Avaliando a expressão do complexo de histocompatibilidade maior classe I em neurônios hipocampais murinos primários por citometria de fluxo

Este protocolo usa citometria de fluxo para avaliar quantitativamente a expressão extracelular de MHC classe 1 em neurônios primários cultivados de camundongos. A imunomarcação NC2 para expressão de MHC1 também pode ser realizada para evitar perda de sinal devido a alterações proteicas, terciárias, estruturais, permeabilização ou condições de desnaturação. Além de direcionar as respostas imunes às infecções, o MHC classe 1 modula as conexões sinápticas neuronais.

No entanto, os fatores que regulam a expressão do MHC classe 1 ainda são desconhecidos. As etapas de dissecação do cérebro embrionário exigem prática para dominar. Ao aprender a técnica, tome cuidado para praticar a dissecção sem se preocupar com o tempo ou o processo de cultura subsequente.

Para isolamento do hipocampo embrionário, coloque o primeiro cérebro embrionário de camundongo colhido sob um microscópio de estereodissecção. E use dois pares de pinças Dumont número 5 estéreis para arrancar os bulbos olfatórios e retirar completamente as meninges. Uma vez que as meninges tenham sido completamente removidas, o lado superior do córtex se abrirá lateralmente para expor o hipocampo.

Use a pinça para afastar o hipocampo do córtex anexado e transfira cuidadosamente o hipocampo isolado para um tubo cônico estéril de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio Hibernate-E no gelo. Quando todos os hipocampos tiverem sido coletados em um único tubo de 15 mililitros, sedimente o tecido cerebral por centrifugação. Substitua o sobrenadante por 0,5 mililitros de dissociação de papaína recém-preparada por embrião e misture o tubo várias vezes por inversão.

Coloque o tecido a 37 graus Celsius por 30 minutos, misturando as amostras por inversão a cada 10 minutos antes de coletar o tecido novamente por centrifugação. Substitua o sobrenadante por um volume igual de meio Hibernate-E fresco e use uma pipeta Pasteur polida com vidro totalmente aberto para triturar o tecido 10 vezes. Depois de deixar o tecido repousar por dois minutos, transfira o sobrenadante para um novo tubo cônico de 50 mililitros.

Adicione um volume igual de Hibernate-E Medium de volta ao tecido e use uma pipeta Pasteur polida a fogo de vidro meio aberto para triturar o tecido 10 vezes. Depois de deixar o tecido assentar por mais dois minutos, agrupe o sobrenadante no tubo de 50 mililitros. Adicione um volume igual de Hibernate-E Medium aos tecidos e triture o tecido 10 vezes com uma pipeta Pasteur polida a fogo de vidro aberto.

Depois de deixar o tecido repousar por dois minutos, agrupe o sobrenadante no tubo de 50 mililitros. Coletar as células dissociadas no sobrenadante por centrifugação. E ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de crescimento de neurônios para contagem Dilua as células até uma densidade final de cinco vezes 10 elevado à quinta células viáveis por mililitro de meio de crescimento de neurônios e adicione um mililitro de células a cada poço de uma placa revestida de poli-D-lisina de 12 poços.

Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura de células, substituindo metade do meio por um volume igual de meio fresco duas vezes por semana durante a vida útil da cultura. Para avaliar a capacidade dos neurônios cultivados de expressar MHC1, no dia apropriado da cultura, substitua 0,5 mililitros de sobrenadante em cada poço por 0,5 mililitros de meio de crescimento de neurônios frescos suplementado com 200 unidades por mililitro de interferon beta por uma incubação de seis a 72 horas na incubadora de cultura de células. No final da incubação, lave cada poço uma vez com meio neurobasal frio sem suplementos antes de adicionar 0,5 mililitros de meio neurobasal frio não suplementado suplementado com um micrograma por mililitro de bloco FC e um micrograma por mililitro de anticorpo anti-MHC1 conjugado com fluorescência para cada poço.

Após uma incubação de 45 minutos a quatro graus Celsius, proteja-o da luz. Lave cada poço uma vez com Dulbeccos PBS frio. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de tampão de dissociação de células livres de enzimas à temperatura ambiente a cada poço e agite para desalojar as células.

Confirme a dissociação sob um microscópio de cultura de tecidos invertido e adicione 0,5 mililitros de tampão FACS a cada poço. Triturar as células para dispersar aglomerados e transferir todo o volume de cada poço para tubos individuais de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão FACS fresco por tubo.

Transfira cada suspensão para poços individuais de uma placa de fundo em U de 96 poços e adicione 100 microlitros de reagente fixador a cada poço. Triturar várias vezes para evitar a aglomeração de células e incubar a placa por 15 minutos em temperatura ambiente protegida da luz. No final da incubação, centrifugue para coletar as células no fundo dos poços e ressuspenda os pellets em 200 microlitros de tampão FACS fresco por poço.

Após a centrifugação, ressuspenda os pellets em 100 microlitros de reagente de permeabilização suplementado com anticorpo anti-núcleo neuronal conjugado com fluorescência por poço. Após a mistura, incube a placa por 20 minutos em temperatura ambiente com balanço protegido da luz. Ao final da incubação, coletar as células por centrifugação três vezes, ressuspendendo os pellets em 100 microlitros de tampão FACS fresco entre as centrifugações.

Após a última lavagem, ressuspenda as células em 100 microlitros de 2% de par de formaldeído em tampão FACS com mistura completa. Os neurônios podem ser identificados por meio do gating sequencial de eventos totais para excluir detritos celulares e dupletos e pela positividade de seus núcleos neuronais. As células positivas para núcleos neuronais podem então ser analisadas quanto à sua positividade para MHC1.

A partir desses dados, a porcentagem de neurônios positivos para coloração de MHC1 e a intensidade mediana de fluorescência podem ser calculadas, revelando que, por exemplo, o tratamento com interferon beta regula significativamente a porcentagem e a intensidade da expressão do neurônio MHC1. Com pequenas modificações, esses métodos podem ser usados para cultivar outras populações neuronais, como neurônios corticais, ou para testar diferentes marcadores celulares, moléculas estimulantes ou modificações genéticas.