Name: Cultura e Ensaio de Caenorhabditis em Grande Escala populações elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a cultivar populações de Caenorhabditis elegans em grande escala para pesquisas de omica. Este método permite análises comparativas com mínima manipulação e documentação confiável do crescimento populacional.

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Agradecemos aos membros do Laboratório Edison por discussões úteis e feedback sobre este manuscrito; em particular, B.M. Garcia. Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), e pelo CeNDR, que é financiado pela NSF Living Collections CSBR 1930382. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do NIH (U2CES030167).

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Uma variedade de vasos pode ser usado como um LSCP. Neste protocolo, foi utilizada uma assadeira padrão de vidro. Os LSPCs em uso tinham dimensões externas de 35,56 x 20,32 cm, dimensões internas de 27,94 x 17,78 cm, e aproximadamente 4,45 cm de profundidade e vinham com uma tampa equipada. Assim, a quantidade de bactérias utilizadas aqui foi otimizada para um LSCP com as dimensões acima para produzir uma grande população de vermes em estágio misto. O volume e a concentração bacterianas podem ser ajustados para atender às necessidades experimentais.
A contaminação por, fungos ou outras fontes bacterianas pode ocorrer em qualquer etapa do método LSCP, por isso manuseie amostras com cuidado. Antes de iniciar qualquer etapa do protocolo, certifique-se de que o espaço de trabalho seja limpo com 70% de etanol e 10% de alvejante. Se disponível, trate as áreas usadas com luz UV por 30 minutos e ligue um filtro de ar HEPA 30 minutos antes de iniciar cada etapa.
Ao cultivar o LSCP em uma configuração controlada (ou seja,, em uma sala de tomografia situada a 20 °C), o usuário pode acompanhar mais facilmente o crescimento da amostra e documentar a contaminação potencial. Se a superfície do LSCP estiver contaminada, corte a contaminação quando possível e deixe que a amostra continue a crescer ou descarte a amostra se a contaminação não for possível de controlar. É imperativo abordar a contaminação rapidamente para reduzir o crescimento indesejado e garantir que não seja superando os vermes por recursos.
Este método destina-se àqueles que querem cultivar culturas de população mista em larga escala de C. elegans. Embora possa ser possível cultivar populações sincronizadas de vermes no LSCP como feito em placas de Petri disponíveis comercialmente e na cultura líquida, os autores não testaram essa opção. Além disso, se os usuários desejam cultivar mais de 2,4 milhões de worms em média em uma determinada amostra, um método diferente é recomendado4. O sucesso do crescimento depende da tensão que está sendo processada no gasoduto. Os autores foram capazes de cultivar com sucesso populações de aproximadamente 2,4 milhões de vermes em pelo menos cinco réplicas biológicas de 15 cepas de C. elegans, indicando que o método é robusto.
Antes de iniciar o experimento, observe que a idade e a saúde de um determinado verme podem influenciar a fecundidade e o tempo subsequente de crescimento populacional. Certifique-se de que os vermes sejam mantidos em condições saudáveis com o mínimo de estresse antes de serem usados neste gasoduto. Supõe-se que amostras de estoque foram criadas, congeladas e mantidas a -80 °C para reduzir a deriva genética ao longo do tempo.
Dependendo das necessidades de um determinado experimento, o número de adultos gravid iniciantes em um LSCP pode ser alterado. Alterar o número de adultos gravid iniciantes no LSCP mudará a taxa de crescimento e, portanto, tempo para colher. Cinco adultos gravid são usados para semear cada LSCP pelas seguintes razões: (1) Uma maneira simples, rápida e eficiente de semear muitas cepas de C. elegans em LSCPs de uma só vez foi necessária e (2) para reduzir as diferenças de idade entre os adultos gravid escolhidos que poderiam levar à heterogeneidade de crescimento.
Este método permite ao usuário colher grandes populações de vermes com todas as etapas do ciclo de vida presentes. Com os métodos atuais disponíveis, coletar amostras em larga escala de C. elegans requer sincronização alvejante para obter o número de vermes desejados para o trabalho a jusante. Dada essa abordagem, pode-se agora cultivar o maior número possível de vermes em fermentadores ou culturas líquidas em larga escala sem as dificuldades associadas à sincronização do alvejante e múltiplas etapas de manuseio. Nosso protocolo permite atingir as cepas de interesse de forma eficiente, usar o tempo mínimo de manuseio no crescimento da amostra em si e isolar estágios de vermes ou a população conforme necessário em dutos a jusante.
Um LPFC foi utilizado como uma ferramenta para documentar a distribuição e o tamanho da população em um determinado LSCP. O LPFC utilizado é um sistema de fluxo contínuo que analisa, classifica e distribui worms com base em seu tamanho (TOF) e densidade óptica. À medida que um determinado verme passa pela célula de fluxo, o detector de perda de luz axial captura a quantidade de luz de sinal bloqueada por um laser de estado sólido de 488 nm pelo tempo que leva um worm para passar, dando ao usuário o TOF e a densidade óptica do worm. A óptica e detectores de coleta de fluorescência também podem ser utilizados para maximizar a sensibilidade e a coleta de fluorescência em cada amostra. Os parâmetros de coleta LPFC variam de acordo com o instrumento. Os usuários podem empregar uma variedade de plataformas para capturar o tamanho do worm e não se limitam a usar este protocolo se um LPFC não estiver disponível.
Os autores estão usando amostras cultivadas no método descrito aqui para identificar metabólitos desconhecidos em várias cepas de C. elegans via Cromatografia Líquida – Espectrometria de Massa, Espectroscopia de NMR e sequenciamento de RNA. Os autores planejam continuar a usar este método para o crescimento de amostras neste pipeline com uma variedade de cepas C. elegans, pois novas cepas de interesse podem ser facilmente processadas usando este pipeline.

C. elegans é um pequeno nematode de vida livre que é encontrado em todo o mundo em uma variedade de habitats naturais1. Sua relativa facilidade de crescimento, tempo de geração rápida, sistema de reprodução e corpo transparente fazem dele um poderoso organismo modelo que tem sido amplamente estudado em biologia do desenvolvimento, envelhecimento, neurobiologia e genética2,3. O trabalho abundante em C. elegans faz dele um candidato primordial a usar em estudos de omics para vincular de forma abrangente fenótipos com componentes biológicos complexos e suas relações em um determinado organismo.
Para usar C. elegans em pesquisas colaborativas de omics, é necessário um método para gerar grandes populações de animais em estágio misto onde uma única amostra pode ser dividida e usada em diversas plataformas e instrumentos para análises comparativas. Criar um pipeline para gerar tal amostra requer uma consciência aguçada da dieta, ambiente, estresse, estrutura populacional e manuseio e coleta de amostras. Portanto, é crucial ter condições de cultivo padrão e reprodutível integradas em dutos de grande escala. Na pesquisa de C. elegans, dois métodos tradicionais são usados para cultivar vermes - pratos ágar Petri e cultura líquida4.
Historicamente, quando grandes quantidades de C. elegans são necessárias, elas são cultivadas na cultura líquida4. As etapas envolvidas na geração de uma grande população de vermes na cultura líquida exigem múltiplas etapas de manuseio que muitas vezes incluem a sincronização alvejante para romper cutículas adultas gravid, liberando embriões para alcançar o tamanho populacional desejado. No entanto, quando a sincronização do alvejante é utilizada, o crescimento populacional depende do tamanho do censo inicial e, portanto, afeta o crescimento subsequente e o número populacional. Além disso, as cepas de C. elegans variam em sua sensibilidade cutícula, tempo de exposição e resposta ao estresse à sincronização alvejante, dificultando o ensaio de muitas cepas ao mesmo tempo5,6,7,8,9.
Além disso, o crescimento de vermes na cultura líquida requer algumas etapas de transferência, pois muitas vezes é recomendado cultivar apenas uma geração de vermes antes da colheita, pois a superlotação pode ocorrer facilmente se cultivada por várias gerações e levar à formação de dauer, apesar da presença de alimentos10. A formação de dauer ocorre através de pequenas moléculas de sinalização, como ascarosides, muitas vezes referidas como "feromônios dauer"11,12,13,14, são liberadas em mídia líquida e afetam o crescimento da população. Além disso, o crescimento de grandes populações de vermes na cultura líquida leva ao acúmulo excessivo de bactérias na cultura, criando dificuldades quando uma amostra limpa é necessária para ensaios fenotípicos a jusante. Por fim, quando uma cultura líquida se contamina, é mais difícil de manter, pois esporos fúngicos ou células bacterianas são facilmente dispersos pela mídia15.
O outro método tradicional de cultivo de C. elegans está em pratos de ágar Petri. As placas de Petri disponíveis comercialmente permitem que se cresça facilmente várias gerações de vermes de palco misto sem os efeitos rápidos da superlotação e alta formação de dauer, como visto em culturas líquidas. No entanto, uma desvantagem para o crescimento de vermes em pratos tradicionais de ágar Petri é que a maior placa de Petri comercialmente disponível não produz grandes populações de vermes para um estudo de omics sem adicionar uma etapa de sincronização alvejante. Em resumo, a cultura de populações mistas de C. elegans em pratos de ágar Petri é mais adequado para coletar dados de omics, mas exigimos um método para gerar tamanhos populacionais muito grandes sem cultivo líquido.
Aqui, apresentamos um método para a cultura e coletamos grandes populações de elegans de estágio misto em placas de cultura em larga escala (LSCP). A coleta de amostras através deste pipeline produz amostras suficientes para coletar dados fenotípicos e populacionais, juntamente com quaisquer dados necessários para experimentos de omics(ou seja,genômica, transcriômica, proteômica e metabolômica). Além disso, o método LSCP requer manipulação mínima dos animais, menos tempo de preparação do usuário, fornece um controle ambiental rigoroso e garante que o manuseio de cada amostra seja consistente ao longo do estudo para a reprodutibilidade geral.

<table><tbody><tr><td>Pipetas Serológicas Estéreis de 10 mL</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de 10 ul</td><td>VWR</td><td>89079-438</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta 100 ul</td><td>VWR</td><td>89079-442</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduado de 1000 mL</td><td>VWR</td><td>10124-380</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de 1000 ul</td><td>VWR</td><td>89079-488</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 190 Proof</td><td>VWR</td><td>89125-166</td><td></td></tr><tr><td>Frasco Erlenmeyer de 2 L de pescoço largo</td><td>VWR</td><td>75804-654</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 mL</td><td>VWR</td><td>75874-294</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Aspiração de Fluido G de Controle BVC</td><td>Vacuubrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma</td><td>C3045-25G</td><td></td></tr><tr><td>Clorox Bleach</td><td>VWR</td><td>89414-502</td><td></td></tr><tr><td>Sala de Controle de Temperatura do Conviron</td><td>Conviron</td><td></td><td>https://www.conviron.com/environmental-rooms</td></tr><tr><td>Corning Low Volume 384 Well Preto com Microplaca de Poliestireno Transparente Tratada com TC</td><td>VWR</td><td>89089-866</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Acuspin 3R</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de fundo plano de 24 poços</td><td>VWR</td><td>29443-952</td><td></td></tr><tr><td>Purificador Honeywell True HEPA 465 pés quadrados.</td><td>Home Depot</td><td>204390560</td><td></td></tr><tr><td>HT115 E. coli (DE3)</td><td>CGC</td><td>HT115(DE3)</td><td>https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>470224-038</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura em Grande Escala (LSCP)</td><td>Pyrex</td><td>1090948</td><td>Panela de vidro Pyrex de 2 litros com tampa vermelha</td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio</td><td>Sigma</td><td>C86677-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>97062-998</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas simples de microscópio</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Millipore</td><td>Millipore</td><td>1.11727.2500</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivos Moleculares ImageXpress</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>Número do modelo: IXMConfocal</td><td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Autores usaram MetaXpress Software Versão 6.5.4.532</td></tr><tr><td>Nistatina (10mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>N6261-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Sigma</td><td>P7750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (6 cm)</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de Pipeta</td><td>VWR</td><td>613-4180</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Monobásico de fosfato de potássio</td><td>VWR</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Microsferas Fluroscentes Vermelhas</td><td>Policiências</td><td>19507-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>746398-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Fisher</td><td>111357</td><td></td></tr><tr><td>Dibásico Dibásico de Sódio Anidro</td><td>Fisher</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto padrão de pipetas Gilson</td><td>Gilson</td><td>FA10002M, FA10004M, FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina (100mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Union Biometrica COPAS BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>https://www.unionbio.com/biosorter/, os autores usaram: Flow Pilot versão 1.6.1.3.</td></tr></tbody></table>

cultura e ensaio de caenorhabditis em grande escala populações elegans

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) tem sido e continua sendo um organismo modelo valioso para estudar biologia do desenvolvimento, envelhecimento, neurobiologia e genética. O grande conjunto de trabalhos em C. elegans torna-se um candidato ideal para se integrar em estudos de grande população, em animais inteiros para dissecar os complexos componentes biológicos e suas relações com outro organismo. Para usar C. elegans em pesquisas colaborativas de omics, é necessário um método para gerar grandes populações de animais onde uma única amostra pode ser dividida e avaliada em diversas plataformas para análises comparativas.
Aqui, um método para cultivar e coletar uma abundante população de elegans em estágio misto em uma placa de cultura em larga escala (LSCP) e dados fenotípicos subsequentes é apresentado. Este pipeline produz número suficiente de animais para coletar dados fenotípicos e populacionais, juntamente com quaisquer dados necessários para experimentos de omics (ou seja, genômica, transcriômica, proteômica e metabolômica). Além disso, o método LSCP requer manipulação mínima para os próprios animais, menos tempo de preparação do usuário, fornece um controle ambiental rigoroso e garante que o manuseio de cada amostra seja consistente durante todo o estudo para a reprodutibilidade geral. Por fim, são apresentados métodos para documentar o tamanho populacional e a distribuição populacional das etapas de vida de C. elegans em uma determinada LSCP.

O crescimento de C. elegans usando o método LSCP produz uma média de aproximadamente 2,4 milhões de vermes em estágio misto por amostra ao longo de 12,2 dias. O crescimento de C. elegans usando o método LSCP permite que os usuários gerem grandes populações de estágios mistos de C. elegans com pouco manuseio e manipulação dos animais, o que é ideal para estudos de omics em larga escala(Figura 1). Uma vez que um LSCP se tornou cheio de vermes adultos, atingiu um grande tamanho populacional, e tem bactérias mínimas, os usuários podem colher e estimar o tamanho da população. Este ponto também pode servir como um controle de qualidade, avaliando se a população é suficiente para usar em um gasoduto -omics(Figura 2). A dinâmica populacional depende da tensão em si, do comportamento da cepa (ou seja,das cepas de escavação tendem a ter menor recuperação de vermes) e do sucesso do crescimento(ou seja,da contaminação). O método LSCP foi testado em 15 cepas de C. elegans contendo uma mistura de mutantes do Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) e caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) cepas selvagens25. Genótipos de cepa são descritos na Tabela Suplementar 3.
O método LSCP produziu tamanhos populacionais de aproximadamente 94.500 a 9.290.000. O tamanho médio da população dentro da cepa de referência, PD1074, e entre as cepas foi de aproximadamente 2,4 milhões de vermes(Figura 3). Não foram encontradas diferenças significativas nos tamanhos populacionais estimados entre as cepas de C. elegans ao longo de uma média de 12,2 dias de crescimento LSCP(Figura 4). Os LSCPs PD1074 levaram entre 10 a 14 dias para crescer em uma população mista completa. O tempo médio de crescimento em PD1074 foi de 10 dias. A cepa de crescimento mais lenta cresceu por um máximo de 20 dias, e a cepa de crescimento mais rápido cresceu por um mínimo de 10 dias(Figura 4).
Portanto, usando este método LSCP, os usuários podem facilmente integrar novas cepas de interesse em um estudo com pouco conhecimento de tempo de desenvolvimento e experiência em antecedentes. Observe que cepas e fenótipos que devem ser mantidos por meio da colheita, têm defeitos de fecundidade, são heterozigos, ou têm defeitos de crescimento podem não funcionar bem neste gasoduto.
A citometria de fluxo de partículas de grande porte e a imagem das amostras permitem que os usuários documentem a distribuição populacional. Uma grande variedade de plataformas pode ser usada para medir o crescimento populacional bem-sucedido.
Para medições reprodutíveis de omics, é importante cultivar culturas consistentes. As métricas da reprodutibilidade cultural são o número de vermes e uma distribuição de tamanho consistente para uma determinada cepa. Mostramos a distribuição amostral para a cepa de referência, PD1074 – uma variante da cepa original N2 Bristol, utilizando as imagens do microscópio LPFC23,26 e micro confocal como proxies para o sucesso do crescimento. Como os vermes foram medidos a partir da fase L1 através do gravid adulto na distribuição lpfc(Figura 5),imagem subsequente(Figura 6), e a variação na distribuição populacional entre amostras(Figura 7), podemos ver que este gasoduto gerou uma população em estágio misto de C. elegans.
Para ver de perto a distribuição populacional de nossas amostras de estágio misto, analisamos a distribuição de 35 LSCPs PD1074 olhando para o percentual de vermes que se enquadram em cada região em toda a distribuição time of flight (TOF) (ou seja,comprimento do corpo)(Figura 7A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do pipeline de crescimento de vermes LSCP. (A) Uma vez recebidas no laboratório, todas as cepas foram preparadas e congeladas para armazenamento a longo prazo a -80 °C2. (B) Uma placa "pedaço mestre" foi preparada a partir de um caldo de minhoca congelado e armazenada a 15 °C para ser usada por no máximo um mês. (C) Cada amostra passou por quatro etapas sucessivas de chunking para reduzir o estresse geracional antes de crescer no LSCP. (D) 5 adultos gravid individuais foram escolhidos da placa "chunk 4" 6 cm em Step (D) e manchas branqueadas em cinco áreas dadas do LSCP. (E) O LSCP foi colocado em uma sala de Temperatura Controlada e cresceu a 20 °C até que o LSCP estava cheio de vermes adultos, atingiu um grande tamanho populacional, e tinha bactérias mínimas. (F) A população de vermes foi colhida e coletada para passos a jusante. (G) As alíquotas foram criadas a partir do LSCP e foram congeladas por flash para aplicações desejadas a jusante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig02.jpg"> Figura 2: Visão geral da colheita do LSCP e estimativa do tamanho da população. (A) 50 mL de M9 foram usados para lavar vermes da superfície NGMA. A suspensão do verme foi escoada em um tubo cônico de 50 mL. Step (A) foi repetido duas vezes. (B) 15 mL de suspensão de vermes foi derramado em um novo tubo cônico de 15 mL. Vermes foram pelotados por centrifugação. M9 + detritos foram aspirados sem perturbar a pelota de verme. O passo (B) foi repetido até que todos os 150 mL de suspensão do verme foram coletados. (C) A pelota de verme foi lavada e centrifugada três vezes com M9 para eliminar detritos remanescentes. Uma vez que a amostra estava limpa, a pelota de verme foi resuspended em 10 mL de ddH2O. (D) Uma diluição serial da amostra foi criada para estimar o tamanho da população de vermes. Foram utilizados os fatores de diluição que permitiam a contagem de vermes com precisão. O fator de diluição utilizado mudou dependendo do tamanho populacional do LSCP. (E ) Uma vez escolhida a(E)fator de diluição, todos os vermes das três réplicas alíquotas dessa diluição foram esbofeinados em um slide limpo e os vermes foram contados sob um microscópio dissecando. (F) A amostra foi dividida em alíquotas de tamanho apropriado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig03.jpg"> Figura 3: Método LSCP gerado em média uma população de 2,4 milhões de vermes em estágio misto. O LSCP produz tamanhos populacionais nos menores crescimentos populacionais em cerca de 94.500 e nos maiores crescimentos populacionais em torno de 9.290.000. O tamanho médio da população em todas as cepas foi de 2,4 milhões de vermes. Barras abaixo de C. elegans nomes de cepas indicam se uma cepa é um mutante CGC ou isolado natural CeNDR. O tamanho da amostra LSCP é exibido para cada cepa. Foram realizadas comparações para todos os pares que utilizam o Teste HSD de Tukey. Não foram observadas diferenças significativas entre os tamanhos populacionais estimados em cepas de C. elegans (F(14.108) = 0,7, p = 0,77). As barras coloridas indicam displays de cores padrão para a representação da tensão C. elegans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig04.jpg"> Figura 4: O método LSCP gerou grandes populações mistas de vermes em 10 a 20 dias. Um dado C. elegans LSCP cresceu até que a amostra estava cheia de vermes adultos, atingiu um grande tamanho populacional, e tinha o mínimo de grama bacteriana sobrando. Os LSCPs levaram entre 10 a 20 dias para crescer em uma população em estágio misto completo, dependendo da tensão. O tempo médio de crescimento em todas as cepas foi de 12,2 dias. O tamanho da amostra LSCP é exibido para cada cepa. Cada barra de erro foi construída utilizando-se 1 desvio padrão da média. Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes. Comparações para todos os pares usando o Teste HSD da Tukey. Uma diferença significativa foi encontrada na quantidade de tempo de crescimento no LSCP necessário em todas as cepas de C. elegans (F(14.108) = 8,8, p < 0,0001*). As barras coloridas indicam displays de cores padrão para a representação da tensão C. elegans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2.jpg"> Figura 5: População mista e medição de crescimento da cepa de referência do tipo selvagem, PD1074. Uma distribuição LPFC representativa de um crescimento LSCP da cepa de referência do tipo selvagem, uma variante da cepa original de N2 Bristol, (PD1074) documenta a distribuição de tamanho e contagem de eventos de uma população em estágio misto. O eixo x exibe o comprimento (Time of Flight, TOF) dos worms classificados. O eixo y exibe a densidade óptica (extinção óptica, EXT) dos worms classificados. Cada ponto de dados é um worm que foi documentado na amostra. Cada região TOF utilizada para análise de imagens é exibida em uma cor diferente. Foram criadas vinte regiões TOF (R2 – R21) variando de um TOF de 50 a 2050. Os detalhes sobre cada região do TOF podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig06.jpg"> Figura 6: Imagens de vermes classificados de regiões TOF que variam de R2 – R12 mostram a distribuição PD1074 LPFC. Na região R2, vermes L1 podem ser identificados e na região R9 são predominantemente gravid adultos, abrangendo os dois extremos larvais de desenvolvimento que nos dão regiões aproximadas dentro da distribuição de citômetros de fluxo de onde são esperados estágios na distribuição. A barra de escala representa 1 mm. As imagens representativas foram tiradas da distribuição LPFC exibida na Figura 5, e as caixas coloridas correspondem às regiões da Figura 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61453/61453fig07.jpg"> Figura 7: Distribuição populacional através do tempo de voo (TOF) regiões na cepa de referência do tipo selvagem, PD1074. Distribuição de vermes em toda a região da TOF mostrando as regiões onde os vermes foram encontrados. Cada LSCP PD1074 é representado como uma cor individual. (A) O eixo x mostra as vinte regiões TOF (R2 – R21) observadas e contadas para o LSCP, exibindo toda a distribuição de tamanho. O eixo y mostra a porcentagem de vermes de um determinado LSCP que tinha um tamanho corporal que caiu em uma determinada região TOF. (B) Como uma fração menor da população de vermes cai entre as regiões R7-R21, o registro do percentual de vermes que caíram dentro de cada região foi levado para exibir a distribuição populacional. O eixo x exibe as regiões R7-R21 TOF. O eixo y exibe o registro da porcentagem de worms de um determinado LSCP que tinha um tamanho corporal que caiu em uma determinada região TOF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Temperatura média diária (°C) das condições de crescimento sob as quais o LSCP foi cultivado e manuseado. As temperaturas reportadas da sala de Temperatura Controlada (TC) foram documentadas e coletadas ao longo do período de seis meses de crescimento e coleta da amostra. A temperatura média diária é relatada aqui. Não foram observadas diferenças significativas entre a temperatura em que o LCSP cresceu durante a duração do projeto (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). Toda a diferença de temperatura não foi superior a 0,003 °C durante o período de seis meses de crescimento e geração da amostra. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/61453supfig01.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Tabela suplementar 1: As regiões fechadas tof costumavam classificar vermes em placas de 384 poços para imagem. Foram criadas regiões binadas para abranger um TOF de 100 em toda a distribuição TOF de 50 a 2050. Regiões fechadas podem ser alteradas e otimizadas para atender às suas necessidades. Cada região TOF utilizada para análise de imagens é exibida em uma cor diferente. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table1_FINAL.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela suplementar 2: modelo de placa de 384 poços de regiões TOF e replicação de layout. Cada amostra foi classificada em uma placa de 384 poços para imagem. Foram criadas quatro réplicas para cada região selecionada para classificação. Regiões fechadas podem ser alteradas e otimizadas para atender às suas necessidades. Consulte a Tabela Suplementar 1 para regiões fechadas específicas criadas e utilizadas neste protocolo. Cada região TOF utilizada para análise de imagens é exibida em uma cor diferente. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table2_FINAL.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela suplementar 3: C. as cepas de elegans utilizadas neste protocolo contêm uma mistura de cepas CGC e CeNDR. A cepa, o genótipo, a fonte de tensão e os detalhes estão descritos nesta tabela. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61453/Supplementary_Table3_FINAL.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Para usar caenorhabditis elegans (C. elegans) em pesquisas de omics, um método é necessário para gerar grandes populações de vermes onde uma única amostra pode ser medida entre plataformas para análises comparativas. Aqui, é apresentado um método para cultivar populações de C. elegans em placas de cultura em larga escala (LSCPs) e documentar o crescimento populacional.

Cultura e Ensaio de Caenorhabditis em Grande Escala populações elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Esta técnica nos permite coletar populações de vermes em larga escala para serem usadas para múltiplas plataformas de omics com manipulação mínima. Esta técnica nos permite coletar populações de C.elegans em estágio misto em múltiplos experimentos de omics para obter uma imagem holística de cada amostra. Para o branqueamento de manchas de adultos gravid em placas de cultura em grande escala, flame um worm pick over a Bunsen burner e use a escolha para colher E.coli fresco da borda do gramado bacteriano em uma placa de cultura em grande escala.Escolha um único adulto gravid a partir da placa do quarto pedaço para branqueamento de manchas e adicione cinco microliters de solução de hipoclorito alcalino recém-preparada em um canto da placa de cultura em grande escala longe do gramado E.coli. Coloque o adulto gravid na solução alcalina de hipoclorito e toque no nematoide para interromper a cutícula e liberar ovos. Quando um total de cinco adultos foram colocados uniformemente ao redor do gramado E.coli da mesma maneira, coloque a tampa de volta na placa.Para colher amostras de placas de cultura em larga escala, despeje 50 mililitros de solução M9 em uma superfície de placa de cultura em larga escala e gire a placa para garantir que o M9 cubra toda a superfície média de crescimento de nematoides. Prime uma pipeta sorológica estéril com M9 e incline a placa para que a população de M9 e vermes se reúna em um canto da placa. Use a pipeta preparada para aspirar a suspensão do verme e adicionar os vermes a um tubo cônico de 50 mililitros.Coloque o tubo em um roqueiro para interromper qualquer aglomerado bacteriano e detritos. Quando todos os vermes tiverem sido coletados das três placas, transfira 15 mililitros de vermes de cada tubo para cada um dos três tubos cônicos de 15 mililitros e sedimente os vermes nos tubos por centrifugação. Aspire cuidadosamente os supernantes sem perturbar as pelotas de vermes e adicione 13 mililitros de suspensão de vermes a cada tubo.Inverta os tubos para resuspengar as pelotas e lavar o máximo de bactérias e detritos possível e centrifugar os vermes novamente. Quando toda a população de vermes tiver sido coletada, lave as pelotas de verme três vezes em 10 mililitros de solução M9 fresca por lavagem. Após a última lavagem, resuspenda cada pelota de verme limpa em 10 mililitros de água dupla destilada.Para a estimativa do tamanho populacional, dilui rapidamente três alíquotas de 100 microliteres de amostra de vermes de cada tubo em 900 microliters de solução M9 por amostra e use as alíquotas para fazer diluições seriais. Coloque as suspensões da amostra de vermes em um roqueiro para o movimento contínuo das culturas enquanto as alíquotas estão sendo contadas e misture as diluições de vermes até que sejam homogêneas. Adicione cinco microlitros de solução da primeira amostra de vermes a 10 amostras de vermes a um slide de microscópio de vidro e conte os vermes por microscopia leve.Se houver menos de 50 vermes na amostra, conte as diluições de 1:100 e 1:1.000. Se houver mais de 50 vermes, mova-se para a próxima diluição serial. Após contar cada réplica de alíquota de cada diluição três vezes, a média da diluição conta para determinar o tamanho populacional estimado do verme.Em seguida, divida as amostras de vermes nas alíquotas experimentais apropriadas e congele as amostras em nitrogênio líquido para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para preparar uma amostra de vermes para grande citometria de fluxo de partículas, diluir cerca de cinco vezes 10 para o quarto aliquot de vermes de estágio misto para um volume final de 10 mililitros de solução M9 e adicionar 200 microlitadores de um miligrama por mililitro E.coli e 1:50 diluição de 0,5 micromolar solução fluorescente fluorescente para o worm de suspensão. Após uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente com balanço, colete os vermes e microesferas por centrifugação e lave os vermes duas vezes com uma solução M9 fresca para remover qualquer excesso de bactérias e microesferas não internizadas.Após a segunda lavagem, resuspenja a pelota em cinco mililitros de solução M9. Se a pelota parecer limpa, adicione cinco mililitros de M9 suplementados com 50 milimões de sódio azida aos vermes e coloque o tubo em um roqueiro para endireitar e eutanásia os vermes para contagem e dimensionamento precisos. Para a documentação de distribuição populacional, abra o modelo calibrado de placa de 384 poços e defina o modelo para dispensar 20 objetos fechados em quatro poços para obter quatro réplicas técnicas de cada região fechada para cada uma das 20 regiões da barra da amostra.Carregue uma amostra de 40 mililitros de vermes no grande citômetro de fluxo de partículas e comece a classificar automaticamente a amostra enquanto agita continuamente a amostra para evitar a acomodação e simultaneamente distribuindo objetos da amostra para a placa calibrada de 384 poços. Uma vez que toda a amostra tenha sido classificada e o número máximo de regiões fechadas tenham sido dispensados na placa de 384 poços, remova a amostra do cítmetro e limpe o instrumento. O método de placa de cultura em larga escala foi testado em 15 cepas de C.Elegans, incluindo uma mistura de mutantes do Centro de Genética de Caenorhabditis e caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource ceps selvagens.Nesta análise, o método de placa de cultura em larga escala rendeu tamanhos populacionais de aproximadamente 94.500 a 9.290.000. O tamanho médio da população dentro da cepa de referência PD1074 e entre as cepas foi de aproximadamente 2,4 milhões de vermes. Não foram encontradas diferenças significativas nos tamanhos populacionais estimados entre as cepas de C.elegans ao longo de uma média de 12,2 dias de crescimento de placas de cultura em larga escala.As placas de cultura de grande escala PD1074 levaram entre 10 a 14 dias para crescer para uma população de estágio misto completo com um tempo médio de crescimento de 12,2 dias. A tensão de crescimento mais lenta cresceu por um máximo de 20 dias e a cepa de crescimento mais rápido cresceu por um mínimo de 10 dias. Nesta distribuição amostral para PD1074, os vermes foram medidos a partir do estágio L1 através de adulto árvid em um grande citômetro de fluxo de partículas.Imagens subsequentes e visualização das variações na distribuição populacional entre as amostras revelaram que o gasoduto gerou uma população em estágio misto de C.elegans. É importante contar com precisão os vermes ao longo da coleta de amostras para que você obtenha dados comparáveis entre crescimentos e estudos. Essa abordagem de coleta pode ser aplicada ao sequenciamento de RNA, genômica e outras análises omicas para expandir nossa compreensão da dinâmica complicada que ocorrem dentro das populações de C.elegans.Esta técnica nos permite coletar populações de C.elegans em estágios mistos em vários experimentos de omics para obter uma imagem holística de cada amostra.

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