Uma única abordagem de dissociação celular para análise molecular da bexiga urinária no rato após lesão medular

Este protocolo é significativo porque utiliza informações biológicas para facilitar a geração de uma única suspensão celular com alta viabilidade celular. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de gerar suspensões unicelulares que mantêm uma alta viabilidade celular e uma representação adequada dos tipos de células isoladas. Demonstrando o procedimento cirúrgico estará Hussein Atta, um colega do meu laboratório.

Demonstrando o procedimento de dissociação tecidual estará Ali Hashemi, e a análise FACS, Yaser Heshmati. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo pedal em um camundongo adulto anestesiado, palpe o processo espinhoso mais proeminente na coluna torácica. Analgesia e antibióticos são administrados antes da cirurgia.

Raspe um retângulo longitudinal na parte de trás do mouse, da parte inferior do pescoço até logo abaixo do processo espinhoso mais proeminente e um centímetro de cada lado da linha média. Desinfete a pele exposta três vezes com lenços sequenciais de iodopovidona a 10% e etanol a 70% de forma circular, começando no local da incisão e trabalhando para fora. Após a última limpeza, cubra o mouse com um pedaço estéril de gaze de quatro por quatro polegadas com uma janela sobre o campo cirúrgico.

Para induzir a lesão da medula espinhal, primeiro faça uma incisão de 1,5 centímetro no meio das costas e use uma dissecção brusca para separar os músculos dos processos espinhosos e as lâminas das vértebras T9, T10 e T11. Use uma tesoura fina para dividir nitidamente os ligamentos interespinhosos entre T9 e T10 e T10 e T11 antes de realizar uma laminectomia bilateral do processo espinhoso T10. Quando as lâminas estiverem completamente excisadas, use a tesoura para seccionar a medula espinhal.

Para cortar completamente as colunas laterais, varra delicadamente a ponta da tesoura fina dos dois lados. Use uma aplicação de ponta de algodão estéril para comprimir qualquer sangramento. Depois de atingir a homeostase, feche a pele com pontos contínuos de poliglactina910 7-0 e forneça subcutaneamente um mililitro de solução salina para evitar a desidratação pós-operatória e, em seguida, retorne o animal a uma gaiola fresca com monitoramento até a decúbito total.

A cada 12 horas, segurando o animal com uma mão e massageando a parte inferior do abdômen com a outra, use o dedo indicador e o polegar para localizar e comprimir suavemente a bexiga urinária distendida para estimular a expressão manual da bexiga até que o animal seja capaz de urinar por conta própria. Para análise a jusante dos tipos de células da bexiga de interesse, no ponto de tempo experimental apropriado e uma vez que o animal esteja adequadamente anestesiado, execute uma laparotomia da linha média da pelve ao diafragma e corte o diafragma das costelas. Seguindo a borda da cartilagem óssea paralela ao esterno, abra o tórax ao longo das costelas em ambos os lados do animal, começando no diafragma e prosseguindo para a primeira costela.

Após fixar a parede torácica anterior sobre a cabeça do animal, use uma tesoura fina para cortar o pericárdio e conecte uma agulha de calibre 23 ao aparelho de perfusão. Insira a agulha no ventrículo esquerdo e avance lentamente a agulha para a aorta sem perfurar o tecido. Quando a agulha estiver no lugar, comece a infundir o tecido com PBS a uma taxa de fluxo de 15 mililitros por minuto e use as pontas de uma tesoura fina para fazer rapidamente um pequeno corte no átrio direito.

Quando a drenagem estiver clara e uma cor de fígado clareada puder ser observada, pare a perfusão e libere a bexiga dos pedículos vasculares e da uretra, depois coloque a bexiga em um tubo de microcentrífuga contendo a solução de Tyrode gelada. Para preparar uma suspensão de célula única, quando todas as bexigas tiverem sido coletadas, rasgue um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 100 microlitros de solução de Tyrode. Após a pesagem, pique as bexigas em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo 100 microlitros de solução de Tyrode e use uma ponta de pipeta de furo largo para transferir os fragmentos de tecido para 2,5 mililitros de tampão de digestão por bexiga.

Incube o tecido por 40 minutos a 37 graus Celsius em um misturador Nutator e use uma pipeta de cinco mililitros para triturar a amostra por um minuto antes de coletar as células e tecidos dissociados por centrifugação. Ressuspenda o pellet em um mililitro de solução de desprendimento de células e coloque as células no misturador Nutator por mais 10 minutos. No final da incubação, recolher as células com outra centrifugação e ressuspender o pellet num mililitro de tampão de lise dos glóbulos vermelhos.

Após um minuto, pare a lise com a adição de nove mililitros de PBS e filtre as células através de um filtro de 70 micrômetros em um tubo de 50 mililitros, depois centrifugue as células novamente e ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de coloração suplementado com bloco FC. Após uma incubação de 10 minutos no gelo, recolher as células por centrifugação e ressuspender o sedimento no volume adequado de mistura principal de anticorpos conjugados com fluoróforo durante 20 minutos em gelo protegido da luz. No final da incubação, lave as células com um mililitro de tampão de coloração celular e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão de coloração de células frescas suplementado com cinco microlitros de FITC Anexina V e um microlitro de iodeto de propídio.

Após 15 minutos à temperatura ambiente, adicione 400 microlitros de tampão de ligação de anexina às células e misture por inversão. Para analisar as células por citometria de fluxo, primeiro use uma amostra de célula não corada para definir os parâmetros de dispersão lateral e direta das células e, em seguida, meça a emissão de fluorescência em 530 nanômetros e maior que 575 nanômetros para excluir as células mortas. Use as grades em cada mancha de pontos para definir a população negativa no primeiro decaimento e use os controles de fluorescência menos um para corrigir a sobreposição espectral até que os meios populacionais negativos e positivos estejam alinhados.

Em seguida, meça 100.000 eventos das células com os marcadores específicos de interesse, criando portas para as populações de células de interesse, conforme necessário. Quando todas as amostras tiverem sido executadas, analise os dados usando o software de análise de citometria de fluxo apropriado. Colágeno 1A1, colágeno 3A1, colágeno 1A2 e colágeno 6A1 são os tipos de colágeno mais abundantes encontrados na bexiga do camundongo.

A análise para determinar os níveis de expressão de mRNA dos colágenos um, três, seis e hialuronano revela que a expressão desses componentes da matriz extracelular é mais prevalente em populações de células mesenquimais do que no urotélio. A análise por citometria de fluxo indica que vários protocolos de digestão enzimática diferentes produzem populações de células altamente viáveis, com o terceiro protocolo de digestão usado nesta análise determinado como o mais eficaz na preservação celular. Usando este método, um aumento significativo no número total de células isoladas das bexigas de camundongos com lesão medular pode ser obtido para compará-lo com bexigas de controle.

Em comparação com os controles, as bexigas de animais com lesão medular também apresentam um aumento significativo de células CD45 positivas. A etapa 7.1 é importante para a identificação na população cardíaca. A estratégia de gating deve ser informada pelas células de interesse.

As bexigas de animais com LME têm população celular distinta. Este protocolo pode ser usado para classificação de células, cultura de células primárias, sequenciamento de célula única e outros procedimentos de molécula e célula a jusante que requerem células únicas viáveis. Este protocolo fornece alta viabilidade e, portanto, baixa perda de população de células, que é um ponto-chave para técnicas de análise de célula única, como sequenciamento de RNA de célula única.