Microscopia confocal e força atômica (Conpokal) em células vivas
11 de agosto de 2020
Apresentado aqui é o protocolo da técnica Conpokal, que combina microscopia de força confocal e atômica em uma única plataforma de instrumentos. Conpokal fornece a mesma célula, mesma região, imagens confocal simultâneas e caracterização mecânica de amostras biológicas vivas.
Conpokal combina microscopia confocal com microscopia de força atômica usando uma sonda para cutucar a superfície da amostra. Embora ambas as técnicas sejam eficazes individualmente, a Conpokal facilita a co-localização da fluorescência com caracterização mecânica. A principal vantagem da técnica Conpokal é a quase simultânea dupla microscopia.
A Confocal investiga processos citoesqueléticos e outros celulares antes e depois da sondagem afm, que fornece propriedades mecânicas específicas da área. Esta técnica é impactante dentro do campo da mecanobiologia, pois, por exemplo, as células cerebrais podem ser sondadas em condições fisiológicas para examinar impulsos elétricos e forçar a transação. Antes de iniciar a análise, selecione um cantilever AFM apropriado para a coleta e uso de luvas desejadas, o estágio de montagem do chip AFM, pinças e uma pequena chave de fenda para montar o chip no bloco de vidro.
Coloque cuidadosamente o chip AFM no centro do bloco de vidro. O cantilever mais uma porção muito pequena do chip AFM deve estar na porção visível e não opaca do bloco de vidro. Use a chave de fenda para apertar o parafuso até que o chip esteja confortável contra o bloco de vidro e use uma lente para verificar se o chip está orientado corretamente.
Quando o chip estiver devidamente orientado, coloque o bloco de vidro na cabeça AFM na orientação adequada e trave o bloco de vidro no lugar. Depois de localizar a parte inferior da placa de calibração por microscopia de campo brilhante, use o painel de controle do motor do estepe do sistema AFM Z para mover o cantilever AFM 2000 mícrons acima da amostra. Usando iluminação de campo brilhante e o painel de controle do motor de estepe Z, baixe lentamente o chip AFM para o fundo da placa de vidro em passos de 100 a 200 mícrons para evitar bater a ponta AFM na placa de Petri.
Localize os micrômetros manuais que controlam X Y ou em movimento simples da cabeça AFM na plataforma do instrumento. À medida que a sombra do cantilever AFM se torna mais escura, e a forma se torna mais nítida, use os micrômetros manuais para corrigir a cabeça AFM e ajustar a posição do cantilever AFM dentro do campo de visão. Neste momento, as tabelas de busca podem precisar ser ajustadas.
Observe para que uma sombra apareça na visualização do software do microscópio, o que indica que a ponta AFM está se aproximando da parte inferior do prato. Continue usando pequenos passos para baixar a ponta AFM até que a ponta esteja em foco. Quando o laser estiver em posição, use os mostradores de alinhamento a laser para posicionar o laser na parte traseira de onde a ponta AFM está localizada no cantilever.
O painel de alinhamento a laser deve exibir um sinal de soma maior que zero volts. Mova o laser, uma pequena distância em todas as direções do cantilever AFM, até que o sinal máximo de soma seja alcançado enquanto permanece na ponta AFM. Uma vez definida a posição do laser, use os mostradores de deflexão controlados manualmente para zerar a deflexão vertical e lateral.
Use os botões de deflexão vertical e lateral para alinhar o detector para que o alvo esteja centrado e não haja deflexão vertical ou lateral observada no painel de alinhamento do laser. Abra a janela Calibração e insira todas as informações específicas dos experimentos. Substitua o filtro de luz laser.
Antes de calibrar, desligue a fonte de luz do microscópio confocal e feche o gabinete AFM para amortecer qualquer ruído potencial proveniente da luz da sala ou vibrações. Pressione o botão Calibração para permitir automaticamente que o sistema calibrar a ponta. Quando a calibração estiver completa, a rigidez do cantilever e sua sensibilidade serão exibidas no painel calibração.
Em seguida, use o botão Comando de Aproximação Automatizada para baixar a ponta para a parte inferior do prato de amostra e definir o tamanho da área da pele, a resolução, o ponto de ajuste, o comprimento Z e o tempo de pixel, antes de pressionar o botão de reprodução para começar a digitalizar. Para imagens de microscópio confocal no software do microscópio, habilite as capacidades confocal e selecione as linhas laser apropriadas para os corantes que foram usados para manchar as amostras. Selecione uma ou várias linhas laser para excitar e visualizar essas características na amostra e definir o ganho para um valor que otimiza a fluorescência da amostra, mas limita a quantidade de ruído.
Ajuste a potência do laser para evitar pixels saturados, maximizando o alcance dinâmico e ajuste o tamanho do pinhole para uma unidade de área para maximizar a resolução para a seção óptica. Se necessário, ajuste os valores com base no brilho da amostra. Para definir o tempo de moradia dos pixels, comece com cerca de dois tempos de moradia de microsegundos e ajuste para refletir o brilho da amostra conforme necessário.
Para selecionar o tamanho do pixel para o objetivo selecionado, deixe o instrumento calcular o tamanho do pixel através do botão de opção Nyquist e o número selecionado de pixels na imagem. Em seguida, selecione a opção Digitalizar e inicie a coleta de dados. Use o botão de foco para localizar o plano focal representando as características das amostras em sua forma mais clara, o botão Digitalizar para iniciar a coleta de dados e o botão Capturar para capturar uma imagem bidimensional.
Usando o painel que controla o tamanho do pixel através da opção Nyquist, reduza o tamanho da área da varredura para envolver apenas uma única célula. Ative a ferramenta de coleta e use uma opção inferior a superior, com apenas a linha laser que ilumina um recurso na amostra mais claramente, defina os planos de partida e acabamento para que o volume seja medido usando o espaçamento sugerido entre os planos. Nomeie o arquivo e salve-o na pasta associada.
Alternativamente, se nosso conhecimento priori sobre a espessura das amostras existir, selecione o plano mais brilhante, mais afiado e médio, ajustando o foco para definir o volume e definir a parte superior para ter a espessura da amostra acima do plano médio, e a parte inferior para ter a espessura abaixo do plano médio, em seguida, selecione o tamanho do passo apropriado. Execute a aquisição pressionando o botão Executar Agora. Quando a aquisição terminar, salve o arquivo na pasta apropriada.
No final do experimento, use luvas enquanto remove o bloco de vidro e coloque-o na estação de montagem. Use pinças com apertos de borracha para remover cuidadosamente o chip AFM e coloque a ponta usada de volta na localização da caixa de armazenamento orientada para denotar que foi usada. Para referência futura, note qual dica foi usada no experimento.
Aqui, um exame AFM representativo sobre uma célula HEK viva é mostrado. A altura desta célula HEK em particular foi de cerca de 10 mícrons, como demonstrado pela varredura de linha. Aqui, um exemplo de uma varredura ruim devido a uma escolha de ponta AFM inadequada pode ser observado.
Nesta imagem, pixels pretos apareceram no ápice da célula indicando que a zona AF PA estava fora de alcance devido a uma grande altura celular. A extremidade do cantilever AFM também aparece na imagem por causa do deslocamento da ponta combinado com uma altura de ponta insuficiente em comparação com a altura da célula. Estes artefatos na imagem AFM indicam que uma dica AFM diferente deveria ter sido escolhida para a imagem da célula.
Podem ser realizadas imagens confocal de três cores. Por exemplo, para visualizar o núcleo celular, micro túbulos e membrana lipofílica. A análise das recuos de ponta em combinação com o modelo nano mecânico, permite a geração de um mapa de módulo da superfície.
Aqui, uma projeção 3D correspondente da pilha Z confocal a laser é mostrada. As varreduras afm e mapas de módulo medido também podem ser adquiridas para micróbios, como observado nesta análise representativa da bactéria streptococcus mutans. Como demonstrado, uma melhor resolução pode ser alcançada nesta escala com a AFM, do que com a tradicional microscopia confocal.
O mapeamento de força adesiva é uma técnica realizada através de conpokal para visualizar interações moleculares. Por exemplo, estudar a modulação de moléculas de superfície celular para observar cinéticas de ligação. A Conpokal inaugura um novo caminho para explorar as relações de função da estrutura na microbiologia médica.
Por exemplo, eventos físicos e químicos e a camada peptidoglycan, podem estar ligados à resistência a antibióticos.
Visão Geral
A técnica Conpokal integra microscopia confocal e microscopia de força atômica, permitindo a obtenção quase simultânea de imagens e a caracterização mecânica de amostras biológicas vivas. Este método aprimora o estudo de processos celulares ao fornecer informações detalhadas sobre propriedades mecânicas juntamente com imagens de fluorescência.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Mecanobiologia
- Imagem Celular
- Caracterização Biofísica
Antecedentes
- Conpokal combina duas técnicas poderosas de microscopia.
- Permite a co-localização de fluorescência com caracterização mecânica.
- Essa técnica é particularmente útil para estudar células cerebrais em condições fisiológicas.
- Permite aos pesquisadores examinar impulsos elétricos e transações de força em células vivas.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo para a técnica Conpokal.
- Demonstrar as vantagens da microscopia dual na pesquisa biológica.
- Facilitar a compreensão dos mecanismos e processos celulares.
Métodos Utilizados
- Seleção e montagem de cantilevers de AFM.
- Calibração do sistema de AFM.
- Configuração e otimização da imagem confocal.
- Procedimentos de coleta e análise de dados.
Resultados Principais
- Integração bem-sucedida da imagem confocal e de AFM.
- Demonstração do mapeamento de propriedades mecânicas de células vivas.
- Compreensão aprimorada do comportamento celular sob estresse mecânico.
- Oferecimento de um protocolo detalhado para reprodutibilidade na pesquisa.
Conclusões
- A técnica Conpokal é uma ferramenta valiosa na mecanobiologia.
- Ela permite a análise abrangente da mecânica e dos processos celulares.
- Este método pode levar a novas descobertas na pesquisa biológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O Conpokal permite a aquisição quase simultânea de imagens por microscopia confocal e por microscopia de força atômica, fornecendo dados mecânicos e de fluorescência co-localizados de células vivas. Essa abordagem de dupla modalidade auxilia na redução de riscos mecanicistas na validação de alvos ao associar estruturas subcelulares a propriedades mecânicas em escala nanométrica, como módulo elástico e adesão. A técnica aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao permitir a correlação direta entre a dinâmica do citoesqueleto e a transmissão de forças em condições fisiologicamente relevantes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao correlacionar a organização do citoesqueleto com respostas mecânicas localizadas em células vivas.
- Valor Operacional: Permite o mapeamento de propriedades mecânicas em áreas específicas (por exemplo, módulo de elasticidade, adesão) juntamente com sinais de fluorescência subcelular.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos ao revelar como perturbações moleculares afetam os mecanofenótipos celulares em condições próximas às fisiológicas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas de células vivas validados para leituras nanomecânicas quantitativas que complementam ensaios baseados em fluorescência.
- Valor Operacional: Padroniza a interação sonda-amostra por meio da seleção calibrada de cantilevers de AFM e parâmetros controlados de indentação.
- Valor de Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma em diferentes tipos celulares (por exemplo, células HEK, Streptococcus mutans) para fenotipagem mecânica consistente.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Relaciona mapas mecânicos em escala nanométrica (por exemplo, módulo, adesão) com componentes subcelulares por meio da co-localização de fluorescência, apoiando o alinhamento de biomarcadores em mecanobiologia.
- Continuidade Pré-clínica: Permite a avaliação longitudinal das respostas celulares a perturbações mecânicas ou químicas em amostras microbiológicas vivas.
- Avanço com Ajuste de Risco: Identifica relações estrutura-função (por exemplo, alterações na camada de peptidoglicano associadas à resistência a antibióticos) que orientam decisões de prosseguir/não prosseguir no desenvolvimento de agentes antimicrobianos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Conpokal se insere no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, fornecendo dados mecânicos e de imagem ortogonais da mesma região celular.
- Biologia da Descoberta: Apoia a elucidação de vias ao visualizar como fármacos citoesqueléticos ou edições genéticas alteram a rigidez local e a adesão em células vivas.
- Triagem: Fornece saídas nanomecânicas quantitativas e reprodutíveis (por exemplo, mapas de força, distribuições de módulo) quando os parâmetros de microscopia de força atômica (AFM) são padronizados e calibrados.
- Análises: Gera conjuntos de dados com localização coincidente, nos quais propriedades mecânicas são diretamente sobrepostas a sinais confocais (por exemplo, tubulina, núcleo, membrana) para análise multiparamétrica.
- Pesquisa Translacional: Relaciona fenótipos nanomecânicos a sistemas relevantes para doenças (por exemplo, biofilmes microbianos, culturas neuronais) somente quando apoiado por leituras paralelas de fluorescência.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável em instalações centrais para fenotipagem mecanobiológica em diversos modelos de células vivas, sem necessidade de fixação de amostras ou artefatos induzidos por fixação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao vincular diretamente estruturas identificadas por fluorescência às propriedades mecânicas quantificadas em resolução subcelular.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da calibração padronizada da ponta de AFM, alinhamento do laser e zeragem da deflexão antes da aquisição de dados.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao fornecer evidências precoces e multiparamétricas dos efeitos do engajamento do alvo sobre a mecânica celular.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em sua capacidade de normalizar mecanofenótipos patológicos em modelos de células vivas relevantes para a doença.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em microscopia confocal e em microscopia de força atômica, incluindo seleção de sondas e segurança com laser.
- Depende de instrumentação capaz de integração de modalidades quase simultânea, incluindo estágios de varredura sincronizados e sistemas de detecção dupla.
- Necessita padronização entre equipes dos parâmetros de indentação (ponto de ajuste, comprimento Z, tempo por pixel) para mapeamento mecânico reprodutível entre laboratórios.
- Requer adaptação da rigidez da ponta do cantiléver e da geometria da ponta para corresponder à topografia da amostra (por exemplo, evitando artefatos de deslocamento da ponta em células altas, como HEK).
- Limitação prática: o mapeamento mecânico preciso depende do contato adequado entre a ponta e a amostra e da prevenção de artefatos causados por altura insuficiente da ponta ou saturação da zona de PA, conforme demonstrado em varreduras falhas.
