Name: In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprenda a realizar gravações intracelulares in vivo de motoneurônios lombares em ratos Wistar durante estimulação transespinhal de corrente contínua. Este método permite avaliar propriedades de membrana e padrões de disparo em sistema nervoso maduro.

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Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência nº 2017/25/B/NZ7/00373. Os autores gostariam de reconhecer o trabalho de Hanna Drzymała-Celichowska e Włodzimierz Mrówczyński, que contribuíram para a coleta e análise dos resultados apresentados neste artigo.

Todos os procedimentos ligados a este protocolo foram aceitos pelas autoridades competentes (por exemplo, Comitê de Ética Local) e seguem as regras nacionais e internacionais sobre bem-estar e gestão animal.
NOTA: Cada participante envolvido no procedimento deve ser devidamente treinado em procedimentos cirúrgicos básicos e tem que ter uma licença válida para a realização de experimentos em animais.
1. Anestesia e premeditação
<ol><li>Anestesiar um rato com injeções intraperitoneais de pentobarbital de sódio (uma dose inicial de 60 mg·kg-1 para ratos Wistar machos de 6 meses de idade pesando 400\u2012550g). NOTA: Este protocolo não se limita à tensão indicada, sexo ou idade dos ratos. Além disso, anestesia alternativa como mistura cetamina-xilazina, alfa-clorona ou fentanil+midazolam+medetomidina pode ser usada se mais adequada para diferentes objetivos de pesquisa ou quando exigida pelo comitê de ética.</li>
	<li>Após aproximadamente 5 minutos, verifique a profundidade da anestesia beliscando o dedo do membro traseiro do rato com fórceps contundentes. Proceda com os próximos passos do protocolo somente quando nenhuma ação reflexa for observada.</li>
	<li>Injete 0,05 mL de atropina subcutânea para reduzir a produção de muco após a intubação.</li>
	<li>Injete subcutâneamente 5 mL de tampão fosfato contendo 4% de solução de glicose, NaHCO3 (1 %) e gelatina (14%). Este buffer será absorvido pelos vasos cutâneos durante um experimento e ajudará a manter o equilíbrio dos fluidos.</li>
	<li>Durante toda a cirurgia, verifique periodicamente o animal quanto às ações reflexas e suplementa se necessário (10 mg·kg-1·h-1de pentobarbital de sódio).</li>
</ol>2. Cirurgia
<ol><li>Prepare o animal para tratamento cirúrgico, raspando pele sobre a parte dorsal da linha traseira esquerda, do tornozelo ao quadril, da parte traseira, da cauda aos segmentos torácticos elevados, do lado esquerdo do peito e do lado ventral da área do pescoço acima do esterno</li>
	<li>Colocação da linha intravenosa<ol>
<li>Coloque o rato de costas em uma almofada de aquecimento de laço fechado (e fixe-o com fixações de membros).</li>
		<li>Usando uma lâmina 21, faça um corte longitudinal através da pele de um esterno para um queixo.</li>
		<li>Segure a pele com fórceps e separe-a do tecido subjacente.</li>
		<li>O uso de técnicas de dissecção contundente expõe a veia jugular direita. Dissecar cuidadosamente a veia dos tecidos circundantes.</li>
		<li>Localize a parte da veia sem pontos de ramificação, deslize duas ligaduras 4-0 abaixo dela.</li>
		<li>Faça um nó solto na extremidade proximal do segmento não ramificado anteriormente identificado da veia e um nó solto na extremidade distal deste segmento da veia. Fixar a veia proximal ao coração, e então ligar a parte distal da veia.</li>
		<li>Usando uma tesoura de íris, faça uma incisão entre o grampo e a ligadura distante. Segure uma aba da veia e introduza um cateter pré-preenchido ao ponto em que é bloqueado pelo grampo.</li>
		<li>Enquanto segura a veia e o cateter junto com fórceps, remova o grampo e empurre o cateter vários milímetros para dentro da veia. Fixar as duas extremidades do cateter na veia e adicionar um ponto de fixação adicional à pele.</li>
	</ol></li>
	<li>Introdução do tubo traqueal<ol>
<li>O uso de fórceps contundentes separa as duas glândulas mandibulares que cobrem os músculos esternohióides. Separe os músculos esternonióides na linha média para expor a traqueia.</li>
		<li>Deslize três ligaduras 4-0 abaixo da traqueia, em seguida, faça dois nós abaixo do ponto de inserção do tubo traqueal e um nó acima.</li>
		<li>Localize a cartilagem cricoide da laringe e faça uma incisão abaixo da terceira cartilagem traqueal.</li>
		<li>Insira um tubo traqueal pela traqueia e fixe o tubo no lugar com ligaduras pré-preparadas e adicione uma ligadura adicional à pele.</li>
		<li>Coloque um pequeno pedaço de lã de algodão acima dos músculos separados, e sutura a pele sobre a área operada.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecção dos nervos do membro traseiro<ol>
<li>Usando 21 lâminas, faça um corte longitudinal no lado posterior do membro traseiro esquerdo, do tendão de Aquiles até o quadril.</li>
		<li>Pegue a pele com fórceps, e usando técnicas de dissecção sem cortes separam a pele dos músculos subjacentes em ambos os lados da incisão.</li>
		<li>Localize a fossa popliteal na parte de trás da articulação do joelho, que é coberta pelo músculo bíceps femoral, e usando uma tesoura faça um corte entre a parte anterior e posterior deste músculo.</li>
		<li>Movendo-se para cima cortou duas cabeças do bíceps femoral todo o caminho até o quadril para expor o nervo ciático. Cauterize conforme necessário para evitar sangramento.</li>
		<li>Identifique os ramos surais, tibiais e peroneais comuns do nervo ciático.</li>
		<li>Usando uma tesoura, separe a lateral da cabeça medial do músculo gastrocnemius para expor o nervo tibial e seus ramos.</li>
		<li>Usando 55 fórceps pegue a extremidade distal do nervo sural, corte-a distally e disseca o mais longe possível.</li>
		<li>Repita o procedimento com o nervo peroneal comum.</li>
		<li>Usando uma haste de vidro sem corte, separe o nervo tibial dos tecidos circundantes, tomando cuidado para não danificar os vasos sanguíneos, e cortá-lo distally.</li>
		<li>Identifique os nervos gastrocnemius medial (MG) e os nervos gastrocnemius lateral e soleus (LGS).</li>
		<li>Utilizando 55 fórceps, disseco cuidadosamente os nervos MG e LGS, desconectando-os dos tecidos circundantes, mas mantendo sua conexão com os respectivos músculos.</li>
		<li>Coloque um pedaço de algodão encharcado de soro sob os nervos expostos.</li>
		<li>Feche a pele sobre a área operada.</li>
	</ol></li>
	<li>Laminectomia<ol>
<li>Usando 21 lâminas faça uma incisão longitudinal do sacro até as vértebras torácicas.</li>
		<li>Separe a pele dos músculos subjacentes.</li>
		<li>Corte o músculo longissimus em ambos os lados dos processos torácicos e lombares.</li>
		<li>O uso de bisturi de bordas cegas retrai os músculos da coluna vertebral para expor os processos transversais de cada vértebra.</li>
		<li>O uso de uma tesoura de ponta sem corte cortou os tendões dos músculos ligados aos processos transversais ao longo da coluna vertebral exposta. Aplique agentes hemostáticos, se necessário.</li>
		<li>Identifique a vértebra Th13 como o segmento torácico mais baixo com inserção da costela e usando rongeurs finos removem processos espinhosos e laminas de vértebras Th13 a L2 para expor segmentos lombares da medula espinhal. Lembre-se de não danificar o processo spinous L3 que será usado como ponto de fixação para estabilização da coluna vertebral.</li>
		<li>Remova o processo espinhoso th12 e suavize a superfície dorsal da vértebra o máximo possível.</li>
		<li>O uso de técnicas de dissecção contundente separa os músculos da vértebra Th11 para criar pontos de inserção do suporte.</li>
		<li>Coloque lã de algodão salina fina sobre os segmentos da medula espinhal exposta.</li>
		<li>Mova o rato para a estrutura metálica feita sob medida com duas barras paralelas e dois braços ajustáveis com grampos para apoiar e estabilizar a coluna vertebral.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação para a gravação e estimulação
<ol><li>Fixação da coluna vertebral e arranjo nervoso<ol>
<li>Coloque o rato na estrutura personalizada em uma almofada de aquecimento, conectada ao sistema de aquecimento de laço fechado para manter a temperatura do corpo animal a 37 ± 1°C.</li>
		<li>Insira eletrodos ECG sob a pele e conecte-se a um amplificador para monitoramento da frequência cardíaca.</li>
		<li>Usando os retalhos da pele, forme uma piscina profunda sobre a medula espinhal exposta.</li>
		<li>Utilizando grampos metálicos, fixar a coluna vertebral colocando grampos abaixo de processos transversais th12 e em processo spinous L3.</li>
		<li>Certifique-se de que a coluna vertebral está fixa e organizada horizontalmente e, em seguida, aplique pressão dorso-ventral em ambos os lados da coluna para retrair os músculos.</li>
		<li>Encha a piscina com óleo mineral quente (37 °C) e mantenha-a nesta temperatura.</li>
		<li>Enfie uma ligadura de 4-0 através do tendão de Aquiles, levante e estique o membro traseiro esquerdo operado para que o tornozelo seja nivelado com o quadril.</li>
		<li>Usando os retalhos da pele fazem uma piscina profunda sobre os nervos tibial expostos, MG e LGS.</li>
		<li>Encha a piscina com óleo mineral quente (37 °C).</li>
		<li>Coloque os nervos MG e LGS em eletrodos estimulantes de fio prateado bipolar e conecte-os a um estimulador de pulso quadrado. Use canais de estimulação separados para cada nervo.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocação de eletrodos de superfície<ol>
<li>Coloque um eletrodo de bola de prata no lado esquerdo caudal da medula espinhal exposta, com um eletrodo de referência inserido nos músculos das costas, e conecte ambos os eletrodos ao amplificador DC diferencial. O eletrodo de bola de superfície será usado para gravar voleios diferentes dos nervos.</li>
		<li>Utilizando um estimulador de corrente constante, estimule os nervos MG e LGS com pulsos quadrados de duração de 0,1 ms, repetidos em uma frequência de 3 Hz, e observe voleios diferentes.</li>
		<li>Determine o limiar (T) para ativação nervosa, estimule cada nervo a aproximadamente 3· Intensidade T, e amplitude recorde de voleio diferente para cada nervo.</li>
		<li>Mova o rostral de eletrodo superficial e repita o procedimento para identificar segmentos espinhais em que amplitudes das voleios são as mais altas para cada nervo. Depois de determinar a localização máxima do voleio, mova o eletrodo da superfície para uma distância segura da medula espinhal.</li>
	</ol></li>
	<li>Paralisia muscular e formação de pneumotórax para reduzir os movimentos respiratórios<ol>
<li>Paralise o rato por via intravenosa com um bloqueador neuromuscular e conecte o tubo traqueal a um ventilador externo em linha com um capnômetro compatível com roedores (brometo de pancurônio, em uma dose inicial de 0,4 mg·kg-1, suplementado a cada 30 minutos em doses de 0,2 mg·kg-1)</li>
		<li>Monitore a concentração de CO2 de maré final e mantenha-a em cerca de 3\u20124% ajustando parâmetros de ventilação (frequência, pressão de ar e volumes de fluxo).</li>
		<li>Faça uma incisão longitudinal na pele entre a 5ª e a 6ª costela em um lado da gravação.</li>
		<li>Usando uma tesoura de ponta sem corte, corte os músculos sobreladais para visualizar o espaço intercostal entre as costelas.</li>
		<li>Usando uma pequena tesoura afiada, faça uma pequena incisão nos músculos intercostais e na pleura, em seguida, insira uma ponta de uma borda cega fórceps na abertura, tomando cuidado para não pressionar os pulmões.</li>
		<li>Permita que as fórceps se expandam ou insira um pequeno tubo para manter o pneumotórax aberto durante todo o experimento.</li>
		<li>Após o bloqueio neuromuscular, monitore a profundidade da anestesia verificando a frequência do ECG e complemente o agente anestésico se a frequência cardíaca exceder 400 bpm. Paralisia muscular e formação de pneumotórax para reduzir os movimentos respiratórios, o que melhorará a estabilidade do registro</li>
	</ol></li>
	<li>Abrindo o dura e pia mater<ol>
<li>Usando #55 fórceps, levante suavemente a dura mater, e corte-a caudally do segmento L5, rostrally até o segmento L4.</li>
		<li>Usando um par de fórceps 5SF ultrafinos fazem um pequeno patch na pia cobrindo a coluna dorsal, entre os vasos sanguíneos, exatamente ao nível do voleio máximo diferente do MG ou do nervo LGS.</li>
		<li>Use pequenos pedaços de espuma de gel salino e seca para bloquear o sangramento, se necessário.</li>
	</ol></li>
	<li>colocação de eletrodos tsDCS<ol>
<li>Faça uma pequena incisão na pele no lado ventral de um abdômen de rato no nível rostro-caudal correspondente à localização dos segmentos espinhais L4-L5.</li>
		<li>Pegue a aba de pele exposta com um clipe de metal que servirá como um eletrodo de referência.</li>
		<li>Coloque uma esponja encharcada de soro fisiológico no lado dorsal da vértebra Th12. Certifique-se de que o tamanho da esponja é igual ao de um eletrodo tsDCS ativo (placa de aço inoxidável em forma de círculo de 5 mm de diâmetro).</li>
		<li>Usando um manipulador fino, pressione a esponja com um eletrodo tsDCS ativo no osso e certifique-se de que toda a superfície do eletrodo seja pressionada igualmente.</li>
		<li>Conecte eletrodos tsDCS de referência e ativos a uma unidade estimuladora de corrente constante, capaz de fornecer um fluxo contínuo de corrente direta.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de micropipettos<ol>
<li>Usando um puxador de microeletrodo, prepare uma microeletrídua. NOTA: Tanto os eletrodos de filamento quanto os eletrodos não filamentos podem ser usados, no entanto, lembre-se que a haste do eletrodo deve ser longa o suficiente para atingir o chifre ventral enquanto é fina o suficiente para não comprimir a medula espinhal durante a descida.<ol>
<li>Ajuste a configuração do puxador para que a haste que entra na medula espinhal tenha aproximadamente 3 mm de comprimento, enquanto a ponta do eletrodo não é superior a 1\u20122 μm de diâmetro e a resistência à microeletrísola está entre 10 e 20 MΩ.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Encha os microeletrodos com eletrólitos de potássio de 2M.</li>
		<li>Monte a microeletrínda preparada no micromanipulador permitindo 1\u20122 μm movimento de pisada e calibração estereotaxic.</li>
		<li>Conecte o microeletro ao amplificador intracelular com o eletrodo de referência colocado nos músculos das costas.</li>
	</ol></li>
	<li>Após o bloqueio neuromuscular, monitore a profundidade da anestesia verificando a frequência do ECG e complemente o agente anestésico para que a frequência cardíaca do rato não exceda 400 bpm.</li>
</ol>4. Rastreamento e penetração de motoneuron
<ol><li>Coloque o diferente eletrodo de gravação de voleio de volta na superfície dorsal da medula espinhal, caudalmente à localização do local de gravação, ao nível do segmento L6.</li>
	<li>Estimule os nervos MG e LGS com pulsos elétricos de 0,1 ms em uma frequência de 3 Hz, e intensidade 3T, para ativar todos os axônios de alfa-motoneurons dentro de um nervo selecionado.</li>
	<li>Dirija a micropipette em um patch selecionado na pia com um ângulo medio-lateral de 15\u201220° (com uma ponta direcionada lateralmente).</li>
	<li>Depois de descer abaixo da superfície, calibrar a microeletrância e compensar sua capacitância e deslocamento de tensão, e continuar a penetração da medula espinhal quando todos os parâmetros estiverem estáveis. Um potencial de campo antidérmico da piscina de motoneuron será visível no traço de tensão de microeletrodes enquanto se aproxima de um núcleo motor dedicado durante a estimulação do respectivo nervo.</li>
	<li>Proceda a penetração com a microeletrídula a passos de 1\u20122 μm e use periodicamente a função de zumbido do amplificador intracelular para limpar a ponta do eletrodo de qualquer resíduo.</li>
	<li>Observe a penetração do motoneuron que será caracterizada por uma hiperpolarização súbita do traço de tensão registrado e aparência de um potencial de pico antidrómico.</li>
</ol>5. Gravação de membrana de motoneuron e propriedades de disparo
<ol><li>Em um modo de ponte do amplificador intracelular, identifique o motoneuron com base na aparência "tudo ou nada" do potencial de ação antidrómica estimulando seus respectivos ramos nervosos. Registos 20 subsequentes para a média posterior.</li>
	<li>Implementar um critério de inclusão rigoroso para garantir dados de alta qualidade: potencial de membrana de repouso de pelo menos -50 mV em amplitude; amplitudes potenciais de ação superiores a 50 mV, com um sobrev positivo; potencial de membrana estável por pelo menos 5 minutos antes de gravar.</li>
	<li>Em um modo de fixação atual descontínua (modo de taxa de comutação atual de 4 a 8 kHz) do amplificador intracelular, evoque um potencial de ação ortodrómica em um motoneuron usando pulsos de corrente despolarizantes intracelulares de 0,5 ms. Repita pelo menos 20 vezes para a média offline.</li>
	<li>Estimule um motoneuron com 40 pulsos curtos (100 ms) de corrente hiperpolarizadora (1 nA) a fim de calcular a resistência à entrada celular.</li>
	<li>Estimule um motoneuron com pulsos de onda quadrada de 50 ms em amplitudes crescentes para determinar o valor da reobase como a amplitude mínima de corrente despolarizadora necessária para provocar um único pico.</li>
	<li>Injete pulsos de onda quadrada de 500 ms de corrente despolarizadora, aumentando as amplitudes em passos de 0,1-2 nA para evocar descargas rítmicas de motoneurons.</li>
</ol>6. Estimulação de corrente direta trans-espinhal (tsDCS)
<ol><li>Mantendo uma penetração estável do motoneuron, inicie o procedimento de polarização por aplicação trans-espinhal de corrente direta. Ajuste a intensidade atual e o tempo de aplicação ao design do experimento (por exemplo, 0,1 mA por 15 min).</li>
	<li>Imediatamente após ligar o DC, observe o potencial da membrana do motoneuron. A polarização anodal (o eletrodo ativo como ânodo) deve resultar na despolarização do potencial da membrana, enquanto a polarização catódal (o eletrodo ativo como um cátodo) deve evocar um efeito oposto. Observe se uma mudança no potencial da membrana de repouso em resposta à estimulação dc é constante, o que garante que a intensidade do campo elétrico não seja afetada.</li>
	<li>Durante a aplicação contínua de corrente, repita as etapas 5.3\u20125.6 em intervalos de 5 minutos.</li>
	<li>Desligue o DC e continue repetindo as etapas 5.3\u20125.6 em intervalos de 5 minutos até que as gravações se tornem instáveis ou os critérios de inclusão sejam comprometidos.</li>
	<li>Termine o experimento e eutanize o animal usando administração intravenosa de uma dose letal de sódio pentobarbital (180 mg·kg-1).</li>
</ol>

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<li>Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-current+relationships+of+rat+hindlimb+alpha-motoneurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones.</a> The Journal of Physiology. 573, Pt 3 663-677 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.

Se realizada corretamente, a parte cirúrgica do protocolo descrito deve ser concluída dentro de aproximadamente três horas. Deve-se tomar cuidado especial na manutenção de condições fisiológicas estáveis de um animal durante a cirurgia, em especial a temperatura corporal e a profundidade da anestesia. Além de considerações éticas óbvias, a falta de anestesia adequada pode resultar em movimentos excessivos de membros durante a dissecção nervosa ou laminectomia e levar a danos à preparação ou a um término prematuro do expe...

A estimulação da corrente direta trans-espinhal (tsDCS) está ganhando reconhecimento como um método potente para modificar a excitabilidade do circuito espinhal na saúde e na doença1,,2,3. Nesta técnica, é passada uma corrente constante entre um eletrodo ativo localizado acima dos segmentos espinhais selecionados, com um eletrodo de referência localizado ventrally ou mais rostrally4. Vários estudos já confirmaram que o TSDCS pode ser usado no gerenciamento de certas condições patológicas, como dor neuropática5, espasticidade6,lesão medular7 ou para facilitar a reabilitação8. Os pesquisadores sugerem que o TSDCS evoca alterações na distribuição de íons entre o espaço intracelular e o espaço extracelular através da membrana celular, e isso pode facilitar ou inibir a atividade neuronal dependendo da orientação atual9,,10,,11. No entanto, até recentemente, faltava uma confirmação direta dessa influência sobre os motoneurons.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para realizar o registro intracelular in vivo de potenciais elétricos de motoneurons lombares no rato anesthetizado com aplicação simultânea de TSDCS, a fim de observar alterações na membrana motoneuron e propriedades de disparo em resposta à polarização anodal ou catódal da rede neuronal espinhal. Gravações intracelulares abrem diversas áreas de investigação de propriedades de neurônios, indisponíveis para técnicas extracelulares previamente utilizadas9,12. Por exemplo, é possível medir com precisão a resposta de tensão da membrana do motoneuron ao fluxo de corrente direta induzido pelo TSDCS, indicar limiar de tensão para geração de picos ou analisar parâmetros potenciais de ação. Além disso, essa técnica nos permite determinar as propriedades da membrana passiva do motoneuron, como a resistência à entrada, e observar a relação entre a corrente de estimulação intracelular e a frequência de disparo rítmico de motoneurons. A identificação antidrómica do motoneuron registrado, com base na estimulação de nervos identificados funcionalmente (ou seja, nervos que fornecem eferentes a flexores ou extensores) permite identificar adicionalmente tipos de unidades motoras inervadas (rápida versus lenta), o que dá a oportunidade de testar se a polarização influencia de forma diferente elementos individuais do sistema neuronal espinhal maduro. Devido à extensa cirurgia que precede o registro e aos altos requisitos de estabilidade e confiabilidade das gravações, essa técnica é altamente desafiadora, mas permite a avaliação direta e a longo prazo das características eletrofisiológicas de um motoneuron: antes, durante e depois da aplicação do TSDCS, que é crucial para determinar tanto suas ações agudas quanto os efeitos persistentes13. Como um motoneuron ativa diretamente as fibras musculares extrafusais14 e participa do controle de feedback de uma contração muscular e desenvolveu força15,16 qualquer influência observada de tsDCS na unidade motora ou propriedades contratuais musculares pode estar ligada a modulações de excitabilidade do motoneuron ou características de disparo.

<table><tbody><tr><td><forte>Durgs e soluções</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Atropinum sulfuricum</td><td>Polfa Warszawa</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td> <td>346351-NaHCO3</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>106329-Pancuronium Jelfa</td><td>PharmaSwiss/</td><td></td><td>Valeant-Bloqueador neuromuscular</td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Biowet Pu?awy Sp. z o.o-Agente</td><td></td> <td>anestésico principal</td></tr><tr><td>Citrato de</td> potássio <td>Chempur</td><td>6100-05-06-Tetraspan</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Braun-HES solution</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipamento cirúrgico</td><td>-</td><td>-</td><td>-21</td></tr> <tr><td>Lâmina</td><td>FST</td><td>10021-00</td><td>Lâmina</td></tr> <tr><td>de bisturiCauterizador</td><td>FST</td><td>18010-00-Tubos</td><td></td></tr> <tr><td>torácicos</td><td>Mila</td><td>CT1215-Dumont</td><td></td></tr> <tr><td>#4 Fórceps</td><td>FST</td><td>11241-30</td><td>Fórceps muscular</td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>Fórceps</td></tr><tr><td>Dura Dumont #5F Fórceps</td><td>FST</td><td>11255-20</td><td>Fórceps</td></tr><tr><td>nervoso Dumont #5SF Fórceps</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Pia fórceps</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>FST</td><td>11008-13</td><td>Fórceps sem corte</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>FST</td><td>11053-10</td><td>Fórceps de pele</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FST</td><td>13013-14-Rongeur</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>FST</td><td>16021-14</td><td>Para laminectomia</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>Tesoura de veia</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>FST</td><td>15002-08</td><td>Tesoura dura</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>FST</td><td>14184-09</td><td>para corte de traqueia</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>FST</td><td>104075-11</td><td>Tesoura muscular</td></tr><tr><td></td><td>Tesoura FST</td><td>14002-13</td><td>Tesoura de pele</td></tr><tr><td>Tubo traqueal</td> <td>-</td><td></td> <td>Cateter de veia feito sob medida</td></tr><tr><td></td><td>Vygon</td><td>1261.201-Vessel</td><td></td></tr> <tr><td>cannulation forceps</td><td>FST</td><td>18403-11</td><td>- </td></tr><tr><td>Braçadeira</td><td>de vaso FST</td><td>18320-11</td><td>Para fixação de veias</td></tr><tr><td>Sonda de dilatação de vaso</td><td>FST</td><td>10160-13</td><td>Para dissecção de veias</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Materiais de sustentação</forte></td><td></td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>-Espuma de gel</td><td>Pfizer</td><td>GTIN 00300090315085</td><td>Agente hemostático</td></tr><tr><td>Sutura de seda 4.0</td><td>FST</td><td>sutura 18020-40-Silk</td><td></td></tr> <tr><td>6,0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Dispositivos moleculares</td> de <td>Axoclamp 2B</td><td>descontinuados</td><td>Amplificador intracelular/modelo novo Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor</td><td>CWE</td><td>11-10000</td><td>Gás analisador</td></tr><tr><td>Grass S-88</td><td>A-M Systems</td><td>descontinuado</td><td>Estimulador de corrente constante</td></tr><tr><td>Sistemas de manta homeotérmica com sonda flexível</td><td>Aparelho Harvard</td><td>507222F</td><td>Sistema de aquecimento</td></tr><tr><td>ISO-DAM8A</td><td>WPI</td><td>74020</td><td>Amplificador extracelular</td></tr><tr><td>Microdrive</td> <td>-</td><td></td> <td>Feito sob medida / substituição IVM / Scientifica</td></tr><tr><td>P-1000 Microeletrodo </td><td>extrator Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>Extrator de microeletrodos</td></tr><tr><td>SAR-830 / AP Ventilador para animais pequenos</td><td>CWE</td><td>12-02100</td><td></td></tr><tr><td>Quadro de suporte</td> <td>do</td> respirador - <td></td><td>Base padrão de laboratório personalizado / substituição 51601 /</td></tr><tr><td>Grampos espinhais</td> de armazenamento <td>-</td><td></td> <td>Adaptador espinhal de rato personalizado / substituição 51695 /</td></tr><tr><td>Estimulador DC TP-1</td><td>WiNUE</td><td>-</td><td>estimulador tsDCS</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Diversos</forte></td><td></td><td>--</td><td>-</td></tr><tr><td>1B150-4 capilares de vidro</td><td>WPI</td><td>1B150-4</td><td>Para produção de microeletrodos</td></tr><tr><td>Algodão</td><td></td> <td>---</td><td></td></tr> <tr><td>tubulação flexível</td> <td>-</td><td>-</td><td>Para conexão</td></tr> <tr><td>de respirador e analisador de CO2MicroFil</td><td>WPI</td><td>MF28G67-5</td><td>Para enchimento de micropipetas Fio</td></tr><tr><td>de prata</td> <td>-</td><td></td> <td>Para eletrodos nervosos</td></tr></tbody></table>

in vivo intracelular gravação de motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

O registro intracelular de motoneurons espinhais in vivo fornece um "padrão-ouro" para determinar as características eletrofisiológicas das células na rede espinhal intacta e contém vantagens significativas em relação às técnicas clássicas de gravação in vitro ou extracelular. Uma vantagem das gravações intracelulares in vivo é que esse método pode ser realizado em animais adultos com um sistema nervoso totalmente maduro, e, portanto, muitos mecanismos fisiológicos observados podem ser traduzidos para aplicações práticas. Neste artigo metodológico, descrevemos esse procedimento combinado com a estimulação de corrente constante aplicada externamente, que imita processos de polarização ocorridos dentro das redes neuronais espinhais. A estimulação de corrente direta trans-espinhal (TSDCS) é um método inovador cada vez mais utilizado como intervenção neuromodulatória na reabilitação após várias lesões neurológicas, bem como em esportes. A influência do TSDCS no sistema nervoso permanece mal compreendida e os mecanismos fisiológicos por trás de suas ações são amplamente desconhecidos. A aplicação do tsDCS simultaneamente com gravações intracelulares permite observar diretamente as alterações das propriedades da membrana motoneuron e características do disparo rítmico em resposta à polarização da rede neuronal espinhal, o que é crucial para a compreensão das ações do TSDCS. Além disso, quando o protocolo apresentado inclui a identificação do motoneuron no que diz respeito a um músculo inervado e sua função (flexor versus extensor), bem como o tipo fisiológico (rápido versus lento) proporciona uma oportunidade de investigar seletivamente a influência do TSDCS em componentes identificados de circuitos espinhais, que parecem ser diferentemente afetados pela polarização. O procedimento apresentado foca na preparação cirúrgica para gravações intracelulares e estimulação com ênfase nas etapas necessárias para alcançar a estabilidade da preparação e a reprodutibilidade dos resultados. Os detalhes da metodologia da aplicação anodal ou cathodal tsDCS são discutidos enquanto prestam atenção às questões práticas e de segurança.

Parâmetros de potencial de ação e várias propriedades de membrana podem ser calculados com base em gravações intracelulares quando condições estáveis de penetração celular são garantidas. A Figura 1A apresenta um potencial típico de ação ortodrómica evocado pela estimulação intracelular, que atende a todos os critérios de inclusão de dados (o potencial de membrana de repouso de pelo menos -50 mV, e a amplitude de pico superior a 50 mV, com uma superação positiva). Os parâmetros potenciais de...

Este protocolo descreve a gravação intracelular in vivo de motoneurons lombares de rato com estimulação simultânea de corrente trans-espinhal. O método permite medir as propriedades da membrana e registrar disparos rítmicos de motoneurons antes, durante e depois da polarização anodal ou catódal da medula espinhal.

In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Este protocolo utiliza gravações intracelulares de motoneurons espinhais, para investigar diretamente a influência da estimulação de corrente direta trans-espinhal na função das redes espinhais. A maior vantagem dessa técnica é que ela permite que gravações intracelulares sejam realizadas em sistema nervoso totalmente maduro. Facilitando a tradução das observações experimentais para aplicações práticas.Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, um rato Wistar macho anestesizado de seis meses de idade, use um microscópio dissecando e uma lâmina número 21, para fazer uma incisão longitudinal da pele do esterno para o queixo. E use dissecção contundente para expor a veia jugular certa. Coloque duas ligaduras 4-0 abaixo da seção da veia sem pontos de ramificação.E faça um nó solto na extremidade proximal do segmento da veia. E um nó solto na extremidade distal do segmento. Fixar a veia proximal ao coração, e ligar a extremidade distal da veia.Use uma tesoura de íris para fazer uma incisão entre o grampo e a ligadura distal. E, segurando um retalho da veia, introduza um cateter pré-preenchido ao ponto onde a veia é bloqueada pelo grampo. Em seguida, remova o grampo e empurre o cateter vários milímetros para dentro da veia.Para uma colocação de tubo traqueal, use fórceps contundentes para separar as duas glândulas mandibulares que cobrem os músculos esternonióides. E separar os músculos esternohióides na linha média, para expor a traqueia. Coloque três ligaduras de 4-0 abaixo da traqueia, e faça dois nós abaixo do ponto de inserção do tubo traqueal e um nó acima.Em seguida, insira um tubo traqueal na traqueia abaixo da terceira cartilagem traqueal. E fixe o tubo no lugar com as ligaduras pré-preparadas. Para dissecar os nervos do membro traseiro, use uma lâmina número 21 para fazer um corte longitudinal no lado posterior do membro traseiro esquerdo, do tendão de Aquiles até o quadril.E use uma tesoura para fazer um corte entre as regiões anterior e posterior da fossa popliteal, na parte de trás da articulação do joelho. Corte duas cabeças do bíceps femoris, para expor o nervo ciático. E separar a cabeça lateral da cabeça medial do músculo gastrocnemius, para expor o nervo tibial e seus ramos.Em seguida, use o número 55 fórceps, para dissecar cuidadosamente o gastrocnemius medial e os nervos gastrocnemius laterais e soleus. Desconectando-os dos tecidos circundantes, mantendo sua conexão com os respectivos músculos. Para realizar a laminectomia, use uma lâmina número 21 para fazer uma incisão longitudinal do sacro até as vértebras torácicas.E identificar a vértebra Th13, como um segmento torácico mais baixo com uma inserção da costela. Em seguida, use rongeurs finos para remover os processos espinhosos e laminae das vértebras de Th13 para as vértebras L2, para expor os segmentos lombares da medula espinhal. Para fixar a coluna vertebral, coloque o rato em uma estrutura feita sob medida em uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus, conectada a um sistema de aquecimento de loop fechado.E use os retalhos da pele para formar uma piscina profunda sobre a medula espinhal exposta. Coloque grampos metálicos abaixo dos processos transversais th12, e nos processos espinhosos L3, e encha a piscina com 37 graus Celsius de óleo mineral. Use os retalhos da pele para fazer uma piscina profunda de óleo mineral sobre os nervos tibial, gastrocnemius medial e gastrocnemius lateral e soleus.E coloque os nervos em fios de prata bipolar estimulando eletrodos. Em seguida, conecte os eletrodos a um estimulador de pulso quadrado usando canais de estimulação separados para cada nervo. Para uma colocação de eletrodos de superfície, sob o microscópio dissecando, coloque um eletrodo de bola de prata no lado esquerdo caudal da medula espinhal exposta.Com um eletrodo de referência inserido nos músculos das costas. E conecte ambos os eletrodos ao amplificador DC diferencial. Use um estimulador de corrente constante para estimular o gastrocnemius medial e os nervos gastrocnemius laterais e soleus, com pulsos quadrados de uma duração de 0,1 milissegundo repetida em uma frequência de três hertz e observar os voleios aferentes.No final da simulação, mova o eletrodo superficial rostrally, e repita a estimulação para identificar os segmentos espinhais em que as amplitudes das voleios são as mais altas para cada nervo. Depois de determinar a localização do voleio máximo, entregue um bloqueador neuromuscular por via intravenosa para paralisar o rato. Enquanto um assistente conecta o tubo traqueal a um ventilador externo em linha com um nominador de tampa compatível com roedores.Para abrir o dura e pia mater, use o número 55 fórceps para levantar suavemente a dura mater, e cortar o tecido caudally do segmento L5, rostrally até o segmento L4. Em seguida, use um par de fórceps ultra finos de 5SF, para fazer um pequeno patch na pia, cobrindo a coluna dorsal entre os vasos sanguíneos. Exatamente ao nível do voleio máximo diferente do gastrocnemius medial e gastrocnemius lateral e nervo soleus.Para colocar os eletrodos de estimulação de corrente direta trans-espinhal, coloque uma esponja salina encharcada no lado dorsal das vértebras de Th12. E use uma boa manipulação para pressionar a esponja com um eletrodo de estimulação de corrente trans-espinhal ativa. Em seguida, monte um microeletrodo combinado personalizado, no micro manipulador, permitindo um movimento de piso de um a dois mícticos e calibração estereotaxica.E dirija uma ponta de micropipette em um patch selecionado na pia, em um ângulo lateral medial de 15 a 20 graus. Para registrar a membrana de motoneuron e propriedades de disparo, no modo ponte do amplificador intracelular, estimular os respectivos ramos nervosos para identificar o motoneuron com base na aparência tudo ou nada, do potencial de ação antidrômica. No modo de fixação atual descontínua do amplificador intracelular com um modo de taxa de comutação atual de quatro a oito quilohertz, use um pulso de corrente intracelular de 0,5 milissegundos, para evocar um potencial de ação ortodôntica, no motoneuron.Para calcular a resistência à entrada da célula, estimule um motoneuron, com 40 pulsos curtos de 100 milissegundos de hiperpolarização de uma corrente de nanograma. Para determinar o valor real da base como a amplitude mínima da corrente despolarizadora necessária para provocar um único pico, estimule um motoneuron com pulsos de onda quadrada de 50 milissegundos em amplitudes crescentes. Em seguida, injete pulsos de onda quadrada de 500 milissegundos de corrente despolarizadora, aumentando as amplitudes.Em 0,1 a dois passos nano amp, para evocar descargas rítmicas de motoneurons. Para uma estimulação de corrente direta trans-espinhal, inicie os procedimentos de polarização por aplicação trans-espinhal de corrente direta, mantendo uma penetração estável do motoneuron. Aqui, um típico potencial de ação ortotrópica, evocado pela estimulação intracelular que atende a todos os critérios de inclusão de dados é mostrado.Nesta análise, uma resposta celular a um pulso de corrente hiperpolarizadora de 100 milissegundos de um nanograma. A partir do qual a resistência de entrada de pico e platô de um motoneuron, pode ser determinada a partir da deflexão de tensão, pode ser observada. Este traço de tensão expandida de um pico básico real, exibe um limiar de tensão claramente marcado do pico.Indicando o nível de despolarização da membrana em que os canais de sódio fechados de tensão são ativados para iniciar o potencial de ação. Estes gráficos fornecem exemplos de traços de tensão intracelular. De dois motoneurons, estimulados intracelularmente com pulsos quadrados de 500 milissegundos de corrente despolarizadora.Antes, durante e depois de uma aplicação de estimulação de corrente direta trans-espinhal. A estimulação de corrente trans-espinhal anodal foi encontrada para atuar em direção a uma maior excitabilidade do motoneuron e maiores frequências de disparo rítmico. Enquanto a estimulação de corrente trans-espinhal cathodal, atuou para disparar a inibição.Além disso, os efeitos de ambos os tipos de estimulação trans-espinhal direta da corrente, superaram o período de polarização. Dados imprecisos podem ser adquiridos, se os critérios de inclusão de dados forem comprometidos devido à penetração celular imperfeita. Falha em compensar a resistência e a capacitância da microeletrísmo ou uma instabilidade medular.É imperativo que nenhum dano seja causado à medula espinhal durante a dissecção, pois a lesão pode resultar em choque espinhal, impossibilitando novas gravações. É possível colher amostras de tecido para análises químicas histológicas ou imunocitológicas. Por exemplo, a medição da expressão c-fos pode ser usada como um proxy da atividade neuronal.

in-vivo-intracellular-recording-type-identified-rat-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este método novo permite a gravação simultânea intracelular de um motoneurônio único adulto rato e a medição da força produzida por suas fibras musculares. A investigação combinado das propriedades eléctricas e mecânicas das unidades motoras em animais normais e geneticamente modificadas é um avanço para o estudo do sistema neuromuscular.

Gravação Intracelular simultânea de um motoneurônio lombar e a força produzida pelo seu motor no Rato Adulto<em&gt; Em vivo</em

Este vídeo demonstra a gravação de sinais elétricos de neurônios cerebrais individuais usando uma micropipeta de vidro de ponta fina e uma configuração especializada. A micropipeta é cuidadosamente inserida no cérebro do rato e é zumbida para penetrar no neurônio para registrar sinais elétricos neuronais internos.

Gravação in vivo de sinais intracelulares de um único neurônio

Este vídeo descreve o registro intracelular in vivo de motoneurônios de ratos sob estimulação transespinhal por corrente contínua. O protocolo descreve como medir as propriedades da membrana e registrar o disparo rítmico de motoneurônios antes, durante e após a polarização anódica ou catódica da medula espinhal.

Estimulação transespinhal por corrente contínua do motoneurônio espinhal de um rato

Este vídeo demonstra o procedimento para registrar o potencial de ação muscular composto (CMAP) em ratos, aplicando estímulos elétricos ao nervo ulnar, ajustando eletrodos para sinal ideal e aumentando a estimulação para avaliar a funcionalidade do nervo. Este método permite a investigação in vivo das funções dos nervos periféricos em distúrbios neurológicos.

Medição in vivo do potencial de ação muscular composto em um rato

Este vídeo demonstra uma gravação de fibra única da condução nervosa da fibra C em ratos. Um rato anestesiado é incisado para expor o nervo ciático, que fornece suprimento sensorial e motor aos membros inferiores. As fibras C individuais são então expostas. A estimulação elétrica é fornecida usando eletrodos de estímulo implantados no pé e uma resposta é registrada a partir de uma única fibra nervosa.

Registro in vivo de fibras C do nervo ciático em ratos

GABAérgica inibição pré-sináptica é um poderoso mecanismo de inibição na espinal medula importante para o motor e a integração do sinal sensorial em redes da medula espinal. Subjacente despolarização aferente primário pode ser medido por registo dos potenciais de raiz dorsal (DRP). Aqui demonstramos um método in vivo de gravação de DRP em ratinhos.

Medindo Spinal pré-sináptica Inibição em Ratos por raiz dorsal Gravação Potencial<em&gt; In Vivo</em

Mostramos como preparar fatias oblíquas da medula espinhal em ratos jovens. Esta preparação permite que a estimulação das raízes ventrais.

A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral

A gravação da único-fibra é uma técnica eletrofisiológicos eficaz que seja aplicável aos sistemas nervosos centrais e periféricos. Junto com a preparação de DRG intact com o nervo ciático Unido, o mecanismo da falha da condução é examinado. Ambos os protocolos melhoram a compreensão da relação do sistema nervoso periférico com a dor.

Uso da gravação in vivo da único-fibra e do gânglio dorsal intacto da raiz com nervo sciatic Unido para examinar o mecanismo da falha da condução

Este método permite o registro da força de contrações de contração e tetanic e potenciais de ação em três tipos de unidades motoras no músculo gastrocnemius medial de rato. O isolamento funcional de uma única unidade motora é induzido por estimulação elétrica do axônio.

Isolamento Funcional de Unidades Motoras Únicas do Músculo Gastrocnemius Medial de Rato

Este protocolo descreve um método que utiliza um patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à estimulação da medula espinhal (SCS) com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar os pesquisadores a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular simultaneamente.

A Preparação Ex Vivo do Corte da Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores Durante a Estimulação da Medula Espinhal

Descrevemos um protocolo para registro extracelular multicanal espinhal juntamente com o registro da função cardíaca e análise dos neurônios do corno dorsal espinhal bloqueados cardíacos. Este método oferece uma estrutura temporalmente sincronizada para estudar os mecanismos da coluna vertebral subjacentes às alterações funcionais viscerais torácicas induzidas pela acupuntura.

Estudando os perfis de codificação da estimulação somática nas respostas neuronais cardíacas bloqueadas no corno dorsal espinhal de ratos

Aprenda a realizar gravações intracelulares in vivo de motoneurônios lombares em ratos Wistar durante estimulação transespinhal de corrente contínua. Este método permite avaliar propriedades de membrana e padrões de disparo em sistema nervoso maduro.

In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal (Vídeo) | JoVE Journal

In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal

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