Name: Quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Aprenda a quantificar o vírus da raiva em estruturas cerebrais bovinas usando qRT-PCR e transcrição in vitro. Este método permite detectar cargas virais baixas no gado e auxilia no diagnóstico molecular da raiva.

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Este trabalho contou com o apoio do Instituto Nacional de Pesquisas Agropecuárias, Florestais e Pecuária (INIFAP). Agradecemos a Jerzayn Fraustro Esquivel por sua colaboração no desenvolvimento do vídeo associado a este documento.

Este estudo foi aprovado e conduzido de acordo com as recomendações de uso de animais fornecidos pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) do Centro Nacional de Investigação Disciplinar en Microbiología Animal (CENID-MA).
1. Amostras
<ol><li>Use diferentes áreas do cérebro dissecadas de 6 diferentes cérebros bovinos antirrábicos positivos para análise de RT-PCR.</li>
</ol>2. Anticorpos fluorescentes diretos (DFAs) para confirmar raiva
NOTA: A detecção do antígeno da raiva pela DFA é um método qualitativo para determinar a presença da nucleoproteína da raiva usando anticorpos rotulados por fluoresceína. O teste foi realizado utilizando-se o protocolo fornecido por Dean et al. (1966)20, conforme descrito abaixo.
<ol><li>Faça duas impressões de cada tecido dissecado de diferentes estruturas cerebrais em uma lâmina estéril de aproximadamente 15 mm de diâmetro. Use um aplicador de madeira para esfregar uma porção de aproximadamente 3 mm3 do tecido na lâmina estéril. Para criar a mancha, pressione suavemente o aplicador de madeira contra o slide manualmente.</li>
	<li>Fixar os slides de mancha de amostra submersando os slides em 100% acetona por 1 h a -20 °C. Após a incubação, seque as lâminas em um pano seco a 21 °C por 30 min.</li>
	<li>Adicione 50 μL do anticorpo antinucleoproteína rotulado por fluoresceína a cada mancha cerebral a uma diluição de 1:10, dispensando através de uma seringa.</li>
	<li>Incubar os slides com o conjugado em uma câmara úmida a 37 °C por 1 h.</li>
	<li>Após a incubação, lave as lâminas duas vezes com água e com PBS para eliminar o excesso de conjugados. Deixe os slides secarem a 21 °C. Limpe cuidadosamente para remover o excesso de líquido e, em seguida, seque brevemente o ar antes da montagem.</li>
	<li>Adicione uma gota de 50% de glicerina fosfato para cobrir a superfície da seção e, em seguida, cubra com uma mancha de cobertura. Observe as seções sob um microscópio de epifluorescência a 40x de ampliação.<ol>
<li>Processe e observe os controles positivos e negativos (controle positivo: cérebros de camundongos inoculados com RABV; controles negativos: cérebros bovinos RABV negativos) da mesma forma que as amostras.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Gerando controle positivo para RT-PCR
<ol><li>Obtenha células BHK-21 do banco de germoplasma. Use células até apassagem 70 para replicar a cepa RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) usando a passagem 2.</li>
	<li>Manter e propagar células BHK-21 em garrafas contendo meio essencial mínimo (MEM) suplementados com soro de bezerro fetal de 10% (FCS) a 37 °C na presença de CO2 (5%) e sob condições úmidas. Cresça as células em frascos de cultura de25 cm 2 até atingirem 80% de confluência e, em seguida, subcultura.</li>
	<li>Remova o meio de cultura das células e lave a garrafa com soro fisco tamponado (PBS). Inocular a cultura com 105 TCID/mL de ERA de cepa RABV. Incubar o inóculo viral por 2 h sob agitação constante a 37 °C na presença de CO2 (5%) e sob condições úmidas.</li>
	<li>Remova o meio de infecção e adicione MEM suplementado com 5% (bovino fetal súmérico) SFB. Incubar por 72 h a 37 °C na presença de CO2 (5%) em condições úmidas.</li>
	<li>Colher RABV 3 dias após a inoculação quando as células apresentam efeitos citopáticos. Congele as células infectadas e descongele-as a 4 °C para lise as células. Colete o meio da garrafa e, em seguida, coloque as células em um tubo de centrífuga para centrifugação a 1.050 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Armazene os supernacantes do RABV a -80 °C e prepare as alíquotas de trabalho para armazenamento a -70 °C.</li>
	<li>Intracerebrally inocula o vírus obtido na etapa anterior em camundongos CD1 femininos de 21 dias de idade. Use uma seringa de 1 mL para inocular 50 μL de soluções contendo 106 MICLD50 (dose letal de cultura infecciosa do camundongo 50%) doses em camundongos22.</li>
</ol>4. Extração de RNA
NOTA: O RNA total foi extraído diretamente de cérebros bovinos usando um método de extração orgânica de acordo com o seguinte protocolo.
<ol><li>Use 100 mg de tecido cerebral de cada estrutura anatômica para extrair RNA total usando um reagente comercialmente disponível contendo isothiocianato de guanidium.</li>
	<li>Homogeneize manualmente um total de 100 mg de tecido de cada estrutura em 1 mL do reagente de isothiocianato guanidium por vórtice usando um homogeneizador Dounce com um pequeno pilão dentro do microtubo para 15 s em velocidade máxima.</li>
	<li>Incubar as amostras no gelo por 5 minutos e, em seguida, adicionar 200 μL de clorofórmio. Misture as amostras vigorosamente por 15 s, incubar no gelo por 2 a 3 minutos e, em seguida, centrífuga a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfira a fase aquosa para um tubo limpo e adicione 500 μL de álcool isopropílico. Incubar as amostras por 15 min a 21 °C.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 10 min a 4 °C. Aspire o supernatante aquoso por pipetação. O RNA isolado estará presente como uma pelota no tubo.</li>
	<li>Em seguida, lave a pelota de RNA com 1 mL de 75% de etanol por pipetação, e centrífuga a 7500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Decante o supernatante e seque a pelota de RNA à temperatura ambiente (21 °C). Em seguida, diluir a pelota em 50 μL de água sem nuclease.</li>
	<li>Determine a concentração e qualidade do RNA a 260 nm usando um espectrofotômetro. Armazene o RNA a -80 °C até o uso.</li>
	<li>Remova o DNA das amostras de RNA por digestão com DNase I. Adicione 2 U de DNase I por 1 μg de RNA extraído na etapa anterior. Em seguida, adicione 5 μL de tampão de reação de 10x e, em seguida, incubar a 37 °C por 30 min. Inative o DNase I adicionando 1 μL de EDTA à mistura seguida de incubação por 10 min a 65 °C.</li>
</ol>5. síntese cDNA e PCR
<ol><li>Sintetizar cDNA de primeira cadeia usando oligo dT e transcriptase reversa. Para cada 1 μg de RNA, adicione 1 μL de oligo DT (500 μg/mL), 1 μL de mistura dNTP de 10 mM e água destilada sem nuclease a um volume final de 12 μL. Incubar a mistura a 65 °C por 5 min.</li>
	<li>Esfrie a mistura de reação a 4 °C. Centrifugar o tubo por 30 s a 1.050 x g, e depois adicionar 4 μL de tampão de reação, 2 μL 0,1 M DTT e 1 μL de inibidor de ribonuclease (40 U/μL).</li>
	<li>Incubar a mistura de reação a 37 °C por 2 min e, em seguida, adicionar 1 μL de transcriptase reversa (200 U). Em seguida, incubar a mistura de reação por 50 min a 37 °C e, em seguida, inativar a reação a 70 °C por 15 min.</li>
	<li>Armazene o cDNA a -20 °C antes de usar. NOTA: Para verificar a qualidade do cDNA sintetizado, realize a amplificação de um fragmento de 761 bp do gene RABV N antes de realizar a síntese in vitro. Use o protocolo descrito por Loza-Rubio et al.11, conforme descrito na etapa 5.5 abaixo.</li>
	<li>Realize o PCR usando polimerase de DNA Taq nas seguintes condições. Execute a configuração de reação da seguinte forma: 10x tampão Taq contendo 20 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 1 U Taq polimerase, 10 μM de cada primer (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ e SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2,5 μL de cDNA, e água ultrauso a um volume final de 50 μL.</li>
	<li>Realizar a amplificação em um termociclador utilizando as seguintes condições de ciclismo: 95 ° C para 3 min; 35 ciclos de 95 ° C para 30 s, 60 °C para 30 s e 72 °C para 1 min; um ciclo de 72 °C por 7 min.</li>
	<li>Avalie a presença dos produtos PCR de 761 bp utilizando um gel de 1% de agarose.</li>
</ol>6. Transcrição in vitro
NOTA: A transcrição in vitro gera mRNA de um gene alvo. Use um par de primer que amplifica o gene RABV N completo e um que é usado como um controle positivo para o ensaio qRT-PCR. Estes primers são projetados para amplificar o gene RABV N completo e para adicionar um promotor que reconhece a polimerase T7 (TAATACGACTCACTATAG).
<ol><li>Para amplificar todo o gene N RABV, use os primers Trans-Nrab para a frente (50 gatgagtcactcgaatatgtctt 30) e reverso (50 caataatacgactactatagggatgagacaagatt 30) e um kit PCR de alta fidelidade.<ol>
<li>Para cada reação, prepare uma mistura mestre pcr adicionando a um buffer de reação de tubo PCR limpo 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 μM de cada primer, 0,5 U de polimerase de alta fidelidade, 1,5 μL de cDNA (preparado na etapa 5) e água ultrauso para um volume final de 50 μL.</li>
		<li>Use um termociclador definido para as seguintes condições para amplificação: 94 °C por 1 min; 4 ciclos de 94 °C para 1 min, 40 °C para 1 min e 72 °C por 2 min; 35 ciclos de 94 °C para 1 min, 60 °C para 1 min e 72 °C por 2 min; prorrogação final de 72 °C para 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para usar o produto PCR como modelo para a síntese in vitro e remover componentes da reação enzimática da etapa 6.1.2, purificar o produto PCR usando um kit concentrador baseado em coluna de acordo com as instruções do fabricante e, em seguida, quantificar usando um espectrofotômetro.</li>
	<li>Para síntese de RNA, use um kit de transcrição in vitro com a seguinte mistura de reação: 5 μL T7 Transcrição 5x tampão, 1,9 μL de cada nucleotídeo tripofásico, 10 μg de DNA PURIFICADO RABV N DNA VP2 e 2,5 μL da mistura enzimática. Em seguida, incubar a mistura a 37 °C por 4h. Em seguida, adicione 1 μL de 1 U/μg RNase-Free DNase à mistura de reação e incubar por 15 minutos a 37 °C para eliminar a contaminação do DNA.</li>
	<li>Purificar o RNA transcrito in vitro e depois concentre-o usando fenol:clorofórmio:álcool isoamyl (25:24:1).</li>
	<li>Resuspenquei a pelota de RNA purificada em 70 μL de tampão TE e, em seguida, armazene a -80 °C até usar.</li>
	<li>Repita o protocolo PCR da etapa 6.1 até que aproximadamente 5 μg de produto PCR seja obtido. Após a purificação e concentração, o gene N mRNA in vitro transcrito estará presente em uma concentração de 4.711 μg/μL.</li>
	<li>Confirme que o mRNA transcrito in vitro corresponde ao gene N após o passo 5 deste protocolo e use-o como um controle positivo para a reação em cadeia de transcriptase reversa em tempo real (qRT-PCR).</li>
</ol>7. Reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real (qRT-PCR)
<ol><li>Para qRT-PCR, use uma transcrição de mRNA in vitro codificando o gene N completo como um controle positivo, juntamente com um kit comercial de um passo qRT-PCR usando sondas de hibridização de acordo com as instruções do fabricante. Use a sonda e os primers descritos por Carneiro et al. (2010)23 para detectar uma região conservada do gene RABV N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatggaaagggaattg 3′, e BRDesrot-Probe: 5'-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).</li>
	<li>Use as seguintes condições de ciclismo térmico: 1 ciclo de 50 °C para 10 min e 95 °C para 2 min; 40 ciclos de 95 °C para 15 s e 50 °C para 30 s.</li>
</ol>8. Curva de calibração ou curva padrão
<ol><li>Realize diluições seriais do mRNA transcrito in vitro, pipetando 1 μg/μL de mRNA em tubos até que seis diluições descupadas sejam obtidas. Prepare tubos a um volume de 100 μL em triplicado para uso na criação da curva padrão. Execute qRT-PCR conforme descrito na etapa 7.</li>
	<li>Execute qRT-PCR em um termociclador com um rotor processando as várias amostras cerebrais simultaneamente com as reações em execução para criar a curva padrão e usar controles positivos, controles negativos e supernantes isolados da cultura celular.</li>
	<li>Para avaliar o limite de detecção, eficácia do teste e sensibilidade do teste, utilize uma curva padrão em triplicado sob as mesmas condições.</li>
</ol>9. qRT-PCR de amostras biológicas
<ol><li>Para a detecção do gene N rabv, use o RNA a partir de amostras de campo, controles positivos, controles negativos e supernantes de cultura celular para executar qRT-PCR usando o kit PCR descrito na etapa 7.</li>
	<li>Para determinar o número de cópias do genoma RABV presente nas amostras do cérebro bovino, obtenha dados de TC da curva padrão e amostras biológicas e daqueles interpolados da equação da curva de calibração.</li>
</ol>

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<li>Bingham, J., Van Der, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+rabies+antigen+in+infected+brain+material%3A+determining+the+reliability+of+different+regions+of+the+brain+for+the+rabies+fluorescent+antibody+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test.</a> Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Estudos anteriores mostraram que a DFA só pode detectar RABV dentro de sete dias após a amostra ser armazenada à temperatura ambiente (21 °C)14. Em contrapartida, este trabalho demonstrou que a sensibilidade do RT-PCR começa a diminuir depois que as amostras foram expostas à temperatura ambiente por 12 dias. Portanto, o genoma RABV pode ser detectado por qRT-PCR em amostras expostas à temperatura ambiente por até 23 dias. Isso demonstra que a sensibilidade do qRT-PCR é relativamente maior para amo...

A raiva pode ser confirmada antes-mortem e post-mortem por várias técnicas que permitem a detecção de ácidos nucleicos virais no cérebro, pele, urina ou saliva1. A detecção do gene nucleoproteína do vírus da raiva (N)é usada principalmente para o diagnóstico de raiva por testes moleculares. Este gene também é usado para genotipagem viral. A raiva pode ser diagnosticada em animais usando qualquer porção do cérebro afetado; no entanto, para excluir a possibilidade de raiva, tecidos de pelo menos duas regiões do cérebro devem ser testados2. Existem vários métodos de diagnóstico para detecção de raiva em animais; no entanto, o teste de imunofluorescência direta continua sendo a técnica de referência padrão3. Outros testes incluem testes biológicos que incorporam a inoculação do camundongo, infecção na cultura tecidual e reação em cadeia de polimerase (PCR)4. Todas essas técnicas são recomendadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) e Pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para o diagnóstico de raiva em humanos e animais,respectivamente 5.
Técnicas de detecção e amplificação de ácido nucleico revolucionaram o diagnóstico da raiva nos últimosanos 6 e essas técnicas desempenham um papel importante no diagnóstico ante mortem da raiva humana. Vários testes baseados em PCR foram avaliados para complementar os testes convencionais para diagnósticos de raiva pré-mortem e pós-morte 7,8,9,10. A maioria dos ensaios tem como alvo o gene de nucleoproteína viral da raiva para amplificação, que é a região mais conservada do genoma viral1,11. Nos últimos 20 anos, vários ensaios moleculares foram desenvolvidos para diagnosticar o RABV, e alguns desses ensaios têm sido usados para caracterização de vírus. A maioria dos ensaios tem como objetivo detectar genes conservados dentro do genoma viral, mais comumente usando ensaios de corrente de polimerase convencional ou quantitativo (qRT-PCR)12,13.
PcR é uma técnica de diagnóstico altamente sensível que pode detectar o genoma de um dado patógeno dentro dos tecidos, mesmo quando esses tecidos estão decompostos. Utilizando abordagens baseadas em PCR, quantidades mínimas de um agente infeccioso podem ser detectadas em uma amostra clínica através da amplificação seletiva e repetitiva de uma sequência de nucleotídeos de DNA14. qRT-PCR que incorpora sondas fluorescentes (por exemplo, TaqMan) ou corantes de vinculação de DNA (por exemplo, SYBR Green) tem sido usado em ensaios para diagnosticar RABV tanto ante- quanto post- mortem com alta sensibilidade; no entanto, tal abordagem requer equipamentos especializados. Para superar essa limitação, foi sugerido amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP), com base em seu baixo custo, simplicidade e características desejáveis para a detecção de RABV. Este ensaio é particularmente importante, pois pode ser utilizado em países em desenvolvimento15.
qRT-PCR baseia-se na detecção e quantificação de uma molécula, onde os aumentos de sinal fluorescente são em proporção direta à quantidade de produto PCR em uma única reação. À medida que o número de cópias do alvo do ácido nucleico aumenta, a fluorescência também aumenta. Corantes intercalantes não específicos, como o corante de dna verde SYBR ou sondas de oligonucleotídeos específicas da sequência que carregam um fluoróforo e um quencher são comumente usados para fornecer a leitura fluorescente em qRT-PCR. Este ensaio oferece vantagens sobre o RT-PCR convencional que incluem um tempo de teste mais curto (2-4 h), risco reduzido de contaminação devido ao sistema de tubo fechado (falta de manipulação pós-PCR de produtos amplificados) e a capacidade de detectar diferentes alvos simultaneamente16. qRT-PCR pode ser usado para diagnosticar raiva ante-mortem da saliva e outras amostras. Este ensaio também pode ser usado como um teste universal em tempo real para a detecção de diferentes espécies de Lyssavirus ou linhagens de RABV15. Nesta abordagem combo RT-PCR, duas reações são usadas. O primeiro detecta diferentes linagens genéticas de RABV, e o segundo detecta a espécie Lyssavirus. Ambas as etapas envolvem ensaios qRT-PCR, onde o primeiro usa sondas de hibridização e o segundo usa corantes15. Devido ao grande número de testes que demonstraram sucesso na detecção molecular do RABV utilizando essa técnica, o atual Manual Terrestre OIE (2018) recomenda o uso de PCR para a detecção molecular de RABV17.
O México é um país com considerável potencial pecuário. Os estados com maior produção pecuária contêm regiões tropicais úmidas e regiões secas que estão em risco de surtos de raiva devido à presença do morcego vampiro Desmodus rotundus, o principal transmissor da raiva. Por isso, é essencial desenvolver mais ferramentas para a prevenção e controle da raiva paralímtica bovina (BPR) no México. Com base nisso, o objetivo deste estudo foi utilizar o qRT-PCR quantitativo para determinar o número de partículas virais em diferentes estruturas anatômicas de cérebros bovinos após a morte por infecção por raiva.
Seis cérebros obtidos de bovinos soropositivos de RABV foram doados por um laboratório externo para uso no desenvolvimento do protocolo qRT-PCR descrito abaixo. As amostras da estrutura cerebral bovina foram transportadas para a instalação do laboratório BSL-2 do laboratório INIFAP CENID-MA e armazenadas a -80 °C até o uso. Cérebros foram obtidos de animais dos estados de Campeche, Yucatán e Querétaro. Antes do recebimento, várias estruturas foram dissecadas do cérebro. Essas estruturas incluíam o chifre de Ammon, cerebelo, córtex, medula, pons e tálamo18,19. O material genético foi extraído como descrito abaixo. O diagnóstico de RABV foi confirmado utilizando anticorpos fluorescentes diretos (DFA)20. Como controle positivo, foram utilizados cérebros de camundongos que foram inoculados com RABV21. Além disso, quatro cérebros de bovinos RABV negativos (determinados pela DFA) foram utilizados como controles negativos.

<table><tbody><tr><td>Clorofórmio</td><td>SIGMA</td><td>C7559</td><td>Facilita a recuperação da fase aquosa de PCRs que foram revestidas com óleo mineral.</td></tr><tr><td>DNA Limpo & Concentrador-500</td><td>Zimo</td><td>D4031</td><td>O DNA Limpo & O Concentrator-500 (DCC-500) foi projetado para a purificação e concentração rápida e de grande formato de até 500 &micro; g de DNA de alta qualidade de amostras, incluindo digestão de endonuclease de restrição em larga escala e preparações de DNA impuro.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Amresco</td><td>193-500</td><td>Purificação de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Kit de sistema de PCR de alta fidelidade FastStart, dNTPack</td><td>Roche</td><td>3553400001</td><td>Enzima de alta fidelidade para a amplificação de produtos de PCR evitando mudanças aleatórias de base</td></tr><tr><td>GelDoc XR</td><td>BioRad</td><td>XR+</td><td>Analisa proteínas maiores e géis de DNA</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Uma nova geração de corantes de gel de ácido nucleico, eles possuem novas características químicas projetadas para minimizar a chance de os corantes interagirem com ácidos nucléicos em células vivas.</td></tr><tr><td>iCycler Thermal Cycler Gradient</td><td>BioRad</td><td>582BR</td><td>A temperatura pode ser monitorada e controlada por algoritmo de instrumento, sonda na amostra ou modos de bloco de amostra</td></tr><tr><td>Sondas Universais iTaq Kit de uma etapa</td><td>BioRad</td><td>1725141</td><td>Mistura de reação para realizar reações de PCR em tempo real usando sondas de hibridização do tipo TaqMan</td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Amresco</td><td>0918-500</td><td>Precipitação de ácidos nucléicos</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Os kits QIAquick contêm um conjunto de membrana de sílica para ligação de DNA em tampão com alto teor de sal e eluição com tampão com baixo teor de sal ou água. O procedimento de purificação remove primers, nucleotídeos, enzimas, óleo mineral, sais, agarose, brometo de etídio e outras impurezas de amostras de DNA</td></tr><tr><td>M-MLV Transcriptase Reversa</td><td>Invitrogen</td><td>28025-021</td><td>Moloney Murine Leukemia Virus A transcriptase reversa (M-MLV RT) usa RNA ou DNA de fita simples na presença de um primer para sintetizar uma fita de DNA complementar .</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo-Scientific</td><td>ND2000</td><td>Microvolume Espectrofotômetro</td></tr><tr><td>Oligo (dT) 18 primer</td><td>Invitrogen</td><td>SO132</td><td>O oligo (dT) 18 primer é um oligonucleotídeo sintético de 18 mer de fita simples com extremidades 5'- e 3'-hidroxila.</td></tr><tr><td>Kit de Sistemas de Produção de RNA em Grande Escala RiboMAX SP6 e T7</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>As reações de transcrição in vitro são usadas para sintetizar quantidades de microgramas de sondas de RNA a partir de modelos de DNA recombinante. A maioria das reações de transcrição projetadas para gerar sondas de RNA são otimizadas para maximizar a incorporação de ribonucleotídeos radiomarcados, em vez de produzir grandes quantidades de RNA</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimerase</td><td>Invitrogen</td><td>#EP0402</td><td>Taq DNA Polimerase é uma DNA polimerase altamente termoestável da bactéria termofílica Thermus aquaticus. A enzima catalisa 5' e 3' síntese de DNA &nbsp;</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>O reagente TRIzol é um reagente completo, pronto para uso, projetado para o isolamento de RNA total de alta qualidade ou o isolamento simultâneo de RNA, DNA e proteínas de uma variedade de amostras biológicas.</td></tr></tbody></table>

quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

A raiva paralítica bovina (BPR) é uma forma de encefalite viral que é de importância econômica substancial em toda a América Latina, onde representa um grande risco zoonótico. Aqui, nosso objetivo era utilizar um protocolo laboratorial para determinar o número de cópia relativa do genoma do vírus da raiva (RABV) em diferentes estruturas anatômicas cerebrais bovinas usando reação quantitativa em cadeia de transcrição reversa em tempo real (qRT-PCR). qRT-PCR quantifica o número específico de cópias genéticas presentes em uma amostra baseada na fluorescência emitida após a amplificação que é diretamente proporcional à quantidade de ácido nucleico alvo presente na amostra. Este método é vantajoso devido à sua curta duração, risco reduzido de contaminação e potencial para detectar ácidos nucleicos virais em diferentes amostras mais facilmente em comparação com outras técnicas. Os cérebros de seis animais raivosos foram divididos em seis estruturas anatômicas, ou seja, o chifre de Ammon, cerebelo, córtex, medula, pons e tálamo. Todos os cérebros foram identificados como positivos para antígenos RABV com base em um teste de imunofluorescência direta. As mesmas estruturas anatômicas do cérebro de quatro bovinos RABV negativos também foram avaliadas. O RNA foi extraído de cada estrutura e utilizado para qRT-PCR. Um ensaio foi realizado para determinar o número de cópias dos genes RABV usando um gene de nucleoproteína transcrito in vitro. A curva padrão utilizada para quantificar o RNA viral apresentou uma eficiência de 100% e linearidade de 0,99. A análise revelou que o córtex, medula e tálamo foram as porções ideais de CNS para uso na detecção de RABV, com base na observação de que essas estruturas possuíam os mais altos níveis de RABV. A especificidade do teste foi de 100%. Todas as amostras foram positivas, não foram detectados falsos positivos. Este método pode ser usado para detectar RABV em amostras que contenham baixos níveis de RABV durante o diagnóstico de BPR.

Os resultados do DFA mostraram 100%, 100%, 83,3%, 66% e 50% de positividade para RABV no córtex, tálamo, medula, pons e chifre, respectivamente. Esses resultados confirmaram os resultados anteriores, e pelo menos três das estruturas dissecadas de cada cérebro foram positivas para o RABV. Uma coloração da DAF positiva representativa é mostrada na Figura 1.
A Figura 2 mostra a amplificação de um fragmento do gene RABV N (passo 5.5) com ...

Este protocolo apresenta uma abordagem baseada em qRT-PCR para determinar o número de cópia genética do vírus da raiva (N) dentro de várias estruturas anatômicas cerebrais bovinas usando transcrição in vitro.

Quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

Quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas. O México é um país com considerável potencial pecuário. Os estados com maior produção pecuária contêm regiões tropicais úmidas e regiões secas que estão em risco de surtos de raiva devido à presença do morcego vampiro, Desmodus rotundus, o principal transmissor da raiva.A detecção do gene n nucleoproteína do vírus da raiva é usada principalmente para o diagnóstico de raiva por testes moleculares. Usando abordagens baseadas em PCR, quantidades mínimas de um agente infeccioso podem ser detectadas em uma amostra clínica através da amplificação seletiva e repetitiva de uma sequência de nucleotídeos de DNA. qRT-PCR baseia-se na detecção e quantificação de uma molécula onde os aumentos do sinal de fluorescência são em proporção direta à quantidade de produto PCR em uma única reação.À medida que o número de cópias do alvo do ácido nucleico aumenta, a fluorescência também aumenta. Com base nisso, o objetivo do estudo foi utilizar qRT-PCR quantitativo para determinar o número de partículas virais em diferentes estruturas anatômicas do cérebro bovino, após a morte, devido à infecção por raiva. O RNA total foi extraído dire

quantitation-of-rabies-virus-in-various-bovine-brain-structures

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O vírus infecta neurônios piramidais no córtex cerebral e proteínas virais expressas localizam-se dentro de estruturas granulares intracitoplasmáticas conhecidas como corpos de inclusão.

Detecção de proteínas virais no tecido cerebral de camundongos infectados pelo vírus da raiva

Este vídeo demonstra a coloração imuno-histoquímica para detecção de antígenos do vírus da raiva no tecido cerebral de camundongos infectados. O processo inclui desparafinização e tratamento com álcool, seguido de tratamento proteolítico para aumentar a acessibilidade ao antígeno. A coloração imuno-histoquímica revela precipitados vermelhos, confirmando a presença de antígenos antirrábicos na seção tecidual.

Uma coloração imuno-histoquímica para a detecção de antígenos do vírus da raiva

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/59402/ imagem 3D de alta resolução de infecção pelo vírus da raiva em tecido cerebral limpo com solvente'&gt;Zaeck, L., et al. Imagens 3D de alta resolução da infecção pelo vírus da raiva no tecido cerebral limpo com solvente. J. Vis. Exp. (2019). Este vídeo demonstra o processo de preparação e imagem de tecido cerebral de camundongo infectado com o vírus da raiva (RABV) para avaliar a infecção progressão. Ele descreve as...

Visualização tridimensional de uma infecção pelo vírus da raiva no tecido cerebral de camundongos

Novel, técnicas de compensação de tecido compatível com imunocoloração, como a imagem 3D final de órgãos com solventes limpos, permitem a visualização 3D da infecção cerebral pelo vírus da raiva e seu ambiente celular complexo. As fatias grossas, anticorpo-etiquetadas do tecido de cérebro são feitas opticamente transparentes para aumentar a profundidade da imagem latente e para permitir a análise 3D pela microscopia confocal da exploração do laser.

Imagem latente 3D de alta resolução da infecção do vírus da raiva no tecido solvente-cancelado do cérebro

O teste imunoistoquímico rápido direto (DRIT) oferece uma organização mundial para a saúde animal e organização mundial da saúde (OIE/OMS) reconhecida alternativa ao teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) para o diagnóstico de raiva. Este teste permite aplicações baseadas em campo que podem ser executadas em aproximadamente 1 h em cima das impressões do cérebro usando a microscopia de luz.

Vigilância aumentada da raiva usando um teste Imunoistoquímico rápido direto

O objetivo deste protocolo é demonstrar técnicas de necropsia seguras em animais pequenos e grandes para obter amostras de tecido satisfatórias para o teste de raiva.

Técnicas de necropsia da raiva em animais grandes e pequenos

Apresentamos um protocolo completo para o diagnóstico pós-morte da raiva animal em condições de campo usando um teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido (RIDT), desde a amostragem da biópsia cerebral até a interpretação final. Também descrevemos outras aplicações usando o dispositivo para análise molecular e genotipagem viral.

Teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido pós-morte de campo para configurações limitadas de recursos com outras aplicações moleculares

Aqui, apresentamos um protocolo de teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos do vírus da raiva como um teste de diagnóstico alternativo para tecidos fixos de formalina.

Teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos lyssavírus a partir de tecidos fixos formalina

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho rápido e econômico para caracterizar genomas do vírus da raiva (RABV) usando a tecnologia de nanoporos. O fluxo de trabalho destina-se a apoiar a vigilância genômica informada em nível local, fornecendo informações sobre linhagens RABV circulantes e sua colocação dentro de filogenias regionais para orientar medidas de controle da raiva.

Sequenciamento do Genoma Completo para Caracterização Rápida do Vírus Rábico Utilizando Tecnologia de Nanoporos

Este protocolo demonstra o ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) pan-lyssavirus LN34 desde a coleta do tecido até a interpretação dos resultados, incluindo atualizações nas sequências e formulações de primers para melhorar o desempenho do ensaio para alguns lyssavirus e lagomorfos não anti-rábicos. Também demonstramos a configuração do ensaio para um formato multiplexado LN34 de poço único (LN34M).

Diagnóstico post-mortem de raiva em animais pelo ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real LN34 atualizado e multiplexado

Aprenda a quantificar o vírus da raiva em estruturas cerebrais bovinas usando qRT-PCR e transcrição in vitro. Este método permite detectar cargas virais baixas no gado e auxilia no diagnóstico molecular da raiva.

Quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas

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