Name: Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a isolar microglia primária de tecido cerebral humano adulto com este protocolo robusto e econômico. O método reduz etapas para minimizar perda celular e permite estudos em neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O laboratório da SJ foi criado com subvenções institucionais da IITJ e é financiado por subvenções do Departamento de Biotecnologia (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) e do Ministério de Eletrônica e Tecnologia da Informação do Governo da Índia (nº 4(16)/2019-ITEA). As seções de tecido cerebral humano foram obtidas do All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur após a liberação do Comitê de Ética Institucional. Agradecemos a Mayank Rathor, membro do B.Tech Student da Design and Arts Society IIT Jodhpur, pelo apoio à videografia.

Todos os tecidos foram adquiridos após liberação ética dos comitês de ética do Instituto Indiano de Tecnologia Jodhpur e do All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Aquisição e processamento de tecidos (Dia 0)
<ol><li>Colete o tecido em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de líquido cerebrospinal artificial gelado (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM de glicose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM de sacarose)20. Certifique-se de que o tubo é mantido no gelo se o tecido precisar ser transferido para um local diferente. NOTA: Prepare aCSF em água destilada autoclavada. Filtre-o com filtro de seringa de 0,22 μm no capô laminar. Isso pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.</li>
	<li>Limpe o tubo de coleta cuidadosamente com 70% de álcool e transfira para uma câmara de fluxo de ar asséptico laminar.</li>
	<li>Descarte a ACSF cuidadosamente e pese tecido em uma condição asséptica. O peso tecidual é essencial para calcular o volume de trypsin-EDTA necessário para etapas subsequentes.</li>
	<li>Mantenha o tecido em aCSF quente fresco a 37 °C por 5 minutos. Este passo é fundamental para evitar a morte celular.</li>
	<li>Descarte aCSF e lave o tecido uma vez com 1x PBS (salina tamponada de fosfato) a 37 °C. Certifique-se de que todo o sangue seja lavado com lavagens repetidas da PBS (conforme necessário).</li>
	<li>Incubar o tecido em PBS quente, a 37 °C, por 5 min.</li>
	<li>Descarte a PBS cuidadosamente e transfira tecido para uma placa de Petri esterilizada. O PBS pode ser removido com uma pipeta. Isso evitará qualquer perda de tecido.</li>
	<li>Pique o tecido em pedaços pequenos (pelo menos 1 mm3) usando um bisturi estéril. O tecido finamente picado fornece maior área de superfície tecidual para dissociação tecidual, garantindo maior rendimento.</li>
	<li>Transfira o tecido picado para um tubo de 50 mL contendo tecido de 10 mL/g de 0,25% trypsin-EDTA e misture por pipetação através de uma pipeta sorológica de 10 mL. Adicione 2 mL de trippsina/EDTA a uma placa de Petri e lave bem a placa com a ajuda da pipeta. Adicione este trypsin de volta ao tubo falcão. Isso minimiza a perda de tecido e células durante o dicing.</li>
	<li>Incubar o tubo em um agitador por 30 minutos a 37 °C a 250 rpm. Esta etapa aumenta a dissociação das células do tecido.</li>
	<li>Ao final da incubação, adicione 10 mL de meio neutralizante (50% DMEM/50% F12 com glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS) para neutralizar a trippsina. Misture com uma pipeta sorológica de 10 mL. A quantidade de mídia neutralizante adicionada deve ser igual à quantidade de trippsina usada.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 2.000 x g a 4 °C por 10 minutos.</li>
	<li>Descarte o supernasciante e suspenda a pelota em 1 mL de cultura média (50% DMEM/50% F12 com glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 20% supernanato L929, 10% FBS). NOTA: As células L929 são cultura no DMEM (DMEM com glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS). O método de cultura recomendado pela ATCC deve ser seguido para a cultura celular. O supernascido deve ser coletado do frasco de cultura que é pelo menos 75% confluente. Pode ser coletado a granel e armazenado a -80 °C para evitar a degradação dos fatores de crescimento. Recomenda-se adicionar L929 supernacido separadamente em frascos em vez de adicionar ao meio de cultura de estoque.</li>
	<li>Emplaque as células em um frasco T-25, adequado para células aderentes, e adicione 4 mL de meio de cultura adicional. Incubar o frasco a 37 °C com 5% de CO2. Agite cuidadosamente o frasco para dispersar o tecido de forma homogênea. Evite trazer a mídia para o pescoço do frasco, enquanto treme, pois isso pode aumentar as chances de contaminação.</li>
</ol>2.Cultura celular (dia 2)
<ol><li>Colete a mídia do frasco de cultura T-25 preparado no dia 0 em três tubos de centrífugas de 1,5 mL coletando o mesmo volume de mídia em cada tubo. Lave o frasco uma vez com 1 x PBS. Agite o frasco suavemente para remover quaisquer fragmentos de tecido remanescentes deixados. Evite o tremor severo do frasco, pois qualquer fragmento remanescente não afetará negativamente a cultura. Adicione 5 mL de mídia de cultura fresca ao frasco.</li>
	<li>Centrifugar a mídia coletada a 1.466 x g (4000 rpm) a 4 °C por 4 minutos.</li>
	<li>Descarte o supernasal de cada tubo e adicione 1 mL de meio de cultura a um dos tubos. Misture bem com a pipeta. Adicione em série a mídia mista com células a outros tubos. Misture bem com a pipeta e misture as células em um tubo.</li>
	<li>Coloque as células em um frasco T-25 separado, adequado para células aderentes. Adicione 4 mL de cultura média e incubar o frasco a 37 °C com 5% de CO2.</li>
</ol>3.Cultura celular (dia 4)
<ol><li>Descarte a mídia de ambos os frascos e adicione 5 mL frescos de mídia cultural ao frasco.</li>
	<li>Incubar o frasco a 37 °C com 5% de CO2 durante 2 dias.</li>
</ol>4. Cultura Celular (Dia 6)
<ol><li>As células estarão prontas para mais experimentos.</li>
</ol>

<ol><li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+-+more+than+just+brain+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li>
<li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+Beyond%3A+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li>
<li>Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+heterogeneity+in+tissues%3A+phenotypic+diversity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%3A+A+microglial+conundrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li>
<li>Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16(2019).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li>
<li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li>
<li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+TBI+brain%3A+The+good%2C+the+bad%2C+and+the+dysregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518(2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2FBrain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+side+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer%27s+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
<li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PU.1+regulates+Alzheimer%27s+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44(2018).</li>
<li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li>
<li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain%3A+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16(2017).</li>
<li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371(2016).</li>
<li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li>
<li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inflammasome+Sensor%2C+NLRP3%2C+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811(2010).</li>
<li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li>
<li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+%28Lt+betaR%29%3A+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427(2002).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophage+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Microglia garante homeostase no cérebro normal e desempenha papéis centrais na fisiopatologia de várias doenças neurológicas4. Microglia são centrais para o neurodesenvolvimento e formação de sinapses2. Estudos microgliais têm se mostrado fundamentais na compreensão do desenvolvimento e progressão de diversas doenças neurológicas4. A microglia de roedores é o modelo predominante de escolha para estudos microgliais primários, embora, a microglia de ro...

O sistema nervoso central (SNC) é construído de uma complexa rede de neurônios e células gliais1. Entre as células gliais, a microglia funciona como as células imunes inatas do CNS2,3. A Microglia é responsável pela manutenção da homeostase no CNS4saudável . A microglia também desempenha um papel importante no neurodesenvolvimento, podando as sinapses2. A microglia é central para a fisiopatologia de várias doenças neurológicas, incluindo, mas não restritas; Doença de Alzheimer5, Doença de Parkinson6, derrame7, esclerose múltipla8,lesão cerebral traumática9,dor neuropática10,lesão medular11 e tumores cerebrais como gliomas12.
Estudos relacionados à homeostase e doenças do CNS utilizam microglia de roedores devido à escassez de protocolos de isolamento primário primário humano13. A microglia de roedores se assemelha à microglia humana primária na expressão de genes como Iba-1, PU.1, DAP12 e receptor M-CSF e tem sido eficaz na compreensão do cérebro normal e doente13. Curiosamente, a expressão de vários genes relacionados imunológicos como TLR4, MHC II, Siglec-11 e Siglec-3 varia entre microglia humana eroedora 13. A expressão de vários genes também varia na expressão temporal e em doenças neurodegenerativas em ambas as espécies14,15. Essas diferenças significativas fazem da microglia humana um modelo essencial para estudar a função da microglia na homeostase e na doença. A microglia humana primária também pode ser uma ferramenta eficaz para a triagem pré-clínica de potenciais candidatos a medicamentos16. As razões acima mencionadas sublinham a crescente necessidade de protocolos econômicos para o isolamento da microglia humana primária.
Desenvolvemos um protocolo para isolamento da microglia humana primária do tecido cerebral humano adulto coletado como resultado de uma janela cirúrgica criada para ressecções tumorais ou outras ressecções cirúrgicas. O método aqui é consideravelmente diferente dos métodos existentes. Conseguimos isolar e cultivar microglia após um tempo de trânsito de cerca de 75 minutos do local de coleta de tecidos para iniciar o protocolo de isolamento em laboratório. Usamos o supernascer de células fibroblastos L929 para promover o crescimento de microglia isolada. Este método foca especificamente na cultura e desenvolvimento apenas de microglia primária. A cultura resultante preparada é de cerca de 80% de microglia. Enquanto outros protocolos fornecem uma cultura enriquecida de microglia por centrífuga de gradiente de densidade, citometria de fluxo e contas magnéticas, o protocolo é uma maneira rápida, simples, robusta e econômica de cultivar microglia humana primária17,,18,,19,,20. A capacidade de utilizar tecido cerebral adulto vivo removido cirurgicamente em vez de tecidos cerebrais fixos de cadáveres prova uma vantagem adicional deste método em contraste com os procedimentos existentes18,,21.

<table><tbody><tr><td>Solução antibiótica-antimicótica</td><td>Himedia</td><td>A002</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga (4 &deg; C)</td> <td>Tubos</td> de centrífuga <td>Sigma 146532</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abdos</td><td>P10203</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubadora</td><td>New Brunswik</td><td>Galaxy 170 S</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Himedia</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>DMEM com glutamina</td><td>Himedia</td><td>AL007S</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Himedia</td><td>RM9955</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de frasco (50 ml)</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>50CD1058</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína Ricinus communis aglutinina-1</td><td>Vector</td><td>FL-1081</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Leica</td><td>DM2000LED</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield com DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>GFAP anticorpo</td><td>GA5</td><td>3670S</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>New Brunswik Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>L929 linha celular</td><td>ATCC</td><td>NCTC clone 929 [célula L, L-929, derivado da cepa L] (ATCC&nbsp; CCL-1)</td><td></td></tr><tr><td>Fluxo de ar laminar</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monossódico</td><td>Merck</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de nutrientes F-12 Presunto Médio</td><td>Himedia</td><td>Al106S</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Duran Grupo</td><td>237554805</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Himedia</td><td>ML023</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td> <td>de potássioHimedia</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica</td><td></td><td>Labware LW-SP1010</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Himedia</td><td>MB045</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Himedia</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa (0,2&mu;, 25 mm de diâmetro)</td><td>Frascos de</td> cultura de tecidos Axiva <td>SFPV25R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 adequados para cultura de células aderentes.</td><td>Himedia</td><td>TCG4-20X10NO</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>Rolamento 25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

obtenção de microglia humana de tecido cerebral humano adulto

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia são células imunes inatas residentes do sistema nervoso central (SNC). A microglia desempenha um papel crítico durante o desenvolvimento, na manutenção da homeostase, e durante a infecção ou lesão. Vários grupos de pesquisa independentes têm destacado o papel central que a microglia desempenha em doenças autoimunes, síndromes autoinflamatórias e cânceres. A ativação da microglia em algumas doenças neurológicas pode participar diretamente de processos patogênicos. A microglia primária é uma ferramenta poderosa para entender as respostas imunes no cérebro, interações células-células e fenótipos de microglia desregulados na doença. Microglia primária imita propriedades microgliais in vivo melhor do que linhas de células microgliais imortalizadas. Microglia adulta humana apresenta propriedades distintas em comparação com microglia fetal e roedora humana. Este protocolo fornece um método eficiente para o isolamento da microglia primária do cérebro humano adulto. Estudar essas microglias pode fornecer insights críticos sobre as interações célula-células entre microglia e outras populações celulares residentes no CNS, incluindo oligodenrócitos, neurônios e astrócitos. Além disso, a microglia de diferentes cérebros humanos pode ser cultivada para caracterização de respostas imunes únicas para medicina personalizada e uma miríade de aplicações terapêuticas.

Usando o protocolo acima mencionado (Figura 1), conseguimos isolar microglia humana primária de tecidos cerebrais ressecados cirurgicamente vivos. As células cultivadas foram manchadas com Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectina para microglia (verde) e com proteína ácida fibrilar glia (GFAP) para astrócitos (vermelho) (Figura 2) como descrito anteriormente22,23<...

Este protocolo é um método eficiente, econômico e robusto de isolar microglia primária de tecido cerebral vivo, adulto e humano. A microglia humana primária isolada pode servir como ferramenta para estudar processos celulares em homeostase e doenças.

Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

O objetivo geral do protocolo é isolar as células primárias de microglia de tecidos cerebrais humanos adultos vivos. No nosso caso, isso foi coletado como janela cirúrgica durante a cirurgia. Isso é feito coletando inicialmente os tecidos cerebrais em PBS gelado, o tecido é então cortado em pequenos pedaços cubos de 1 mm, e eu só fiz com a ajuda da trippsina EDTA.Depois disso, as células são colhidas por centrifugação e banhadas em um frasco adequado para a cultura das células andrógenas por 48 horas. As células são colhidas mais uma vez do frasco e cultivadas até o uso posterior. As células primárias de microglia humanas podem agora ser caracterizadas pelo uso de imunocytoquímica e usadas para mais experimentos.A principal vantagem do nosso protocolo para isolar células de microglia de tecidos cerebrais humanos adultos é que ela fornece efetivamente células de microglia humanas adultas primárias de uma maneira muito econômica. O protocolo é robusto e reduz a perda de células reduzindo o número de etapas que estão sendo utilizadas nos protocolos existentes. Colete o tecido em um tubo Falcon de 50 mL contendo 10 mL de gelo frio aCSF.Limpe o tubo de coleta cuidadosamente com 70% de álcool e transfira para uma câmara de fluxo de ar asséptico laminar. Descarte o aCSF cuidadosamente e pese tecido no tubo Falcão. Calcule o peso aproximado do tecido deduzindo o peso do tubo falcão vazio.ACSF fresco quente a 37 graus centígrados. Mantenha o tecido aquecido aCSF por cinco minutos. Este passo é fundamental para evitar a morte celular.Descarte aCSF cuidadosamente. E lave o tecido uma vez com 1X PBS aquecido a 37 graus centígrados. Certifique-se de que todo o sangue seja lavado com lavagens repetidas da PBS, conforme necessário.Incubar o tecido em PBS quente por 5 minutos. Descarte metade do PBS cuidadosamente. Transfira tecido junto com o PBS restante para uma placa de Petri esterilizada.Remova cuidadosamente o PBS restante com pipeta de 1 mL. Isso evitará a perda de tecido. Dados que emitem em pelo menos 1 mm cubo pequenos pedaços usando um bisturi estéril.Adicione 2 mL de 0,25% de trippsina EDTA à placa de Petri e lave bem a placa com a ajuda da pipeta. Transfira o tecido picado para um tubo Falcon de 50 mL contendo 10 mL por grama de tecido de 0,25% de trippsina EDTA. Misture por pipetação através de uma pipeta sorológica de 10 mL.Incubar o tubo em um agitador por 30 minutos a 37 graus centígrados e a velocidade de 250 rpm. Adicione 10 mL de meio neutralizador para neutralizar a trippsina. Misture bem com uma pipeta sorológica de 10 mL.Centrifugar o tubo a 2000G a 4 graus centígrados por 10 minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 1 mL de meio de cultura. Coloque as células em um frasco T25 adequado para células andrógenas e adicione 4 mL de meio de cultura adicional.O meio cultural conterá 20%L929 sobrenante e 1%estreptomicina. Recomenda-se adicionar L929 supernacido separadamente em frascos em vez de adicionar ao meio de cultura de estoque. Terminamos com o frasco para descartar o tecido de forma homogênea.Evite trazer a mídia para o pescoço do frasco enquanto treme, pois isso pode aumentar as chances de contaminação. Incubar o frasco a 37 graus centígrados com 5% de CO2 por 48 horas. Colete a mídia do frasco de cultura T25 preparado no dia 0 em tubos de centrífuga.Centrifugar a mídia coletada a 1.466G a 4 graus centígrados por 4 minutos. Enquanto a mídia coletada está sendo centrifugada, lave o frasco do dia 0 uma vez com 1X PBS. Agite o frasco suavemente para remover quaisquer fragmentos de tecido remanescentes deixados.Evite o tremor severo do frasco, pois qualquer fragmento remanescente não afetará negativamente a cultura. Adicione 5 mL de mídia de cultura fresca ao frasco. Descarte o supernatante de tubos centrifugados.Adicione 1 mL de cultura média a um dos tubos e misture bem com pipeta. Adicione a mídia mista com células a outros tubos e misture bem. Coloque as células em um frasco T25 separado adequado para células andrógenas.Adicione 4 mL de mídia de cultura fresca ao frasco. Incubar os frascos a 37 graus centígrados com 5% de CO2 por 48 horas. Descarte a mídia de ambos os frascos e adicione mídia de cultura fresca de 5 mL.Incubar os frascos a 37 graus centígrados a 5% de CO2 por 48 horas. No sexto dia, as células estarão prontas para mais experimentos. Nas imagens aqui representadas.Primeiro painel da seção A astrócitos manchados com GFAP, de cor verde. No segundo painel, da seção A mancha de microglia com RCA, de cor verde. Na seção B microglia manchada com RCA, que é de cor verde, e os astrócitos são manchados com GFAP, de cor vermelha.A sobreposição das imagens mostra microglia e astrócitos juntos. Fica claro pelas imagens que a maioria das células da cultura preparadas são microglia. As imagens foram quantificadas por controle cego e o resultado é representado na seção C.Os resultados mostraram que cerca de 80% das células da cultura preparada são células de microglia.Esta técnica pode ser realizada em cerca de uma hora e meia. Após este procedimento deve ter uma boa compreensão de como eu seleciono microglia de tecidos cerebrais humanos adultos, que podem ser usados para experimentos a jusante.

obtaining-human-microglia-from-adult-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Isolar microglia primária a partir da heterogeneidade celular do cérebro é essencial para investigar o seu papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo descreve um isolamento mecânico e técnica de cultura mista de células que fornece alto rendimento e elevada pureza, viáveis ​​primárias células microgliais...

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

O vídeo demonstra uma técnica para isolar a microglia do córtex de um cérebro de camundongo adulto. Primeiro, o córtex sofre segmentação e homogeneização para remover neurônios e outras células gliais, preservando a microglia. Em seguida, a suspensão celular é exposta a microesferas magnéticas anti-mielina e a um campo magnético, separando efetivamente as células da micróglia e mielóides dos detritos de mielina e células contendo mielina.

Isolamento da microglia do córtex de um cérebro de camundongo adulto

O vídeo demonstrou o método de isolar e cultivar células de um cérebro de camundongo neonatal. Envolveu dissociação enzimática e mecânica do cérebro, seguida de cultura em meios de crescimento sem fator de crescimento neuronal para obter uma população glial mista.

Obtenção de uma cultura de células gliais mistas de um cérebro de camundongo neonatal

Nós delinear métodos para a rápida e eficiente isolamento / cultura da microglia viável a partir do córtex cerebral neonatal e adulto medula espinhal. A dissecção e revestimento de microglia cortical pode ser realizado dentro de 90 minutos, com a colheita da microglia subseqüente ocorrendo ~ 10 dias após a dissecção inicial.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

O protocolo aqui apresentado permite o transplante de microglia humana derivada de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSMG) no cérebro através de uma rota transnasal em camundongos imunocompetentes. O método de preparação e transplante transnasal das células e a administração da mistura de citocinas para a manutenção do iPSMG é mostrado.

Transplante de Microglia Pluripotente Pluripotente Induzido Humano em Microglia De camundongos imunocompetentes através da Rota Transnasal Não Invasiva

Este protocolo descreve o processo de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) em células semelhantes à micróglia para experimentação in vitro . Também incluímos um procedimento detalhado para gerar sinaptossomos humanos a partir de neurônios motores inferiores derivados de iPSC que podem ser usados como substrato para ensaios de fagocitose in vitro usando sistemas de imagem de células vivas.

Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos

Descrevemos um protocolo para isolar células microgliais do hipotálamo de camundongo (ou pequenas estruturas cerebrais equivalentes) usando classificação de células ativadas magneticamente (MACS), em um tempo relativamente curto. A microglia hipotalâmica classificada por MACS pode ser usada para análise ex vivo e pode ser plaqueada para realizar ensaios in vitro .

Isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongo adulto recém-perfundido por classificação de células ativadas por magnetismo  

Este estudo delineia uma nova abordagem para o estabelecimento de células semelhantes à micróglia derivadas de monócitos humanos (iMG) que permitem a avaliação indireta da inflamação cerebral. Isso apresenta um modelo celular que pode ser benéfico para pesquisas com foco na inflamação potencial do cérebro e distúrbios neuropsiquiátricos associados.

Engenharia de células semelhantes à microglia induzidas por sangue humano para pesquisa cerebral de tradução reversa

Aprenda a isolar microglia primária de tecido cerebral humano adulto com este protocolo robusto e econômico. O método reduz etapas para minimizar perda celular e permite estudos em neurociência.

Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto

Explorar mais vídeos