporte tubular do animal perto da cabeça do animal para garantir a entrega adequada da anestesia.</li>
	<li>Para a contenção celular, crie um aparelho que circule a água de um banho-maria através do espaçador onde os tubos são colocados. Ajuste a temperatura deste banho-maria de modo a que os tubos sejam rodeados por água a 37 °C.</li>
	<li>Use sondas de fibra óptica para monitorar as temperaturas dentro do tumor, o núcleo do animal e o ambiente animal ou para estudos in vitro, monitorando a temperatura da pelota celular e a água ao redor dos tubos.</li>
	<li>Use nanopartículas magnéticas de óxido de ferro com 100 nm de tamanho para todos os experimentos. NOTA: A concentração e a taxa de absorção específica (SAR) são duas características que devem ser consideradas na escolha das nanopartículas, pois afetam diretamente o possível aquecimento e a dose térmica18.</li>
</ol>2. Hipertermia in vitro
<ol><li>Cultura de células de melanoma murino B16F10 em meio RPMI com 10% de FBS e 1% de Pen/estreptococo. Placa 150, 000 células/poço em placas de 6 poços, com 2 mL de meio completo.</li>
	<li>Determinar o tratamento adequado para cada poço, ou seja, células sem mNPs e sem FMA, células com mNPs e sem FMA, células sem mNPs e FMA, células com mNPs e FMA. NOTA: Além disso, certifique-se de que existem controlos adequados se combinar hipertermia com outra terapêutica. O AMF é realizado em um laboratório de bancada de pesquisa padrão adaptado com os recursos de energia e resfriamento necessários.</li>
	<li>24 h após o revestimento, adicionar mNPs aos poços apropriados, conforme determinado na etapa anterior. Adicionar mNPs a uma concentração de 3 mg de ferro/mL. Certifique-se de que os mNPs estejam distribuídos por todo o poço, seja criando uma solução de mídia de estoque/mNP (removendo a mídia antiga, adicionando essa solução) ou adicionando as placas de rodopio direta e suave para distribuição homogênea.</li>
	<li>Iniciar o tratamento, 48 h após a adição de mNPs, quando os poços estiverem ~80% confluentes, removendo o meio e lavando os poços com meio fresco. Remova a mídia.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de tripsina a cada poço a ser tratado e gire suavemente. Use um microscópio para verificar se as células estão separadas.</li>
	<li>Adicione 1 mL de meio a cada poço para coletar as células em tubos de 1,5 mL. Colete todas as células do poço (~1 x 106 células). Use um tubo separado claramente rotulado para cada poço.</li>
	<li>Tubos de rotação a 60 x g por 2-3 min para permitir que as células sejam pellet. Retenha o pellet na mídia.</li>
	<li>Coloque os tubos no espaçador cheios de água dentro da bobina. Regule a temperatura do banho-maria de modo a que o meio e o pellet celular sejam mantidos a 37 °C. Monitore a temperatura dentro do tubo e do banho de água usando sondas de temperatura de fibra óptica separadas.</li>
	<li>Ligue o chiller, verifique se o refrigerante está fluindo através da bobina. Ligue a fonte de alimentação e ajuste a porcentagem do máximo para o campo desejado. Operar a bobina solenoide de 14 voltas, alimentada por gerador de 10 kW, a 165 kHz e 23,87 kA/m (300 Oe).</li>
	<li>Coloque uma sonda de temperatura de fibra óptica separada em um dos tubos. Trate as células até a dose térmica do protocolo previamente determinado. Um exemplo é 30 min a 43 °C (CEM43 de 30).</li>
	<li>Ressuspeite as células no meio que está em seus tubos e re-prato em novas placas de 6 poços. Rotule claramente as novas placas. O objetivo é re-placa todas as células coletadas (~ 1 x 106 células). NOTA: Novas placas de 6 poços devem ser usadas para garantir que as células que estão sendo cultivadas recebam tratamento. Se as placas antigas forem usadas, ainda pode haver células deixadas nas placas que não foram tripsinizadas com sucesso.</li>
	<li>Se necessário, para o próximo procedimento experimental, lise as células para análise de RNA ou expressão de proteínas.</li>
</ol>3. Hipertermia in vivo
<ol><li>Cultura celular e inoculação<ol><li>Cultura de células de melanoma murino B16F10 em meio RPMI com 10% de FBS e 1% de Pen/estreptococo. Use pratos / pratos que fornecerão células suficientes para a inoculação do número desejado de animais. Por exemplo, pratos de 10, 100 mm, banhados a 100.000 células, serão confluentes com células suficientes para 20 injeções de camundongos dentro de 48 h.</li>
		<li>Tripsinize as células e colete usando mídia RPMI pura (sem FBS ou caneta/estreptococo).</li>
		<li>Conte células e crie uma solução para a concentração desejada de células, com base no volume de inoculação e no número de camundongos.</li>
		<li>Anestesiar camundongos C57Bl/6 fêmeas de 6 semanas de idade usando isoflurano vaporizado e oxigênio. Coloque os animais em uma caixa de plexiglass com 5% de isoflurano e 95% de oxigênio até induzir. Uma vez induzido, remova o animal e use um cone facial a 2% de isoflurano para completar as etapas 3.1.5-3.1.7 e 3.3.3-3.3.6. NOTA: Para anestesia durante o tratamento, use uma contenção de anestesia embutida. Siga os protocolos institucionais padrão para anestesia de camundongos. Antes da experimentação animal, assegure a aprovação apropriada da IACUC. Após a anestesia, devolva o animal à gaiola e monitore a recuperação para garantir que não haja complicações.</li>
		<li>Verifique a falta de resposta aos reflexos de endireitamento.</li>
		<li>Raspe o flanco direito usando um barbeador elétrico.</li>
		<li>Limpe a área de injeção com um toalhete com álcool. Injetar 1-2 x 106 células, utilizando uma seringa de vidro de 100 μL com uma agulha de 28 G, dispersa em 50 μL de meio intradérmico no flanco direito raspado de anestesiado.</li>
	</ol></li>
	<li>Crescimento tumoral/Injeção de nanopartículas<ol><li>Meça tumores em 3 dimensões usando paquímetros (comprimento, largura e profundidade) e calcule os volumes por (comprimento x largura x profundidade x π)/6.</li>
		<li>Quando os volumes tumorais atingirem 120 mm 3 (+/- 20 mm3), coloque os animais em estudo. Projetar o estudo, garantindo que haja grupos de controle e tratamento apropriados, incluindo coortes de terapia combinada (ou seja, controle, mNPH, radiação e a combinação).</li>
		<li>Anestesiar ratinhos que irão receber mNPs, conforme descrito no ponto 3.1.4.</li>
		<li>Limpe a área com um toalhete com álcool. Injete mNPs no tumor 3 h antes do tratamento com FMA. Injete um volume tal que a dose seja de 7,5 mg de ferro/cm3 de tumor. NOTA: Dados não publicados do laboratório sugerem que a captação máxima de mNP ocorre em 3-6 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamento de FMA<ol><li>Anestesiar o mouse e colocar em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura central.</li>
		<li>Verifique a falta de resposta aos reflexos de endireitamento. Remova a marca auricular ou quaisquer outros objetos de metal no mouse.</li>
		<li>Coloque suavemente uma sonda de temperatura de fibra óptica lubrificada no reto do mouse.</li>
		<li>Coloque um cateter no tumor, removendo a agulha. Corte o cateter de tal forma que ele não saia muito do tumor. NOTA: Os cateteres de temperatura de fibra óptica são colocados e removidos enquanto os ratos estão sob anestesia geral, ou seja, os cateteres só estão no lugar durante o procedimento de aquecimento do tumor. Os ratos recebem uma dose subcutânea única de um medicamento para analgesia de AINEs, cetoprofeno (5 mg / kg), no momento do procedimento. Não observamos desconforto ou morbidade a curto ou longo prazo associados à colocação dos cateteres.</li>
		<li>Insira uma sonda de temperatura de fibra óptica de 3 sensores no cateter. O cateter protege os sensores de sonda de temperatura de fibra óptica.</li>
		<li>Cole a sonda retal e intratumoral na cauda do animal para garantir que eles permaneçam no lugar.</li>
		<li>Coloque o rato num tubo de 50 ml, dirija-se ao fundo. O tubo deve ter um orifício perto da cabeça, onde a anestesia será conectada e entregue.</li>
		<li>Coloque o tubo dentro da bobina configurada e reconecte a anestesia.</li>
		<li>Coloque uma sonda de temperatura de fibra óptica frouxamente no tubo para medir a temperatura ambiente.</li>
		<li>Ligue o resfriador e certifique-se de que o líquido de arrefecimento está circulando.</li>
		<li>Verifique e verifique se o software do computador está exibindo as várias temperaturas e comece a gravar para permitir que um cálculo CEM43 seja exibido em tempo real. O CEM43 necessário é a dose previamente determinada. NOTA: Antes que o ímã seja ligado, certifique-se de que nenhum item de metal esteja ligado ao animal, pois eles aquecerão rapidamente. Além disso, certifique-se de que todos na sala não tenham um marcapasso e que seja seguro para eles estarem lá.</li>
		<li>Ligue o ímã em uma porcentagem de baixa potência.</li>
		<li>Certifique-se de que as sondas de temperatura de fibra óptica estão registrando as mudanças de temperatura. As temperaturas aumentarão quando o FMA for ativado à medida que o campo aumentar. Assegurar que a temperatura central do animal se mantém a 38 °C. Regule a temperatura central usando a camisa de ar condicionado.</li>
		<li>Ajuste a força do campo magnético alterando a energia no gerador, usando o mostrador de controle embutido, que por sua vez controla o nível de temperatura no tumor.</li>
		<li>Desligue o FMA uma vez que a dose desejada, conforme previamente determinado pelo usuário (por exemplo, CEM43 40), seja alcançada dentro do tumor.</li>
		<li>Uma vez que o AMF é desligado, remova o tubo da bobina.</li>
		<li>Remova o mouse do tubo, extraindo as várias sondas e cateter. Se necessário, marque o animal com uma nova marca auricular de metal.</li>
		<li>Uma vez que os tratamentos são concluídos, desligue o chiller.</li>
		<li>Recupere os animais da anestesia garantindo que não haja complicações. Monitore seu comportamento para garantir o retorno ao normal.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Chen, X., Tan, L., Liu, T., Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-Nanomaterials+for+Tumor+Microwave+Hyperthermia%3A+Design%2C+Preparation%2C+and+Application%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Micro-Nanomaterials for Tumor Microwave Hyperthermia: Design, Preparation, and Application.</a> Current Drug Delivery. 14 (3), 307-322 (2016).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O projeto e a implementação deste sistema fornecem a capacidade de conduzir experimentos precisos e reprodutíveis de hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro e in vivo. É fundamental que o sistema seja projetado de tal forma que a frequência e a intensidade do campo AMF sejam adequadamente combinadas com o tipo de nanopartícula magnética, a concentração e a localização e temperatura do tecido desejadas. Além disso, o monitoramento preciso da temperatura em tempo real é crucial para a segurança e o cálculo de uma...

A hipertermia tem sido historicamente usada na terapia do câncer, isoladamente ou em combinação com outros tratamentos. Embora tenha uma longa história de uso, o método mais vantajoso para a entrega deste tratamento ainda está sendo debatido e depende do local e localização da doença. Os métodos de entrega de hipertermia incluem micro-ondas, radiofrequência, ultrassom focalizado, laser e nanopartículas metálicas (como ouro ou óxido de ferro)1,2,3,4. Esses métodos de entrega podem levar a uma variedade de temperaturas de tratamento desde o nível da febre até centenas de graus C. O efeito biológico da hipertermia depende principalmente das temperaturas utilizadas e da duração do tratamento5. Para este manuscrito e propósito, estamos nos concentrando na hipertermia de nanopartículas magnéticas (mNPH). Este método permite mudanças de temperatura focadas, localizadas, bem monitoradas e controladas, usando nanopartículas de óxido de ferro não tóxicas, aprovadas pela FDA.
Uma armadilha de outras modalidades de hipertermia é a falta de direcionamento celular preciso; a hipertermia não tem uma razão terapêutica inerentemente alta, portanto, é necessária uma termometria e direcionamento cuidadosos6. A mNPH permite a injeção sistêmica ou intratumoral de mNPs, com o calor sendo gerado apenas onde as mNPs estão localizadas, direcionando assim o tratamento diretamente para o tumor. O mNPH pode ser eficaz quando as nanopartículas magnéticas estão localizadas dentro ou fora da célula. Para a terapia do câncer, a visão geral da mNPH é que as nanopartículas magnéticas são injetadas (intratumoral ou intravenosamente), em seguida, um campo magnético alternado é aplicado, fazendo com que os polos magnéticos das nanopartículas se realinhem constantemente, levando a um aquecimento localizado das células e tecidos associados às nanopartículas 7,8 . Ajustando o volume de nanopartículas e a frequência/intensidade do campo magnético alternado (FMA), é possível controlar cuidadosamente a temperatura gerada dentro do tecido.
Esse tratamento funciona bem em tumores que estão próximos à superfície corporal, pois tumores mais profundos requerem FMA mais forte, de modo que o risco de aquecimento por correntes parasitas aumenta9. Há evidências de hipertermia sendo utilizada clinicamente como monoterapia, no entanto, muitas vezes a hipertermia é combinada com radioterapia ou quimioterapia, levando a um efeito anticâncer mais direcionado10,11,12. Evidências clínicas de hipertermia trabalhando em combinação com radioterapia são revisadas em publicação anterior13. Nosso laboratório tem tratado com sucesso uma variedade de animais, de camundongos a porcos e cânceres caninos espontâneos, utilizando o método mNPH12,14,15. Este protocolo é projetado para aqueles interessados em investigar os efeitos do tratamento da hipertermia localizada, isoladamente ou em combinação com outras terapias.
Um dos fatores mais importantes na hipertermia é ser capaz de medir e entender, em tempo real, a dose térmica que está sendo entregue ao tecido alvo / tumoral. Uma forma normalizada de calcular e comparar a dose é através da demonstração dos minutos equivalentes cumulativos de aquecimento a 43 °C; esse algoritmo permite a comparação de doses independentes do sistema de entrega, temperaturas máximas e mínimas (dentro de uma faixa específica) e parâmetros de aquecimento/resfriamento 5,16. O cálculo CEM funciona melhor para temperaturas entre 39-57 °C5. Por exemplo, em alguns dos estudos que realizamos, escolhemos uma dose térmica de CEM43 30 (ou seja, 30 min a 43 °C). A escolha dessa dose permitiu observar efeitos imunogenéticos seguros, eficazes e in vitro, tanto isoladamente quanto em combinação com uma dose única de radiação17.
Com a hipertermia de nanopartículas magnéticas, existem vários fatores que precisam ser considerados na construção de um sistema de entrega apropriado. O projeto de instrumentação inclui importantes fatores de segurança, como o uso de um resfriador para garantir que o equipamento de entrega de campo magnético permaneça frio mesmo quando operado em alta potência e procedimentos à prova de falhas que impedem que o sistema seja ligado se todos os sistemas de temperatura, avaliação de energia e controle não tiverem sido ativados. Além disso, existem fatores biológicos importantes que precisam ser considerados para situações in vivo e in vitro. Ao usar células cultivadas, é necessário tratar em meios de crescimento e manter a uma temperatura viável consistente para evitar alterações fisiológicas que possam afetar os resultados. Para tipos individuais de nanopartículas, é importante conhecer a taxa de absorção específica (SAR) ao calcular os parâmetros de aquecimento baseados em FMA. Da mesma forma, é importante conhecer a concentração de mNP/Fe, em células e tecidos, que é necessária para alcançar o aquecimento desejado. Os métodos in vivo requerem ainda mais atenção aos detalhes, uma vez que o animal deve ser mantido sob anestesia durante o tratamento e a temperatura corporal central do animal mantida em um nível normal durante todo o tratamento. Permitir que a temperatura corporal do animal caia, como acontece sob anestesia, pode afetar os resultados gerais, no que diz respeito à dose térmica do tecido a ser tratado.
Neste manuscrito, discutimos os métodos utilizados para projetar e construir um versátil sistema de hipertermia de nanopartículas magnéticas, bem como importantes fatores de uso que precisam ser considerados. O sistema descrito permite a entrega robusta, consistente, biologicamente apropriada, segura e bem controlada da hipertermia de nanopartículas magnéticas. Finalmente, deve-se notar que os estudos de mNPH que conduzimos geralmente envolvem outras terapias, como radiação, quimioterapia e imunoterapia. Para que esses resultados sejam significativos, é importante determinar como o calor fornecido pode afetar a eficácia e/ou a toxicidade de segurança de outras modalidades (ou vice-versa) e o bem-estar do animal. Por esta razão e pela dosimetria e situações terapêuticas anteriormente mencionadas, é essencial prestar muita atenção à precisão da dosagem de hipertermia de nanopartículas magnéticas e às medições contínuas de temperatura central e alvo. O objetivo deste protocolo é fornecer um método e uma descrição simples e consistentes para a entrega de hipertermia segura e eficaz de nanopartículas magnéticas.

<table><tbody><tr><td>.25% Tripsina</td><td>Corning</td><td>45000-664</td><td>disponível em muitas empresas</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 22363204</td><td>disponível em muitas empresas</td></tr><tr><td>B16F10 células de melanoma murino</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>C57 / Bl6 camundongos</td><td>Charles river</td><td>027C57BL / 6</td><td>camundongos fêmeas de 6 semanas</td></tr><tr><td>Chiller</td><td>Thermal Care</td><td>Chiller da série NQ 5</td><td>que resfria a bobina</td></tr><tr><td>Fluido refrigerante</td><td>Dow Chemical Company</td><td>Dowtherm SR-1</td><td>antena fluido de resfriamento</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>SH30071</td><td>disponível em muitas empresas</td></tr><tr><td>sondas de fibra óptica, software e chassi</td><td>FISO</td><td></td><td>FISO software de evolução usado para ler as temperaturas</td></tr><tr><td>Câmera IR</td><td>Flir</td><td></td><td>câmera infravermelha para monitorar</td></tr><tr><td>nanopartículas de óxido de ferro</td> de aquecimento não intencional <td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td><td>Bionized NanoFerrite</td><td>revestido com dextrano nanopartículas de óxido de ferro</td></tr><tr><td>bobina de rato, solenóide</td><td>Fluxtrol</td><td>penicilina /</td> estreptomicina Corning 45000-652 disponível <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>em muitas empresas</td></tr><tr><td>Gerador de RF</td><td>Huttinger</td><td>Fonte de alimentação</td> <td>TIG 10/300</td></tr><tr><td>Mídia RPMI</td><td>Corning</td><td>45000-396</td><td>disponível em muitas empresas</td></tr></tbody></table>

entrega in vitro e in vivo de hipertermia de nanopartículas magnéticas usando um sistema de entrega personalizado

In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

A hipertermia tem sido usada há muito tempo no tratamento do câncer. As técnicas têm variado desde a inserção intratumoral de barras de ferro quente, até nanopartículas magnéticas direcionadas a anticorpos tumorais administradas sistemicamente, a temperaturas de 39 °C (nível de febre) a 1.000 °C (eletrocautério) e tempos de tratamento de segundos a horas. A relação temperatura-tempo (dose térmica) dita o efeito com altas doses térmicas, resultando na ablação tecidual e doses térmicas mais baixas, resultando em efeitos subletais, como aumento do fluxo sanguíneo, acúmulo de drogas e estimulação imunológica. Uma das terapias médicas atuais mais promissoras é a hipertermia de nanopartículas magnéticas (mNPH). Esta técnica envolve a ativação de nanopartículas magnéticas, que podem ser entregues sistemicamente ou intratumoralmente, com um campo magnético alternado não invasivo e não tóxico. O tamanho, a construção e a associação das nanopartículas magnéticas e a frequência e a intensidade do campo magnético são os principais determinantes do aquecimento. Desenvolvemos instrumentação e técnicas sofisticadas para fornecer hipertermia de nanopartículas magnéticas reprodutíveis em modelos animais grandes e pequenos e células cultivadas. Essa abordagem, usando monitoramento contínuo e em tempo real da temperatura em vários locais, permite a entrega de doses térmicas bem definidas para o tecido alvo (tumor) ou células, limitando o aquecimento do tecido não alvo. O controle e o monitoramento precisos da temperatura, em vários locais, e o uso do algoritmo padrão da indústria (minutos equivalentes cumulativos a 43 °C /CEM43) permitem uma determinação e quantificação precisas da dose térmica. Nosso sistema, que permite uma ampla variedade de temperaturas, doses térmicas e efeitos biológicos, foi desenvolvido por meio de uma combinação de aquisições comerciais e desenvolvimentos internos de engenharia e biologia. Este sistema foi otimizado de uma forma que permite a rápida conversão entre técnicas ex vivo, in vitro e in vivo. O objetivo deste protocolo é demonstrar como projetar, desenvolver e implementar uma técnica e um sistema eficazes para fornecer hipertermia reprodutível e precisa da terapia de nanopartículas magnéticas (mNP).

Estudos in vitro As células só alcançarão e manterão a temperatura e a dose térmica desejadas se a quantidade e a concentração das nanopartículas magnéticas/ferro e do FMA forem adequadamente combinadas. Ao usar nanopartículas magnéticas para aquecer células in vitro (e in vivo), deve-se notar que, para alcançar a hipertermia em células com nanopartículas magnéticas internalizadas, será necessário um nível específico de mNP/Fe intracelular, e o número e a proximidade de células carregadas de mNP, entr...

Este protocolo apresenta técnicas e metodologia necessárias para a entrega precisa de hipertermia de nanopartículas magnéticas usando um sofisticado sistema de entrega e monitoramento.

Entrega In Vitro e In Vivo de Hipertermia de Nanopartículas Magnéticas usando um Sistema de Entrega Personalizado

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

Este método é significativo porque fornece a maneira mais robusta e reprodutível de fornecer tratamento de hipertermia de nanopartículas magnéticas em modelos pré-clínicos. Esta técnica permite a entrega precisa e consistente da hipertermia de nanopartículas, monitorando e controlando com precisão o ambiente local, a fisiologia animal e a dose térmica. Ao tentar este protocolo, lembre-se de que o aquecimento de nanopartículas deve permanecer confinado ao tecido alvo.É essencial o uso de termometria abundante e apropriada para garantir a reprodutibilidade e a segurança. 24 horas após o plaqueamento, as células de melanoma murino B16 F10 adicionam nanopartículas magnéticas a uma concentração final de três miligramas de íons por mililitro. Certifique-se de que as nanopartículas sejam distribuídas uniformemente por todo o poço, criando uma solução de estoque de meios e nanopartículas magnéticas com antecedência.48 horas após adicionar as nanopartículas, adicione 0,5 mililitros de tripsina a cada poço que está sendo tratado e gire suavemente a placa. Use um microscópio para verificar se as células estão separadas. Em seguida, adicione um mililitro de meio a cada poço e colete todas as células em tubos de 1,5 mililitro usando um tubo separado claramente rotulado para cada poço.Gire os tubos a 60G por dois a três minutos para pellet as células. Em seguida, coloque os tubos no espaçador cheios de água dentro da bobina. Defina a temperatura do banho-maria para manter o meio e o palete de células a 37 graus Celsius.Configure sondas de temperatura de fibra óptica separadas para monitorar a temperatura dentro do tubo e do banho-maria. Ligue o chiller e verifique se o refrigerante está fluindo pela serpentina. Em seguida, ligue a fonte de alimentação e ajuste a porcentagem do máximo para o campo desejado.Opere a bobina solenóide de 14 voltas alimentada por um gerador de 10 quilowatts a 165 quilohertz e 23.87 quiloamperes por metro. Trate as células até que uma dose térmica de protocolo previamente determinada seja atingida. Após o tratamento, ressuspenda as células peletizadas no meio dentro dos tubos e recoloque-as em novas placas de seis poços claramente marcadas.Depois de anestesiar o camundongo, limpe o tumor com um lenço umedecido com álcool. Injete as nanopartículas magnéticas no tumor três horas antes do tratamento com AMF. Após três horas, anestesiar novamente o rato e verificar a falta de resposta aos reflexos de endireitamento.Remova a etiqueta auricular ou qualquer outro objeto de metal do mouse e coloque suavemente uma sonda de temperatura de fibra óptica lubrificada em seu reto. Coloque o cateter no tumor. Remova a agulha.Em seguida, corte o cateter para que ele não saia muito do tumor. Insira uma sonda de temperatura de fibra óptica de três sensores no cateter, que protegerá os sensores. Prenda a sonda retal e intratumoral na cauda do animal.Coloque o mouse em um tubo de 50 mililitros que deve ter um orifício perto da cabeça onde a anestesia pode ser conectada e administrada. Coloque o tubo dentro da configuração da bobina e reconecte a anestesia. Coloque uma sonda de temperatura de fibra óptica frouxamente no tubo para medir a temperatura do ambiente.Em seguida, ligue o chiller e certifique-se de que o refrigerante está circulando. Verifique se o software do computador está exibindo as várias temperaturas e comece a gravar para permitir que um cálculo de CEM43 seja exibido em tempo real, onde a dose necessária de CEM43 deveria ter sido previamente determinada. Ligue o ímã em uma porcentagem de baixa potência e certifique-se de que as sondas de temperatura de fibra óptica estejam registrando as mudanças de temperatura.Em suma, que a temperatura central do animal permaneça em 38 graus Celsius, regulando-a com a jaqueta de ar condicionado. Ajuste a força do campo magnético alterando a potência que controla o nível de temperatura no tumor. Desligue o AMF assim que a dose desejada for alcançada.Remova o tubo da bobina e remova o mouse do tubo. Em seguida, desligue o chiller. Extraia as sondas e cateteres e, se necessário, marque o animal com uma nova etiqueta de metal para a orelha.Monitore o mouse durante a recuperação da anestesia, garantindo que ele retome o comportamento normal e que não haja complicações. Para hipotermia in vivo, é essencial colocar o maior número possível de sondas de temperatura de fibra óptica em locais estratégicos para avaliação de eficácia e segurança em tempo real. Essas sondas possibilitam registrar a temperatura durante todo o experimento, permitindo dosimetria e histórico térmico precisos.As curvas geradas durante um experimento in vivo são mostradas aqui, destacando a capacidade de monitorar de perto a temperatura e ajustar o sistema para manter a temperatura do tumor dentro da faixa desejada. Os gráficos vulcânicos mostram genes diferenciais expressos após o tratamento de hipertermia de nanopartículas magnéticas in vitro e in vivo, demonstrando como as técnicas moleculares podem ser usadas para monitorar os efeitos da hipertermia. O monitoramento preciso da temperatura do tumor, da temperatura central dos animais e da dose térmica é necessário para a administração consistente do tratamento.Após a hipertermia, diferentes análises podem ser realizadas para entender o efeito e o mecanismo do tratamento. E outras terapias podem ser implementadas para um maior efeito terapêutico.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Pegue as células microgliais murinas aderidas em uma placa multipoços.Adicione nanopartículas magnéticas revestidas com ácido poliacrílico (MNPs) ao poço de teste, deixando outro poço sem tratamento como controle.Incubar as células para permitir a captação de MNP via endocitose, permitindo sua internalização.Lave com tampão para remover MNPs não ligados.Adicione uma solução enzimática para separar as células.Transfira as células separadas para tubos e centrifugue para pellets.Rejeitar o...

Dano celular induzido por hipertermia magnética em células microgliais murinas

Aparelho de aquecimento de uma ressonância magnética compatível customizado à base de laser tem sido desenvolvido para proporcionar aquecimento local dos tumores subcutâneos, a fim de activar os agentes de libertação de lipossomas termossensíveis especificamente na região do tumor.

Customizado aparelho de aquecimento à base de laser para lançamento acionado de cisplatina de termossensível lipossomas com Ressonância Magnética Orientação Imagem

Este manuscrito descreve a entrega eficiente, não-viral de miR a células endoteliais por um vector de PEI / MNP e a sua magnetização. Assim, em adição à modificação genética, esta abordagem permite a orientação celular magnética e ressonância magnética detectabilidade. A técnica pode ser usada para melhorar as características de produtos de células terapêuticas.

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

Este manuscrito descreve a preparação de microgeles magnéticos e sensíveis ao calor através de uma emulsão induzida por temperatura sem reação química. Estes microgéis sensíveis foram sintetizados misturando nanopartículas de poli ( N- isopropilacrilamida) (PNIPAAm), polietilenimina (PEI) e de Fe 3 O 4 -NH 2 para o uso potencial em liberação de fármaco acionada magneticamente e termicamente.

Poli (Magnetic and Thermal-sensitive Poly)<em&gt; N</em&gt; Microgels com base em isopropilacrilamida) para liberação controlada com disparo magnético

Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de microbolhas com nanopartículas de óxido de ferro (NSMs) através de auto-montagem, sinergizando a capacidade de resposta magnética, acústica e óptica em uma plataforma nanoterapêutica para hipertermia magnética e terapia de câncer de combinação fototérmica.

Microbolhas magnéticas, acústicas e óptica-tripla-responsivas para hipertermia magnética e terapia de câncer de combinação pothototérmica

Apresentamos aqui um protocolo para usar hipertermia controlada, gerada por ultrassom focalizado de alta intensidade guiado por ressonância magnética, para desencadear a liberação de drogas de lipossomas sensíveis à temperatura em um modelo de rabdomiossarcoma em camundongos.

Hipertermia gerada por ultrassom focalizado de alta intensidade guiado por ressonância magnética: um método de tratamento viável em um modelo de rabdomiossarcoma murino

A barreira hematoencefálica é um obstáculo significativo na entrega de terapias para o glioblastoma, uma doença para a qual não há cura. Aqui, relatamos uma nano plataforma terapêutica de óxido de ferro guiada por imagem in vivo que pode contornar essa barreira fisiológica em virtude do tamanho e se acumular no tumor.

Entrega de nanopartículas de uma carga útil de oligonucleotídeo em um modelo animal de glioblastoma multiforme

Este protocolo apresenta técnicas e metodologia necessárias para terapia hipertérmica direcionada em modelos de tumores sólidos. A abordagem aproveita a conversão fototérmica da luz infravermelha próxima por nanobastões de ouro injetados intratumoralmente para induzir o aquecimento localizado dentro do microambiente tumoral.

Induzindo hipertermia leve direcionada em modelos de tumores murinos por meio da conversão fototérmica de luz infravermelha próxima por nanobastões de ouro intratumorais

Este artigo descreve a cultura de fatias de tecido de pacientes para estudos de genes de entrega e análise de expressão gênica utilizando IVIS imagem de bioluminescência.

Ex Cultura Vivo de tecido do paciente e Exame de Entrega Gene

Entrega célula intramio em modelos murinos de doenças cardiovasculares, como a hipertensão ou o enfarte do miocárdio, é amplamente utilizado para testar o potencial terapêutico de diferentes tipos celulares em estudos de regeneração. Portanto, uma descrição detalhada e uma visualização clara deste procedimento cirúrgico ajudará a definir os limites e as vantagens das análises terapêuticas celulares cardiovasculares em pequenos roedores.

Entrega celular intramiocárdico: Observações em murino Corações

Aprenda a entregar hipertermia de nanopartículas magnéticas em modelos pré-clínicos com precisão e segurança. Este método robusto permite monitorar a dose térmica e confinar o aquecimento ao tecido alvo.

Entrega In Vitro e In Vivo de Hipertermia de Nanopartículas Magnéticas usando um Sistema de Entrega Personalizado

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