Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

Além do protocolo para diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos em células neurais, também mostramos um conjunto de experimentos que podem analisar de forma abrangente o processo de diferenciação. Essas técnicas são pertinentes ao desenvolvimento embrionário ectodérmico inicial, fornecendo aos pesquisadores opções para analisar a diferenciação de células neurais. Ao tentar este procedimento, é essencial começar com células-tronco em ótimas condições.

Portanto, é importante que os EBs, MPCs e neurônios sejam cultivados em meios novos e ideais. A demonstração visual deste protocolo é importante, pois contém detalhes minuciosos que podem afetar seu sucesso e eficácia, especialmente a parte de diferenciação. Comece configurando uma cultura de células suspensas.

Para uma placa de cultura de células de 10 centímetros, ajuste a concentração para 500 células por 20 microlitros de meio de diferenciação. Prepare suspensão celular suficiente para 50 gotículas de 20 microlitros. Use uma micropipeta ou uma pipeta repetidora para colocar gotículas de 20 microlitros de suspensão celular na tampa de uma placa de cultura de tecidos, certificando-se de que as gotículas não estejam muito próximas umas das outras, para evitar que se fundam.

Encha o prato com cinco a 10 mililitros de PBS e coloque cuidadosamente a tampa de volta no prato. Incube a cultura na incubadora de 37 graus Celsius. Após dois dias, colete as gotículas da tampa e coloque-as em uma placa de suspensão de cultura de células de 10 centímetros preenchida com 10 mililitros de meio de diferenciação e, em seguida, coloque a placa em um agitador orbital ajustado para baixa velocidade na incubadora.

Após mais dois dias, centrifugue as células a 200 vezes G por três minutos e remova o sobrenadante. Para induzir a diferenciação do corpo embrióide em células progenitoras neurais, ressuspenda as células em meio de diferenciação com ácido retinóico de cinco micromolares. Incube a placa por dois dias e, em seguida, substitua a metade mínima do meio por meio novo, inclinando a placa e pipetando-a.

Colete as células dois dias depois, centrifugando-as a 200 vezes G por três minutos e removendo o sobrenadante. Fixe os corpos embrióides e as células progenitoras neurais com 4% de PFA em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova o PFA e lave as células em PBS por cinco minutos.

Incubar as células em série em soluções de sacarose PBS 10, 20 e 30%, a 25 a 28 graus Celsius, com cada incubação durando 30 minutos ou mais até que as células se depositem no fundo do tubo. E use-o para transferir a amostra para o centro de um criomolde, pipetando o excesso de líquido. Adicione cuidadosamente a temperatura de corte ideal ou a solução OCT ao molde, sem ressuspender a amostra, e remova as bolhas excessivas com uma pipeta.

Coloquei o molde com a amostra em um misturador de laboratório em baixa velocidade por 15 minutos, que assentará os corpos embrióides e as células progenitoras neurais no fundo da solução de OCT. Em seguida, congele rapidamente a amostra colocando o molde em nitrogênio líquido. Bloqueie seções de OCT ou câmaras de cultura contendo neurônios em soro de burro normal a 10% e Triton X-100 a 0,1% em PBS por uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, incube as amostras em anticorpo primário, diluído em soro de burro normal a 5% e Triton X-100 a 0,05% em PBS, a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave as amostras em PBS com 0,1% Triton X-100 três vezes por cinco minutos por lavagem. Incube-os com anticorpo secundário, diluído em soro de burro normal a 5% e Triton X-100 a 0,05% em PBS, por uma hora em temperatura ambiente.

Repetir as lavagens em Triton X-100 e PBS e, em seguida, incubar a amostra em DAPI de um micrograma por mililitro. Monte a amostra com uma lamínula e algum meio de montagem, deixe-a secar e fotografe-a com um microscópio de fluorescência. Para realizar a diferenciação de neurônios, as células E14 foram cultivadas em fibroblastos embrionários de camundongos irradiados com gama até que a população de fibroblastos se diluísse.

A pluripotência das células E14 foi confirmada com a coloração de fosfatase alcalina. Após a diferenciação, os corpos embrionários tinham uma forma redonda que aumentava continuamente de tamanho. No dia 10, as células progenitoras neurais que se diferenciam em neurônios tinham uma forma de célula alongada.

Experimentos de imunofluorescência foram realizados em células progenitoras neurais no oitavo dia e em neurônios no dia 12. A coloração positiva foi observada para nidificação em células progenitoras neurais e para neurofilamento em neurônios. Uma linhagem de células-tronco embrionárias de camundongo expressando um repórter GFP acionado por promotor Sox1 foi diferenciada e a citometria de fluxo foi realizada nas células-tronco embrionárias e nas células progenitoras neurais.

Verificou-se que 58,7% do total de células no estágio NPC são GFP positivo, enquanto 0% são GFP positivo no estágio ESC. Experimentos de sequência de RNA foram realizados em células-tronco embrionárias E14, corpos embrióides e células progenitoras neurais. Os genes no mapa de calor da sequência de RNA foram classificados com base em seus níveis de expressão.

A análise da ontologia gênica dos quatro grupos de genes mostrou que eles correspondem a funções ou vias celulares distintas. Ao executar este protocolo, o EBS deve aparecer como massas esféricas e enegrecidas de células. Para garantir que o EBS cresça com isso, mude o meio no primeiro dia, se o meio começar a ficar amarelado.

A mesma abordagem é importante para a cultura de MPC, pois tanto os EBs quanto os MPCs estão em um estágio crítico de desenvolvimento embrionário inicial. Outros ensaios genômicos funcionais, como ChIPseek e ensaios de captura de confirmação de cromatina dos diferentes estágios de diferenciação de neurônios, podem ser realizados para entender os processos biológicos subjacentes. A integração por ensaios genômicos químicos e funcionais no processo de diferenciação de neurônios permite que os pesquisadores delineiem melhor os mecanismos moleculares do desenvolvimento embrionário inicial.