Name: Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Aprenda a usar microscopia de super-resolução SIM para estudar co-localização de proteínas em neurônios primários de hipocampo de camundongo. Este método permite visualizar interações sinápticas com resolução de aproximadamente 100 nanômetros.

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Os autores agradecem a Edoardo Micotti pela crítica construtiva ao manuscrito. Este estudo foi apoiado pela BrightFocus A2019296F, por Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), pela Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) e pela Rede de Treinamento Inovador Marie Skłodowska-Curie (JK).

1. Culturas primárias
<ol><li>Neurônios primários hipocampais de rato de cultura em tampas câmaras (como Ibidi μ-Slide 8 Bem ou Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) que correspondem ao requisito objetivo para #1,5 (0,17 mm) de espessura de deslizamento.</li>
	<li>Tampas de câmara de revestimento com 100 μL de poli-L-lisina (100 μg/mL).</li>
	<li>No dia seguinte, lave as tampas câmara duas vezes com soro fisco estéril tamponado (PBS).</li>
	<li>Para obter neurônios primários do camundongo, isole o hipocampi dos filhotes P1-P423.</li>
	<li>Coloque hipocampi dissecado em 10 mL de Mídia de Dissecção (Tabela 1) e deixe-os depositar na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Usando uma pipeta estéril, remova cuidadosamente a Mídia de Dissecção, deixando o hipocampi intacto na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Adicione 10 mL de Media 1 (Tabela 1) ao hipocampi e incubar por 30 minutos a 37 °C.</li>
	<li>Usando uma pipeta estéril, remova cuidadosamente a Media 1, deixando o hipocampi intacto na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Adicione 10 mL de Media 2(Tabela 1) e deixe o tubo de centrífuga (tampado) sob o capô horizontalmente por 45 minutos.</li>
	<li>Deixe o tubo de centrífugas ficar verticalmente para permitir que o tecido se instale na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Usando uma pipeta estéril, remova cuidadosamente a Media 2, deixando o hipocampi intacto na parte inferior do tubo centrífuga.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de Media 3(Tabela 1).</li>
	<li>Usando uma pipeta p1000 com ponta filtrada, dissociar mecanicamente células do tecido.</li>
	<li>Transfira o supernante, no qual estão localizados os neurônios isolados, para um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular por 2 min a 300 x g em temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Após a centrifugação, as células estão localizadas na parte inferior do tubo de centrífuga. Usando uma pipeta estéril, descarte o supernaspeso.</li>
	<li>Células resuspend em 1 mL de Media 4.</li>
	<li>Use um filtro de 70 μm para eliminar células não dissociadas.</li>
	<li>Conte células viáveis em uma câmara de Bürker adicionando 1 μL de solução azul trypan de 0,4 % a 19 μL da suspensão celular.</li>
	<li>Células de placa a 70.000 células/bem em um volume de 200 μL por poço.</li>
	<li>Deixe as células anexar por 2h em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Retire as tampas câmaradas da incubadora e substitua cuidadosamente o meio por 200 μL de Mídia de Cultura.</li>
	<li>Deixe as tampas em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Substitua um terço do meio por novas mídias culturais a cada 5-7 dias.</li>
	<li>Espere até que os neurônios primários hipocampais estejam totalmente maduros (12-14 dias após o revestimento) para realizar estudos de co-localização.</li>
</ol>2. Coloração de imunofluorescência
<ol><li>Pegue as tampas de câmara da incubadora.</li>
	<li>Remova o meio.</li>
	<li>Lave rapidamente os poços com 200 μL de PBS.</li>
	<li>Adicione 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS (200 μL/bem) aos neurônios para corrigi-los rapidamente.</li>
	<li>Incubar as células por 15 minutos na RT.</li>
	<li>Remova a solução PFA.</li>
	<li>Permeabilize as células adicionando PBS com Triton X-100 (200 μL/well).</li>
	<li>Incubar por 1 min na RT.</li>
	<li>Remova a solução e incuba as amostras com 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS (200 μL/well) por 1 h em RT para cobrir passivamente todas as superfícies de ligação livre da placa com uma proteína irrelevante para a análise. Um buffer de bloqueio baseado em BSA sem Triton X-100 reduz o fundo do anticorpo de forma mais eficiente do que o mesmo buffer com Triton X-100 de 0,2%.</li>
	<li>Remova a solução.</li>
	<li>Adicione o anticorpo primário de escolha diluído em uma solução PBS contendo 1% BSA e 0,2% Triton X-100 (120-200 μL/bem, dependendo da diluição e disponibilidade de anticorpos). Incubar as amostras por 2h.<ol>
<li>Como controle negativo, não adicione nenhum anticorpo primário a um dos poços. Vários anticorpos de diferentes espécies contra alvos diferentes podem ser usados ao mesmo tempo. Use um anticorpo contra MAP2 (um marcador neuronal) criado em frango, um anticorpo contra PSD95 ou sinaptofisina criada em camundongos, e um anticorpo contra uma proteína alvo levantada em coelho. Isso permite análises sim de três cores.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave rapidamente os poços três vezes com PBS (200 μL/well).</li>
	<li>Adicione anticorpos secundários (anticorpos secundários dyLight e Alexa podem ser ambos diluídos) diluídos em uma solução PBS contendo 1% BSA e 0,2% Triton X-100 (200 μL/well). Incubar as amostras por 1h na RT.</li>
	<li>Lave rapidamente os poços três vezes com PBS (200 μL/well).</li>
	<li>Adicione corante Hoechst a uma concentração de 1 μg/mL diluída em PBS (200 μL/well) para colorir núcleos. Incubar as amostras por 10 minutos na RT.</li>
	<li>Lave rapidamente os poços duas vezes com PBS.</li>
	<li>Monte células usando um montador compatível com SIM. Use 10 μL/well de ProLong Glass Antifade Mountant.</li>
	<li>Cubra e proteja as células com um óculos de cobertura (por exemplo, um copo de cobertura redondo com um diâmetro de 8 mm). Os quadrados também podem ser usados.</li>
	<li>Armazene as tampas em câmara no RT e espere pelo menos 48h antes de adquirir imagens. A Diamond Glass requer pelo menos dois dias de cura antes das aquisições de super resolução.</li>
</ol>3. Controle de especificidade de anticorpos
NOTA: Use duas estratégias para garantir a especificidade do anticorpo. A primeira estratégia é usar pelo menos dois anticorpos diferentes visando o mesmo substrato. A segunda estratégia é a neutralização de anticorpos por incubação com o alvo proteico purificado ou o epítope usado para elevar o anticorpo.
<ol><li>Incubar o anticorpo de escolha com cinco vezes mais do alvo recombinante ou epítope por 1 h em RT em 1% de BSA na PBS.</li>
	<li>Após a incubação, use o anticorpo neutralizado na concentração usual para coloração conforme descrito acima de 2,11.</li>
</ol>4. Calibração do microscópio
NOTA: Usamos rotineiramente um sistema de microscópio de super resolução N-SIM fabricado pela Nikon para os estudos de super-resolução. No entanto, várias outras empresas também oferecem microscópios de super resolução em seus catálogos. Embora as indicações específicas para o sistema N-SIM da Nikon sejam descritas, as instruções a seguir podem ser generalizadas para outros sistemas. Antes da aquisição de imagens SIM, o sistema requer uma calibração adequada com contas fluorescentes específicas de tamanho de sub-resolução. Um exemplo são as microesferas tetraspeck. Estas contas são manchadas com diferentes corantes fluorescentes para permitir a calibração de diferentes lasers com uma amostra.
<ol><li>Em um banho de água sonicate em torno de 1,8 x 108 microesferas fluorescentes por 10 minutos. O sistema N-SIM da Nikon requer uma amostra de contas multicoloridas pouco povoadas para a calibração. Isso pode diferir para outros sistemas que requerem uma densa camada única de contas fluorescentes de tamanho de sub-resolução. Ajuste o número de partículas fluorescentes de acordo.</li>
	<li>Diluir as microesferas fluorescentes 1:500 em água dupla destilada.</li>
	<li>Sonicate uma segunda vez por mais 10 minutos.</li>
	<li>Pipet 15 μL das contas diluídas em um poço de um deslizamento de cobertura câmara.</li>
	<li>Deixe a solução secar por 5 minutos na RT.</li>
	<li>Adicione 10 μL da solução de montagem e coloque uma tampa de 8 mm por cima.</li>
	<li>Aguarde pelo menos 48 horas para permitir a cura adequada.</li>
	<li>Ligue o microscópio e os lasers.</li>
	<li>Deixe o sistema aquecer para alcançar o equilíbrio térmico de todos os componentes do microscópio. O sistema de microscópio de super-resolução N-SIM requer pelo menos 3 horas.</li>
	<li>Selecione o objetivo de 100x.</li>
	<li>Inicie a calibração alinhando os lasers ao centro do bloco de grade de difração. No sistema N-SIM, um botão de micrômetro e uma câmera dedicada permitem o centro dos feixes de luz para o alvo.</li>
	<li>Insira a tampa de câmara no microscópio para visualização. Ajuste o sistema para a espessura da tampa de câmara, ajustando a coleira de correção objetiva. O software NIS, o software proprietário fornecido com sistemas de microscópio de super-resolução N-SIM, tem uma função automática para regular colares de correção.</li>
	<li>Ajuste o foco do bloco de grade para cada canal para garantir a iluminação de padrão estruturado focalizada na amostra. O software NIS fornece uma função automática para esta tarefa.</li>
	<li>Em seguida, adquira imagens 3D-SIM brutas das microesferas multicoloridas. Reconstrua as imagens brutas para obter uma imagem super-resolvida usando o software de microscópio ou a plataforma de software de código aberto para a análise de imagens biológicas ImageJ24 e o plugin fairSIM25.</li>
	<li>Calcule, para cada comprimento de onda separado, a transformação fourier da imagem super-resolvida obtida em 4.14. Se a imagem transformada não conseguir um padrão correto semelhante a uma flor, reinicie a calibração a partir de 4.11, uma vez que a super-resolução não foi alcançada.</li>
	<li>Na imagem super resolvida, selecione uma única microesfera e calcule seu perfil de intensidade para cada canal para medir a resolução alcançada. Agora deve estar perto de 100 nm lateralmente.</li>
	<li>Em seguida, realize o registro do canal sobrepondo uma aquisição multicanal das microesferas. O objetivo é reunir todos os sinais do canal lateralmente e axily. Isso eliminará as aberrações cromáticas devido ao desalinhamento dos diferentes canais e ajudará na análise de co-localização.</li>
	<li>Confirme a qualidade da calibração usando as funções "Passos de Fase de Iluminação" e "Foco de Padrão de Iluminação" do SIMcheck26, um conjunto de plugins para o aplicativo de código aberto ImageJ. Para isso, prepare um clipe de cobertura com câmara para obter uma densa camada única de microesferas TetraSpeck e adquira uma imagem 3D-SIM da amostra. Analise a imagem no ImageJ e, se forem detectadas aberrações, reinicie a calibração do microscópio a partir da etapa 4.11.</li>
</ol>5. Aquisição
<ol><li>Comece a analisar a amostra usando um objetivo de 40x no modo confocal ou widefield. Isso permite a navegação para a amostra, mantendo bons detalhes e um grande campo de visão.</li>
	<li>Use o sinal de anticorpos MAP2 para identificar uma área que represente processos neuronais.</li>
	<li>Adquira imagens da amostra no modo confocal para determinar a qualidade da coloração. A má qualidade confocal refletirá na má qualidade do SIM, exigindo, portanto, que as amostras sejam descartadas.</li>
	<li>Se a área e a qualidade das imagens forem satisfatórias, mude o objetivo para 100x.</li>
	<li>Aplique óleo ao objetivo de 100x.</li>
	<li>Adquira uma imagem widefield ou confocal que será usada posteriormente para avaliar a qualidade da imagem super-resolvida (Figura 1A,B).</li>
	<li>Mude para o modo 3D-SIM.</li>
	<li>Usando janelas de diálogo para definir parâmetros para aquisição, selecione a configuração de profundidade de bit mais alta disponível para maximizar as informações de cores. Normalmente, 16 bits é a escolha padrão. Além disso, para melhorar a relação sinal-ruído, selecione um baixo valor de frequência para aquisição, como 1 MHz.</li>
	<li>Usando janelas histogramas, defina lasers para obter uma resposta linear do sinal. Para evitar a perda de informações, limite pixels saturados nas imagens. O sistema N-SIM usa uma câmera Andor iXon3. Ao trabalhar em 16 bits, escolha uma intensidade de destino de 16.000 para garantir a resposta linear da câmera. Alternativamente, escolha uma faixa entre 30.000-45.000 para maximizar o alcance dinâmico da aquisição.</li>
	<li>Defina a potência laser entre 0,1% e 50% ao fotografar as amostras e os tempos de exposição entre 50 e 2 s. Potências a laser acima de 50% podem causar fotobleachamento rápido dos fluoroforos em uso.</li>
	<li>Comece a adquirir as imagens no modo 3D-SIM.</li>
	<li>Use o SIMcheck, um conjunto de plugins gratuitos para ImageJ, para avaliar a qualidade da aquisição das imagens brutas.</li>
	<li>Se o SIMCheck não detectar quaisquer artefatos ou problemas de qualidade, adquira um mínimo de 10 imagens de 4 réplicas técnicas para permitir a análise estatística.</li>
</ol>6. Pós-produção: reconstrução de imagem
NOTA: As imagens adquiridas 3D-SIM são imagens brutas que precisam ser processadas para obter imagens super-resolvidas reconstruídas. A reconstrução incorreta de imagens brutas pode levar a artefatos que afetariam a análise das amostras. Deve-se, portanto, prestar muita atenção à escolha adequada dos parâmetros de reconstrução.
<ol><li>Processe as imagens brutas usando o software de análise de reconstrução do microscópio para obter uma imagem super-resolvida(Figura 1C). Alternativamente, use o plugin ImageJ livremente disponível fairSIM para reconstruir imagens brutas.</li>
	<li>Calcule a transformação Fourier das imagens super-resolvidas usando o software de reconstrução do microscópio ou o plugin ImageJ SIMCheck. Uma boa imagem reconstruída deve retornar, para cada canal, uma imagem semelhante a uma flor. Se as imagens reconstruídas não recriarem uma forma semelhante a uma flor, reiniciem a partir das imagens brutas e reconstruam-nas modificando os parâmetros de reconstrução, como filtragem de Wiener, apodização e supressão de ordem zero27. No software NIS, usando a visualização para monitorar como a alteração dos parâmetros afeta a imagem final resolvida, modifique os parâmetros i) Contraste de Modulação de Iluminação, ii) Supressão de Ruído de Alta Resolução e iii) Supressão de Foco.</li>
	<li>Em seguida, analise a imagem reconstruída para detectar artefatos imparcialmente usando NanoJ-SQUIRREL28, um plugin baseado em ImageJ para avaliar a qualidade de imagens super-resolvidas.</li>
	<li>Se o NanoJ-SQUIRREL detectar artefatos, reinicie-os a partir das imagens brutas e reconstrua-os modificando os parâmetros de reconstrução, como filtragem de Wiener, apodização e supressão de ordem zero. No software NIS, usando a visualização para monitorar como a alteração dos parâmetros afeta a imagem final resolvida, modifique os parâmetros Contraste de Modulação de Iluminação, Supressão de Ruído de Alta Resolução e Supressão de Foco.</li>
	<li>Use as imagens super resolvidas para calcular o perfil de co-localização e/ou os coeficientes de Pearson e Mander.</li>
</ol>7. Co-localização com análise de perfil
NOTA: Como primeiro passo para estudar a co-localização entre marcadores sinápticos e uma proteína de interesse, pegue uma imagem super resolvida e analise um único lócus para determinar a sobreposição de sinal.
<ol><li>Identifique um único lócus na imagem super resolvida.</li>
	<li>Obtenha os perfis de intensidade dos sinais fluorescentes do lócus de interesse.</li>
	<li>Exportar os dados.</li>
	<li>Use o GraphPad Prism, ou um software de análise semelhante, para normalizar todos os picos de sinal e obter intensidades de sinal comparáveis para cada canal com o objetivo final de determinar a co-localização específica do lócus.</li>
</ol>8. Quantificação dos coeficientes de Pearson e Mander
NOTA: Se a análise do perfil tiver sugerido a co-localização do locus único, uma análise mais geral de toda a imagem pode ser realizada calculando os coeficientes de Pearson e Mander29,30.
<ol><li>Use o JACoP31, um plug-in ImageJ, para determinar os dois parâmetros de co-localização: Pearson's e Mander's.</li>
</ol>9. Análise estatística
<ol><li>Use o GraphPad Prism, ou um software de análise e gráfico semelhante, para processar dados coletados com JACoP.</li>
	<li>Utilize pelo menos 40 imagens SIM para cada condição analisada para obtenção de gráficos e para relevância estatística.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Elucidar a estrutura e a composição da sinapse é crucial para a compreensão dos processos fisiológicos e patológicos que regulam a memória e a cognição. Enquanto no estado normal, as sinapses são os blocos de construção da memória, elas também estão por trás de distúrbios neurológicos complexos, como a doença de Alzheimer32. O protocolo descrito aqui serve para estudar a co-localização de proteínas neuronais com uma técnica de microscopia de super resolução chamada SIM. Utilizando um padrão partic...

A compreensão e visão da sinapse mudou enormemente desde sua primeira descrição por1Foster e Sherrington em 18971 . Desde então, nosso conhecimento da comunicação neuronal e dos processos moleculares por trás dela tem crescido exponencialmente2. Tornou-se claro que as sinapses podem ser consideradas como um sistema de dois compartimentos: um compartimento pré-sináptico contendo vesículas para a liberação de neurotransmissores e um compartimento pós-sináptico com receptores3. Essa visão simplista, nos últimos vinte anos, evoluiu para uma complexa rede de proteínas necessárias para transdutor de transmissão ligado à sinalização4.
Os ganhos no entendimento se devem, em parte, às técnicas de super-resolução que superaram o limite de difração da microscopia de luz convencional para se adequar melhor à dimensão das sinapses5,,6,,7,,8,,9,,10. Devido ao limite de difração, um microscópio óptico não pode atingir uma resolução acima de 200 nm lateralmente11,12. Para contornar esse limite, foram criadas técnicas de super-resolução, utilizando diferentes abordagens e atingindo diferentes resoluções de limite de subditração: SIM, STED (Estimulada Microscopia de Esgotamento de Emissões), PALM (Microscopia de Localização FotoAtivada) e STORM (Microscopia óptica de Reconstrução Estocástica)13,14. O SIM dobra a resolução espacial de sistemas de microscopia de campo largo baseados em laser inserindo uma grade de difração no feixe de excitação15. A grade móvel difunde os raios laser para criar um padrão de iluminação conhecido, geralmente listras. Este padrão de luz estruturado propositalmente é sobreposto à distribuição espacial desconhecida do corante fluorescente (da amostra). As franjas de interferência formadas pelos dois padrões codificam para detalhes finos indistinguíveis com microscopia de campo largo normal. A imagem super-resolvida final é obtida pela combinação e decodificação com métodos matemáticos várias imagens brutas da mesma amostra obtidas pelas traduções e rotações da grade de difração. A resolução das imagens super-resolvidas atinge 100 nm na lateral e 500 nm nas direções axial para 2D-SIM15 ou 100 nm na lateral e 250 nm nas direções axial para 3D-SIM16.
O novo entendimento da sinapse é ainda mais importante à luz das muitas doenças neurológicas onde a disfunção sináptica desempenha um papel importante no início e progressão17,18. Doença de Alzheimer, Síndrome de Down, Doença de Parkinson, doenças de príon, epilepsia, transtornos do espectro autista e síndrome do X frágil, entre outros, têm sido associadas a anormalidades na composição sináptica, morfologia e função19,,20,,21,22.
Recentemente, utilizando um conjunto de anticorpos específicos do SUMH, usamos o SIM para mostrar a co-localização nos neurônios hipocampais primários das proteínas SUMO com os marcadores pré e pós-sináptico sinaptophysin e PSD95 no nível de super resolução23. Isso nos permitiu confirmar evidências de microscopia bioquímica e confocal da localização do SUM nos neurônios.
Aqui, descrevemos um protocolo para estudar a localização de proteínas em neurônios primários hipocampais de camundongos. Ao mesmo tempo, este protocolo pode ser adaptado a diferentes tipos de culturas neuronais primárias.

<table><tbody><tr><td>Solução de azul de tripano a 0,4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>70 &micro; Filtro M&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Alexa</td><td>Thermo Fisher Anticorpo</td><td></td> <td>Científico-Anticorpo</td></tr><tr><td>SENP1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-271360</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Químico Albumina de soro bovino&nbsp;</td><td>Merck</td><td>5470</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Life Science</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Chemical Chambered Covers,</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>DyLight</td><td>Thermo Fisher</td><td></td> <td>Scientific-Antibody</td></tr><tr><td>FBS (Hyclone)</td><td>GIBCO</td><td>SH3007002 (CHA1111L)</td><td>Serum</td></tr><tr><td>Microesferas modificadas com carboxilato FluoSpheres, 0,1 &mu; m, amarelo&ndash; verde fluorescente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8803</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Merck Life Science</td><td>G8769</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck Life Science</td><td>H3537</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>L-Cystein&nbsp;</td><td>Merck Ciências da Vida&nbsp;</td><td>C6852-25g</td><td>Químico</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Merck</td><td>AB15452</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21575022</td><td>Médio</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Merck Life Science</td><td>M8266</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>VWR International</td><td>1,091,371,000</td><td>Microscópio</td></tr> de <tr><td>Super Resolução Medium N-SIM</td> 10888022 Life Technologies <td>Nikon-Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Papain</td><td>Merck Life Science& nbsp;</td><td>P-3125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído químico&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Caneta/Strep Químico</td></tr><tr><td>10x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Químico tamponado com fosfato salino&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Poly-L lisina</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>Montagem</td></tr><tr><td>Antifade de Vidro de Diamante ProLong</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>PSD95&nbsp;</td><td>NeuroMab</td><td>K28/43</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Cobertura redonda de lamínula</td><td>Thermo</td><td>12052712</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>SUMO1</td><td>Abcam</td><td>ab32058</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Sinaptofisina&nbsp;</td><td></td><td>Merck S5768&nbsp;</td><td>anticorpo</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td>Inibidor de</td></tr><tr><td>tripsina química&nbsp;</td><td>Merck Ciências da Vida&nbsp;</td><td>T9003-500MG</td><td>Químico</td></tr></tbody></table>

imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Sinapses são os elementos funcionais dos neurônios e seus defeitos ou perdas são a base de várias doenças neurodegenerativas e neurológicas. Estudos de imagem são amplamente utilizados para investigar sua função e plasticidade em condições fisiológicas e patológicas. Devido ao seu tamanho e estrutura, estudos de localização de proteínas requerem técnicas de imagem de alta resolução. Neste protocolo, descrevemos um procedimento para estudar em neurônios primários a co-localização de proteínas-alvo com marcadores sinápticos em um nível de super-resolução utilizando microscopia de iluminação estruturada (SIM). SIM é uma técnica de iluminação de luz padronizada que dobra a resolução espacial da microscopia de campo largo, atingindo um detalhe de cerca de 100 nm. O protocolo indica os controles e configurações necessários para estudos robustos de co-localização e uma visão geral dos métodos estatísticos para analisar adequadamente os dados de imagem.

Apresentamos aqui o fluxo de trabalho padrão para estudar a co-localização das proteínas neuronais. Primeiro calibramos o microscópio e, em seguida, realizamos a análise sim das amostras. Para calibrar o sistema, utilizamos microesferas fluorescentes de 0,1 μm de diâmetro. Ao obter imagens 3D-SIM super resolvidas das contas, os dados de imagem subjacentes são transformados em Fourier para recon converter-nas em uma representação de frequência espacial. Na Figura 2A,o padrão de flores distint...

Este protocolo mostra como empregar microscopia de super-resolução para estudar a co-localização de proteínas em culturas neuronais primárias.

Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Sinapses são os elementos funcionais dos neurônios e seus defeitos ou perdas são a base de várias doenças neurodegenerativas e neurológicas. Estudos de imagem são amplamente utilizados para investigar sua função e plasticidade em condições fisiológicas e patológicas. Devido ao seu tamanho e estrutura, estudos de localização de proteínas requerem técnicas de imagem de alta resolução.Neste protocolo, descrevemos um procedimento para estudar em neurônios primários a co-localização de proteínas-alvo com marcadores sinápticos em um nível de super-resolução usando microscopia de iluminação estruturada. SIM é uma técnica de iluminação de luz padronizada que dobra a resolução espacial da microscopia widefield, atingindo um detalhe de cerca de 100 nanômetros. O protocolo indica os controles e configurações necessários para estudos robustos de co-localização e uma visão geral dos métodos estatísticos para analisar adequadamente os dados de imagem.A chave para permitir a análise em nível de super-resolução é, no entanto, os reagentes utilizados durante a aquisição, como tampas câmaradas e soluções de montagem compatíveis com o índice de difração do objetivo. Para obter um neurônio primário hipocampal de camundongos, isole o hipocampi de filhotes P1 a P4. Células de placa a 70.000 células por poço em um volume de 200 microliters por poço.Espere até que os neurônios primários hipocampal estejam totalmente maduros 12 a 14 dias após o revestimento para realizar estudos de co-localização. Adicione 4% de paraformaldeído, PFA, em microlitrais PBS 200 por poço aos neurônios para corrigi-los rapidamente. Remova a solução e incuba as amostras com 1%de albumina de soro bovino, BSA, em PBS a 200 microliters por poço durante uma hora à temperatura ambiente para cobrir passivamente todas as superfícies de ligação livre da placa com uma proteína irrelevante para a análise.Um buffer de bloqueio baseado em BSA sem Triton X-100 reduz o fundo do anticorpo de forma mais eficiente do que o mesmo buffer com 0,2% Triton X-100. Adicione o anticorpo primário. Como controle negativo, não adicione nenhum anticorpo primário a um dos poços.Montagem de células usando um montador compatível com SIM, por exemplo, ProLong Glass Antifade Mountant. Cubra e proteja as células com um óculos de cobertura, por exemplo, uma tampa redonda com um diâmetro de oito milímetros.Os quadrados também podem ser usados. Armazene as tampas em câmara à temperatura ambiente e espere pelo menos 48 horas antes de adquirir imagens. O vidro diamante requer pelo menos dois dias de cura antes das aquisições de super resolução.Use duas estratégias para garantir a especificidade do anticorpo. O primeiro é o uso de pelo menos dois anticorpos diferentes visando o mesmo substrato. A segunda estratégia é a neutralização de anticorpos por incubação com o alvo proteico purificado, ou o usado para elevar o anticorpo.Usamos rotineiramente um microscópio de super resolução N-SIM fabricado pela Nikon para nossa análise. As instruções a seguir devem ser destinadas à aquisição de imagens SIM independentemente do microscópio de uso. Também é importante maximizar o desempenho do microscópio para realizar uma calibração precisa dos instrumentos, incluindo anel de correção, alinhamento a laser e foco de bloco de grade.Antes da aquisição de imagens SIM, o sistema requer uma calibração adequada com contas fluorescentes específicas de tamanho de sub-resolução. Um exemplo são as microesferas tetraspeck. Estas contas são manchadas com diferentes corantes fluorescentes para permitir a calibração de diferentes lasers com uma amostra.Em um banho de água, sonicar cerca de 1,8 vezes 10 para a 8ª microesferas fluorescentes por 10 minutos. Diluir as microesferas fluorescentes uma em 500 em água dupla destilada. Sonicate uma segunda vez por mais 10 minutos.Pipeta 15 microliters das contas diluídas em um poço de um deslizamento de cobertura câmara. Deixe a solução secar por cinco minutos em temperatura ambiente. Adicione 10 microliters da solução de montagem, por exemplo.ProLong Glass, e coloque uma tampa de oito milímetros em cima. Espere pelo menos 48 horas para permitir uma cura adequada. Ligue o microscópio e os lasers.Deixe o sistema aquecer para alcançar o equilíbrio térmico de todos os componentes do microscópio e o sistema de microscópio de super resolução SIM requer pelo menos três horas. Selecione o objetivo de 100X. Inicie a calibração alinhando os lasers ao centro do bloco de grade de difração.No sistema N-SIM, um botão de micrômetro e uma câmera dedicada permitem o centro dos feixes de luz para o alvo. Insira a tampa de câmara do microscópio para visualização. Ajuste o sistema para a espessura do deslizamento de tampas câmara, ajustando a tampa de correção objetiva.O NIS Software, software proprietário fornecido com sistemas de microscópio de super resolução N-SIM, tem uma função automática para regular a correção de cores. Ajuste o foco do bloco de grade para cada canal para garantir a iluminação de padrão estruturado focalizada na amostra. O software fornece uma função automática para esta tarefa.Adquira imagens SIM 3D brutas das microesferas multicoloridas. Calcule para cada comprimento de onda separado a transformação Fourier da imagem super resolvida. Se a imagem transformada não conseguir um padrão correto semelhante a uma flor, reinicie a calibração, uma vez que a super-resolução não foi alcançada.Na imagem super resolvida, selecione uma única microesfera e calcule seu perfil de intensidade para cada canal para medir a resolução alcançada. Agora deve estar perto de 100 nanômetros lateralmente. Realize o registro do canal sobrepondo uma aquisição multicanal das microesferas.O objetivo é reunir todos os sinais do canal lateralmente e axily. Isso eliminará as aberrações cromáticas devido ao desalinhamento dos diferentes canais e ajudará na análise de co-localização. Confirme a qualidade da calibração usando a etapa de fase de iluminação das funções e o foco padronizado de iluminação do SIMcheck, um conjunto de plugins para o aplicativo de código aberto ImageJ.Comece a analisar a amostra usando um objetivo de 40X no modo confocal ou widefield. Isso permite a navegação da amostra, mantendo bons detalhes e um grande campo de visão. Use o sinal de anticorpos MAP2 para detectar uma área que represente processos neuronais.Adquira imagens da amostra no modo confocal para determinar a qualidade da coloração. Mude para o objetivo 100X. Aplique óleo ao objetivo de 100X.Adquira uma imagem widefield ou confocal que será usada mais tarde para avaliar a qualidade da imagem super-resolvida. Mude para o modo SIM 3D. Usando janelas de diálogo para definir os parâmetros para aquisição, selecione a configuração de profundidade de bit mais alta disponível para maximizar as informações de cores.Normalmente, 16 bits é a escolha padrão. Além disso, para melhorar a relação sinal-ruído, selecione um valor de baixa frequência para aquisição, como um mega-hertz. Usando janelas histogramas, defina poder laser para obter uma resposta linear do sinal para evitar a perda de informações, limitar pixels saturados nas imagens.O sistema N-SIM usa uma câmera Andor iXon3. Ao trabalhar em 16 bits, escolha uma intensidade de destino de 16.000 para garantir a resposta linear da câmera. Alternativamente, escolha uma faixa entre 30.000 a 45.000 para maximizar o alcance dinâmico das aquisições.Defina a potência laser entre 0,1% e 50% ao fotografar as amostras e os tempos de exposição entre 50 milissegundos e dois segundos. Os poderes a laser acima de 50% podem causar fotobleachamento rápido dos fluoroforos em uso. Comece a adquirir as imagens no modo SIM 3D.Use o SIMcheck, um conjunto de plugins gratuitos para ImageJ, para avaliar a qualidade das aquisições das imagens brutas. Se o SIMcheck não detectar quaisquer artefatos ou problemas de qualidade, adquira um mínimo de 10 imagens a partir de réplicas técnicas completas para permitir a análise estatística. As imagens adquiridas são dados brutos que precisam ser processados para obter imagens SIM reconstruídas que serão usadas para análise posterior.No protocolo, sugerimos usar a sinaptofisina e o PSD-95 como marcadores pré e pós-sináptico. No entanto, podem ser usados marcadores adicionais. Um enorme corpo de literatura apoia o uso de outras proteínas, como drebrina e fagote como marcadores sinápticos.As imagens adquiridas 3D SIM são imagens brutas que precisam ser processadas para obter imagens super-resolvidas reconstruídas. A reconstrução incorreta de imagens brutas pode levar a artefatos que afetariam a análise das amostras. Deve-se, portanto, prestar muita atenção à escolha adequada dos parâmetros de reconstrução.Processe as imagens brutas usando o software de análise de reconstrução do microscópio para obter uma imagem super-resolvida. Alternativamente, use um plugin ImageJ livremente disponível fairSIM para reconstruir as imagens brutas. Calcule a transformação Fourier das imagens super-resolvidas usando o software de reconstrução do microscópio ou o plugin ImageJ SIMcheck.Uma boa imagem reconstruída deve retornar, para cada canal, uma imagem semelhante a uma flor. Se as imagens reconstruídas não recriarem uma forma semelhante a uma flor, reiniciem a partir das imagens brutas e reconstruam-nas modificando parâmetros de reconstrução, como filtragem linear, apodização e supressão de ordem zero. No Software NIS usando a visualização para monitorar como a alteração dos parâmetros afeta a imagem final resolvida, modifique o contraste de modulação de iluminação do parâmetro, a supressão de ruído de alta resolução e a supressão do foco.Analise a imagem reconstruída para detectar artefatos imparcialmente usando NanoJ-SQUIRREL, um plugin baseado em ImageJ, para avaliar a qualidade de imagens super-resolvidas. Em nossa análise de co-localização, utilizamos duas abordagens. A primeira é uma abordagem visual baseada na análise de perfil que mostra eventos únicos de co-localização e que identifica a contribuição de cada canal.Como primeiro passo para estudar a co-localização entre marcadores sinápticos e uma proteína de interesse, pegue uma imagem super resolvida e analise um único lócus para determinar a sobreposição de sinal. Identifique um único lócus na imagem super resolvida. Obtenha os perfis de intensidade dos sinais fluorescentes para o lócus de interesse.Se a análise do perfil tiver sugerido a co-localização do locus único, uma análise mais geral de toda a imagem pode ser realizada calculando os coeficientes de Pearson e Mander. Use JACoP, um plugin ImageJ, para determinar dois parâmetros de co-localização, Pearson's e Mander's. Depois de calibrar o sistema e avaliar a qualidade das imagens reconstruídas, passamos a analisar as culturas neuronais primárias manchadas com um anticorpo contra MAP2, um marcador neuronal, PSD-95, um marcador pós-sináptico, e nossa proteína alvo SUMO1.Primeiro analisamos a amostra realizando microscopia confocal de quatro canais com um objetivo de 40X. Ao selecionar uma área representando processos neuronais, mudamos para um objetivo de 100X. Adquirimos imagens confocal e SIM da mesma área para avaliar a qualidade da reconstrução com NanoJ-SQUIRREL e realizar análises de co-localização.Elucidar a estrutura e a composição da sinapse é crucial para a compreensão tanto dos processos fisiológicos quanto patológicos que regulam a memória e a cognição. Enquanto em condições normais as sinapses do estado são os blocos de construção da memória, eles também estão na base de distúrbios neurológicos complexos, como uma das formas mais comuns de demência da doença de Alzheimer. O protocolo descrito aqui permite o estudo da composição proteica das sinapses com uma técnica de microscopia de super resolução chamada microscopia de iluminação estruturada.

super-resolution-imaging-to-study-co-localization-proteins-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Este relatório demonstra uma técnica para isolamento mecânico de cada um dos neurônios viáveis ​​retenção anexado boutons pré-sináptica. Neurônios Vibrodissociated têm as vantagens de rápida produção, controle farmacológico excelente e melhor espaço grampo sem a influência das células vizinhas. Este método pode ser usado para imagens de elementos sináptica e patch-clamp gravação.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

Este artigo descreve um protocolo de trabalho de imagem espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo in vitro utilizando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia Super-resolução usando SIM oferece resolução de imagem significativamente além do limite de difração da luz em todas as três dimensões espaciais, permitindo que a imagem de espinhas dendríticas individuais com maior pormenor.

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Nós descrevemos como implementar microscopia localização fotoativados (PALM) baseada em estudos de vesículas em fixos, neurônios cultivados. Os principais componentes do nosso protocolo incluem rotulagem vesículas com quimeras photoconvertible, coletando imagens cruas pouco amostradas com um sistema de microscopia de super-resolução e processamento das imagens em bruto para produzir uma imagem de super-resolução.

Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

Aqui nós mostramos como quantificar o número ea distribuição espacial das zonas ativas sinápticas em fotorreceptores de Drosophila melanogaster, destacou com um marcador molecular geneticamente codificado, e sua modulação após a exposição prolongada à luz.

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

Aqui, descrevemos uma abordagem quantitativa para determinar a distribuição de uma proteína sináptica em relação uma proteína de marcador usando a mancha da imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador.

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

Aqui, demonstramos como combinar a transfecção de neurônios primários de roedores do hipocampo com imagens confocais de células vivas para analisar os efeitos patológicos induzidos por proteínas no transporte axonal e identificar vias mecanicistas que medeiam esses efeitos.

Usando imagens de células vivas para medir os efeitos de proteínas patológicas no transporte axonal em neurônios primários do hipocampo

Aprenda a usar microscopia de super-resolução SIM para estudar co-localização de proteínas em neurônios primários de hipocampo de camundongo. Este método permite visualizar interações sinápticas com resolução de aproximadamente 100 nanômetros.

Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

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