Name: Uma única abordagem de dissociação celular para análise molecular da bexiga urinária no rato após lesão medular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprenda um método otimizado de dissociação tecidual para análise de células únicas da bexiga em modelo de lesão medular em camundongo. Esta técnica gera suspensões celulares de alta viabilidade para citometria de fluxo.

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Este trabalho foi apoiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (R01 DK077195 a R.M.A, R01 DK104641 a R.M.A e D.R.B). Reconhecemos informações valiosas do Dr. Stuart Orkin na Divisão de Hematologia/Oncologia, Hospital Infantil de Boston, Departamento de Pediatria, Harvard Medical School e no Instituto de Câncer Dana-Farber. Também reconhecemos o apoio de Kyle Costa no cuidado pós-operatório de camundongos, Mary Taglienti e Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Departamento de Pediatria, Divisão de Medicina Recém-Nascida, Departamento de Pediatria, Divisão de Medicina Recém-Nascida, Hospital Infantil de Boston, Harvard Medical School) para assistência técnica e discussões úteis.

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</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

O modelo de lesão medular do camundongo descrito aqui fornece um método reprodutível para criar uma obstrução funcional da saída da bexiga devido à perda de coordenação entre a contração da bexiga e o relaxamento do esfíncter uretral externo. Isso, por sua vez, evoca uma profunda remodelação da parede da bexiga logo após 2 semanas após a lesão caracterizada pela expansão dos compartimentos musculares urotelial e liso. As etapas críticas na implementação do modelo SCI em roedores incluem (i) atenção rigorosa à expressão manual da bexiga durante o período de choque espinhal que se segue para 10\u201214 dias após a lesão; (ii) enriquecimento nutricional para minimizar a perda de peso; e (iii) mitigação do potencial de escaldação de urina particularmente para experimentos que vão além do retorno do vazio reflexo. As limitações do modelo incluem o potencial de oclusão uretral em camundongos a partir de coágulos sanguíneos durante o período de hematuria transitória, e adicionalmente em camundongos machos de coagulo de semen após ejaculação retrógrada após a cirurgia.
A abordagem de dissociação tecidual descrita aqui ilustra a importância de considerar mudanças estruturais nos tecidos decorrentes do insulto experimental, neste caso uma remodelação significativa do tecido após a SCI que pode influenciar as análises a jusante. Com o aumento das análises de células únicas, é fundamental garantir que as diferenças observadas na expressão genética não sejam simplesmente resultado de perturbações induzidas por dissociação, mas sejam verdadeiramente representativas das mudanças biológicas subjacentes relevantes para o modelo da doença. O uso de dados de expressão disponíveis publicamente nos permitiu modificar a formulação de buffers de digestão para garantir uma digestão eficaz da matriz extracelular, maximizando a viabilidade. Modificações adicionais que poderiam ser consideradas em aplicações futuras incluem a adição de actinomicina D, para interromper a transcrição de genes iniciais imediatos sensíveis ao protocolo de dissociação15.
A técnica de pipetação é crucial ao dissociar tecido ou transferir células que já estão em suspensão. Para reduzir os danos físicos às células das forças de tesoura, é importante pipeta suavemente e lentamente durante a ressuspensão celular. É geralmente recomendado usar pontas de pipeta largas. Se usar as pontas padrão, é particularmente importante que as suspensões de células pipetas suavemente evitem forças de tesoura que de outra forma danificariam as células. O uso de filtros celulares é inevitável neste protocolo, no entanto, a concentração celular pode diminuir em 20% ou mais, acompanhada de uma perda de volume de 100 μL ou mais. Recomendamos que a concentração celular seja determinada após o esforço para garantir uma contagem precisa de células.
Na citometria de fluxo, os controles de FMO fornecem uma medida de fundo devido à sangria do sinal de picos de emissões sobrepostos. Eles não são uma medida de ligação de anticorpos inespecíficos, ou coloração de fundo que pode estar presente quando um anticorpo é incluído nesse canal. Para explicar a vinculação de anticorpos nãopecíficos, é preciso incluir controles isótipos apropriados; para a coloração de fundo, é preciso incluir controles negativos. Juntos, esses controles garantem uma medição precisa das populações celulares.

Perturbações da função normal da bexiga urinária podem levar à diminuição da qualidade de vida de muitos indivíduos. Para obter uma melhor compreensão de como lesões ou doenças descarrilam a função normal da bexiga, é importante sondar o estado biológico normal das células dentro da bexiga e como elas mudam sob perturbação experimental. Até hoje, porém, as populações celulares específicas que residem dentro da bexiga urinária, e como mudam com lesões, têm sido incompletamente caracterizadas.
Métodos de criação de perfil de células únicas, como citometria de fluxo ou sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) têm o potencial de lançar luz sobre tipos de células específicas dentro da bexiga. No entanto, para que essas abordagens sejam um tecido informativo deve ser digerido de forma que não afete a viabilidade, a expressão genética e os percentuais representativos da população celular do tecido colhido. Protocolos que empregam desagregação enzimática podem impactar a expressão do marcador de superfície através da atividade de protease indiscriminada1, impactando assim a identificação celular por citometria de fluxo, enquanto o processo de dissociação em si pode levar à indução de genes precoces imediatos, como descrito recentemente por Van den Brink e colegas2. Os autores mostraram que, embora a subpopulação afetada pela dissociação fosse pequena, poderia desencadear um forte sinal contaminante em estudos de expressão em massa devido aos altos níveis de expressão de genes precoces imediatos. Além disso, a duração do protocolo de dissociação afetou os níveis de expressão em massa detectados de genes mostrados exclusivos de algumas subpopulações. Assim, conjuntos de dados unicelulares gerados sem contabilizar o impacto do protocolo de dissociação podem produzir alterações na expressão genética decorrentes do método de dissociação, em oposição à biologia subjacente. Essas observações sugerem que os dados de transcrição de células únicas publicados devem ser interpretados com cautela, e que os resultados devem ser validados por métodos independentes.
Embora, métodos de dissociação severos e demorados possam alterar a expressão genética nas células2; o isolamento efetivo das células é essencial para obter uma representação precisa dos tipos celulares presentes. Uma vez que a bexiga é um órgão complexo composto por vários tipos de células, algumas populações como células urteliais ou estromais podem ser relativamente sub-representadas, enquanto outros tipos de células, como os fibroblastos, existem dentro da matriz extracelular e podem ser desafiadoras para se isolar. A dissociação torna-se ainda mais desafiadora se a bexiga tiver sofrido remodelação significativa e fibrose, como a observada na lesão medular3,4 ou obstrução da saída da bexiga5,6.
Aqui, descrevemos um método otimizado de dissociação de tecido para análise de células únicas a jusante na bexiga do rato lesado pela medula espinhal. Usando citometria de fluxo, comparamos quatro protocolos de digestão enzimática por sua capacidade de produzir uma única suspensão celular, suportar a viabilidade celular e manter a proporção correta das populações celulares. Com base nesta análise, concluímos que minimizar a morte celular, os agregados celulares, os ácidos nucleicos não celulares e os potenciais inibidores da análise a jusante são fundamentais para alcançar dados de alta qualidade.

<table><tbody><tr><td>2.5 X Lupas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de Ampliação 7-0 Sutura Vicryl, agulha de 6.5mm 3/8 círculo</td><td>ETHICON</td><td>J546</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtro de Células</td><td>Thermofisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Accutase em BPBS, 0.5mM EDTA</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Aerossol Pontas de Pipetador de Orifício Largo (1000 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Aerossol com Orifício Largo (1000 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rato monoclonal, IgG2a, &kappa;, afinidade purificada</td><td>BioLegend</td><td>118213</td><td></td></tr><tr><td>BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rato monoclonal, IgG2b, &kappa;, Clone 30-F11</td><td>BD Biosciences</td><td>564590</td><td></td></tr><tr><td>BONN Micro Dissecting Forceps, Reta, 1x2 dentes, 3,75" de comprimento, 0,3 mm de largura da ponta, 0,12 mm de dentes</td><td>ROBOZ Surgical Instrument CompanyInc.</td><td>RS-5172</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>2115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>CASTROVIEJO Micro Sutura Porta-agulhas, reto com trava, comprimento de 5,75"</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-6412</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Kit de contagem de células, 30 lâminas de câmara dupla, 60 contagens, com azul de tripano</td><td>Biorad</td><td>1450003</td><td></td></tr><tr><td>Cell Staining Buffer</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Tipo I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td></td>LS004196</tr><tr><td>Colagenase Tipo III</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004182</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase, Tipo 6</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS005319 Kit de</td><td></td></tr><tr><td>Apoptose de Células Mortas com Anexina V Alexa Fluor 488 & Iodeto de propídio (PI)</td> <td>Thermofisher</td><td>V13241</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacina (Baytril)</td> <td>Bayer Health Care LLC,</td> <td>NADA # 140-913 Aprovado pela FDA. Nº do lote: AH01CGP</td><td>Solução injetável a 2,27%</td></tr><tr><td>Falcon tubos de centrífuga cônicos de 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubos de centrífuga cônicos de 50 ml</td> Anticorpo anti-camundongo <td>Fisher Scientific</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FITC, monoclonal de rato, IgG2a, &kappa;, purificado por afinidade</td><td>BioLegend</td><td>122505</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase de testículos de ovelhas, Tipo II</td><td>Filtros Inteligentes Sigma</td><td>H2126</td><td></td></tr><tr><td>MACS (100 &micro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-110-917</td><td></td></tr><tr><td>McPHERSON-VANNAS, Tesoura de Mola Micro Dissecante, Reta, 4" de comprimento, largura da ponta de 0.15mm</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-5630</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-7959</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-camundongo CD19 Anticorpo, monoclonal de rato, IgG2a, &kappa;, purificado por afinidade</td><td>BioLegend</td><td>115509</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-rato CD3&epsilon; Anticorpo, hamster armênio monoclonal, IgG, purificado</td><td>por afinidade BioLegend</td><td>100309</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-camundongo CD4 Anticorpo, rato monoclonal, IgG2b, &kappa;, afinidade purificada</td><td>BioLegend</td><td>100409</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-camundongo CD8a Anticorpo, rato monoclonal, IgG2a, &kappa;, afinidade purificada</td><td>BioLegend</td><td>100709</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-camundongo NK-1.1 Anticorpo, monoclonal de camundongo, IgG2a, &kappa;, afinidade purificada</td><td>BioLegend</td><td>108715</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-camundongo TER-119/Anticorpo de células eritroides, IgG2b, &kappa;, afinidade purificada</td><td>BioLegend</td><td>116209</td><td>Canal de Despejo Purificado</td></tr><tr><td>Rato Anti-Rato CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rato monoclonal, IgG2b, &kappa;, Clone 2.4G2</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de hemácias (10X)</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos 1x</td><td>Tubos</td> de microcentrífuga <td>Biolegend 420201</td><td></td></tr><tr><td>com tampa de rosca, 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Pomada antibiótica tripla (neomicina/polimixina B/bacitracina)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-7216</td><td>protetor de pele</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X), sem vermelho de fenol</td><td>Thermofisher</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os olhos Vetropolycin</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>NADA # 065-016. Aprovado pela FDA.</td><td>proteger os olhos durante a anestesia</td></tr></tbody></table>

uma única abordagem de dissociação celular para análise molecular da bexiga urinária no rato após lesão medular

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Descrevemos a implementação de lesão medular em camundongos para provocar dissynergia detrusor-esfíncter, uma obstrução funcional da saída da bexiga e posterior remodelação da parede da bexiga. Para facilitar a avaliação da composição celular da parede da bexiga no controle não ferido e camundongos lesados na medula espinhal, desenvolvemos um protocolo de dissociação otimizado que suporta alta viabilidade celular e permite a detecção de subpopulações discretas por citometria de fluxo.
A lesão medular é criada por transeção completa da medula espinhal torácica. No momento da colheita de tecidos, o animal é perfundido com soro fisiológico tamponado com fosfato sob anestesia profunda e bexigas são colhidas no tampão de Tyrode. Os tecidos são picados antes da incubação no tampão de digestão que foi otimizado com base no conteúdo de colágeno da bexiga do rato, conforme determinado pelo interrogatório de bancos de dados de expressão genética disponíveis publicamente. Após a geração de uma única suspensão celular, o material é analisado por citometria de fluxo para avaliação da viabilidade celular, número celular e subpopulações específicas. Demonstramos que o método produz populações celulares com maior viabilidade de 90%, e representação robusta de células de origem mesenquimal e epitelial. Este método permitirá uma análise precisa a jusante de tipos de células discretas na bexiga do rato e, potencialmente, em outros órgãos.

Procedimento cirúrgico O sucesso da transeção da medula espinhal torácica é determinado pela avaliação de uma série de parâmetros, sendo o mais óbvio a paralisia da medula espinhal. O animal se move apenas usando seus membros dianteiros, arrastando seus traseiros. Caso contrário, os níveis de atividade, incluindo alimentação, preparação e alerta são tipicamente normais. Além disso, os animais perdem o controle volicional da bexiga, resultando na necessidade de expressão manual da bexiga pelo investigador a cada 12 h até que o reflexo anulado retorne em 10 a 14 dias após a lesão. Após a eutanásia, sinais adicionais do sucesso da lesão referem-se principalmente ao aumento da relação peso bexiga-corpo, indicativo de remodelação tecidual. A análise histológica revela a hiperplasia dentro dos compartimentos musculares urotelial e liso3.
Preparação de suspensão de célula única Utilizando dados de expressão disponíveis publicamente, foi determinado o enriquecimento do tecido da bexiga para proteínas matricias extracelulares(Figura 2) e utilizado para informar a formulação da mistura de digestão. Como as collagens são componentes-chave da parede da bexiga11,12, primeiro procuramos determinar o colágeno mais abundante na bexiga do mouse usando conjuntos de dados de perfil de RNA gerados pelo projeto Mouse ENCODE13. Nossa análise mostrou que o colágeno 1A1, o colágeno 3A1, o colágeno 1A2 e o colágeno 6A1 são os tipos mais abundantes de colágeno dentro da bexiga do rato(Figura 2A). Também usamos o Tabula Muris (um compêndio de dados de transcriptome de célula única do mouse (Mus musculus))8 para determinar o nível de expressão mRNA de collagens 1, 3, 6 e hialuuronan. Os dados permitem a comparação direta e controlada da expressão genética em tipos celulares compartilhados entre tecidos. Esta análise revelou que a expressão desses componentes da matriz extracelular é mais prevalente nos tipos de células mesenquimais do que no urotélio(Figura 2B).
Efeito da dissociação na viabilidade de células isoladas da bexiga A análise da citometria de fluxo demonstrou que a digestão enzimática utilizando os 4 protocolos diferentes produziu viabilidade de 83%, 86%, 93% ou 90%, respectivamente. Assim, o protocolo seção 3 foi considerado mais valioso para a preservação da viabilidade celular. Observou-se também que aproximadamente 4% das células eram necroséticas (PI+/AnnexinV-) ( Figura4A). Essas observações enfatizam a eficiência do protocolo de digestão e o benefício subsequente na viabilidade celular.
Efeito da lesão medular em diferentes populações de células na bexiga Observamos um aumento significativo no número total de células nas bexigas de camundongos SCI em comparação com os controles. O padrão das parcelas de pontos obtidas das bexigas SCI também foi ligeiramente diferente consistente com a remodelação contínua do órgão devido à lesão medular(Figura 4B: primeira coluna). Em comparação com os controles, as bexigas dos animais SCI apresentaram um aumento significativo nas células CD45 positivas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> Figura 1: Conclusão representativa da perfusão com cor iluminada do fígado. (A) Demonstra a cor do fígado no início da perfusão. (B) Mostra a cor do fígado clareado no final da perfusão. O camundongo em (A) fez transeção da medula espinhal duas semanas antes da perfusão resultando em hipertrofia da bexiga e sua saliência fora da pelve ao contrário do camundongo em (B) que não tinha lesão medular; neste caso, a bexiga é pequena e escondida na pélvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> Figura 2: Expressão transcriômica de componentes de matriz extracelular (ECM) na bexiga do rato. (A) Gráfico de barras de 43 tipos diferentes de colágeno. A expressão é indicada por Reads Per Kilobase de transcrição, por milhão de leituras mapeadas (RPKM) (os dados são coletados do BioProject: PRJNA66167)14. (B) Parcelas de violino de expressão genética em tipos celulares obtidas a partir da contagem microfluídica de gotículas 3'-end em um pool de amostras de bexiga urinária dissociada masculina e feminina (macho e fêmea). As contagens foram normalizadas para cada célula usando o logaritmo natural de mais de 1 milhão de ln (CPM+1)8. Uma pseudoconta de 1 CPM foi adicionada antes de tomar logaritmos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> Figura 3: Estratégia de gating e controles FMO para determinar a propagação da fluorescência. (A)Seleção da população celular. (B) Estratégia de gating para singlets. (C) Gating para células apoptóticas necróticas e precoces e tardias usando anticorpo pi e anexo V. (D\u2012F) Um gráfico de ponto esquemático de citometria de fluxo multicolor (por exemplo, anticorpos conjugados com A, B, C, D fluorochromes + (Anexo V e PI). Isso mostra a fluorescência espalhada no anticorpo com fluorocromo um canal mostrado pelo controle FMO em comparação com um controle não manchado. A linha pontilhada laranja representa o limite de ogmização do FMO em comparação com o limite não localizado em vermelho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> Figura 4: Citometria de fluxo de diferentes tipos de células na bexiga. (A) Anexo V/PI gráficos de fluxo de coloração dupla. As diferentes combinações de enzimas e produtos químicos utilizados para cada protocolo são representadas em frente ao enredo de viabilidade correspondente. Esses dados demonstram que a maior viabilidade foi obtida com a seção de protocolo 3. (B) Histogramas representativos ilustrando a intensidade de Ly-6A/E (Sca-1) e CD326 (Ep-CAM) detectados em canais únicos. (C) Efeito de SCI na população celular da bexiga do rato. O painel superior mostra resultados de coloração em três bexigas dissociadas obtidas a partir do controle de camundongos não cirúrgicos e painel inferior mostra os resultados da coloração em três animais com SCI. A primeira coluna é a população celular total. A segunda coluna mostra a seleção de gating singlet. A terceira coluna mostra a subpopulação de células vivas que são negativas para células B, células T e células NK. A quarta coluna mostra a coloração de células vivas positivas para CD45. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Quantidade (para 500 mL)</td>
			<td>Molarity</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>0,186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0,0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glicose</td>
			<td>0,9 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1,19 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Componentes para a preparação da solução de Tyrode. Os componentes indicados são para a preparação da solução de 500 mL Tyrode.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Quantidade</td>
			<td>Protocolo seção 1</td>
			<td>Protocolo seção 2</td>
			<td>Seção de protocolo 3</td>
			<td>Seção de protocolo 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mgs</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,03 mM</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase Tipo I</td>
			<td>132,5 unidades</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase Tipo III</td>
			<td>96,4 unidades</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase Tipo VI</td>
			<td>50 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase</td>
			<td>10 unidades</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papaína</td>
			<td>115 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pan Collagenase</td>
			<td>50 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hialuronidase</td>
			<td>10,5 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase II</td>
			<td>1,25 unidades</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de dissociação celular</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>Sim</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzima recombinante</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Componentes para a preparação do tampão de digestão. Os componentes indicados são para a preparação de 2,5 mL de mistura de digestão (1 U catalisa a hidrólise de 1 μmol um substrato por minuto a 37 °C. Consulte a folha de dados do produto para definição de unidade de cada enzima).

O objetivo deste protocolo é aplicar um protocolo otimizado de dissociação tecidual a um modelo de camundongo de lesão medular e validar a abordagem para análise de célula única por citometria de fluxo.

Uma única abordagem de dissociação celular para análise molecular da bexiga urinária no rato após lesão medular

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

Este protocolo é significativo porque utiliza informações biológicas para facilitar a geração de uma única suspensão celular com alta viabilidade celular. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de gerar suspensões unicelulares que mantêm uma alta viabilidade celular e uma representação adequada dos tipos de células isoladas. Demonstrando o procedimento cirúrgico estará Hussein Atta, um colega do meu laboratório.Demonstrando o procedimento de dissociação tecidual estará Ali Hashemi, e a análise FACS, Yaser Heshmati. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo pedal em um camundongo adulto anestesiado, palpe o processo espinhoso mais proeminente na coluna torácica. Analgesia e antibióticos são administrados antes da cirurgia.Raspe um retângulo longitudinal na parte de trás do mouse, da parte inferior do pescoço até logo abaixo do processo espinhoso mais proeminente e um centímetro de cada lado da linha média. Desinfete a pele exposta três vezes com lenços sequenciais de iodopovidona a 10% e etanol a 70% de forma circular, começando no local da incisão e trabalhando para fora. Após a última limpeza, cubra o mouse com um pedaço estéril de gaze de quatro por quatro polegadas com uma janela sobre o campo cirúrgico.Para induzir a lesão da medula espinhal, primeiro faça uma incisão de 1,5 centímetro no meio das costas e use uma dissecção brusca para separar os músculos dos processos espinhosos e as lâminas das vértebras T9, T10 e T11. Use uma tesoura fina para dividir nitidamente os ligamentos interespinhosos entre T9 e T10 e T10 e T11 antes de realizar uma laminectomia bilateral do processo espinhoso T10. Quando as lâminas estiverem completamente excisadas, use a tesoura para seccionar a medula espinhal.Para cortar completamente as colunas laterais, varra delicadamente a ponta da tesoura fina dos dois lados. Use uma aplicação de ponta de algodão estéril para comprimir qualquer sangramento. Depois de atingir a homeostase, feche a pele com pontos contínuos de poliglactina910 7-0 e forneça subcutaneamente um mililitro de solução salina para evitar a desidratação pós-operatória e, em seguida, retorne o animal a uma gaiola fresca com monitoramento até a decúbito total.A cada 12 horas, segurando o animal com uma mão e massageando a parte inferior do abdômen com a outra, use o dedo indicador e o polegar para localizar e comprimir suavemente a bexiga urinária distendida para estimular a expressão manual da bexiga até que o animal seja capaz de urinar por conta própria. Para análise a jusante dos tipos de células da bexiga de interesse, no ponto de tempo experimental apropriado e uma vez que o animal esteja adequadamente anestesiado, execute uma laparotomia da linha média da pelve ao diafragma e corte o diafragma das costelas. Seguindo a borda da cartilagem óssea paralela ao esterno, abra o tórax ao longo das costelas em ambos os lados do animal, começando no diafragma e prosseguindo para a primeira costela.Após fixar a parede torácica anterior sobre a cabeça do animal, use uma tesoura fina para cortar o pericárdio e conecte uma agulha de calibre 23 ao aparelho de perfusão. Insira a agulha no ventrículo esquerdo e avance lentamente a agulha para a aorta sem perfurar o tecido. Quando a agulha estiver no lugar, comece a infundir o tecido com PBS a uma taxa de fluxo de 15 mililitros por minuto e use as pontas de uma tesoura fina para fazer rapidamente um pequeno corte no átrio direito.Quando a drenagem estiver clara e uma cor de fígado clareada puder ser observada, pare a perfusão e libere a bexiga dos pedículos vasculares e da uretra, depois coloque a bexiga em um tubo de microcentrífuga contendo a solução de Tyrode gelada. Para preparar uma suspensão de célula única, quando todas as bexigas tiverem sido coletadas, rasgue um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 100 microlitros de solução de Tyrode. Após a pesagem, pique as bexigas em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo 100 microlitros de solução de Tyrode e use uma ponta de pipeta de furo largo para transferir os fragmentos de tecido para 2,5 mililitros de tampão de digestão por bexiga.Incube o tecido por 40 minutos a 37 graus Celsius em um misturador Nutator e use uma pipeta de cinco mililitros para triturar a amostra por um minuto antes de coletar as células e tecidos dissociados por centrifugação. Ressuspenda o pellet em um mililitro de solução de desprendimento de células e coloque as células no misturador Nutator por mais 10 minutos. No final da incubação, recolher as células com outra centrifugação e ressuspender o pellet num mililitro de tampão de lise dos glóbulos vermelhos.Após um minuto, pare a lise com a adição de nove mililitros de PBS e filtre as células através de um filtro de 70 micrômetros em um tubo de 50 mililitros, depois centrifugue as células novamente e ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de coloração suplementado com bloco FC. Após uma incubação de 10 minutos no gelo, recolher as células por centrifugação e ressuspender o sedimento no volume adequado de mistura principal de anticorpos conjugados com fluoróforo durante 20 minutos em gelo protegido da luz. No final da incubação, lave as células com um mililitro de tampão de coloração celular e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão de coloração de células frescas suplementado com cinco microlitros de FITC Anexina V e um microlitro de iodeto de propídio.Após 15 minutos à temperatura ambiente, adicione 400 microlitros de tampão de ligação de anexina às células e misture por inversão. Para analisar as células por citometria de fluxo, primeiro use uma amostra de célula não corada para definir os parâmetros de dispersão lateral e direta das células e, em seguida, meça a emissão de fluorescência em 530 nanômetros e maior que 575 nanômetros para excluir as células mortas. Use as grades em cada mancha de pontos para definir a população negativa no primeiro decaimento e use os controles de fluorescência menos um para corrigir a sobreposição espectral até que os meios populacionais negativos e positivos estejam alinhados.Em seguida, meça 100.000 eventos das células com os marcadores específicos de interesse, criando portas para as populações de células de interesse, conforme necessário. Quando todas as amostras tiverem sido executadas, analise os dados usando o software de análise de citometria de fluxo apropriado. Colágeno 1A1, colágeno 3A1, colágeno 1A2 e colágeno 6A1 são os tipos de colágeno mais abundantes encontrados na bexiga do camundongo.A análise para determinar os níveis de expressão de mRNA dos colágenos um, três, seis e hialuronano revela que a expressão desses componentes da matriz extracelular é mais prevalente em populações de células mesenquimais do que no urotélio. A análise por citometria de fluxo indica que vários protocolos de digestão enzimática diferentes produzem populações de células altamente viáveis, com o terceiro protocolo de digestão usado nesta análise determinado como o mais eficaz na preservação celular. Usando este método, um aumento significativo no número total de células isoladas das bexigas de camundongos com lesão medular pode ser obtido para compará-lo com bexigas de controle.Em comparação com os controles, as bexigas de animais com lesão medular também apresentam um aumento significativo de células CD45 positivas. A etapa 7.1 é importante para a identificação na população cardíaca. A estratégia de gating deve ser informada pelas células de interesse.As bexigas de animais com LME têm população celular distinta. Este protocolo pode ser usado para classificação de células, cultura de células primárias, sequenciamento de célula única e outros procedimentos de molécula e célula a jusante que requerem células únicas viáveis. Este protocolo fornece alta viabilidade e, portanto, baixa perda de população de células, que é um ponto-chave para técnicas de análise de célula única, como sequenciamento de RNA de célula única.

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Células adultas isolando-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas com base na velocidade da célula a adesão ao frasco.

Isolar células-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas

Um procedimento otimizado para purificar crista neural derivados progenitores neuronais a partir de tecidos fetais de camundongos é descrito. Este método tira partido da expressão a partir de alelos repórter fluorescente para isolar populações discretas por fluorescência-activated separação de células (FACS). A técnica pode ser aplicada para isolar subpopulações neuronais ao longo do desenvolvimento ou a partir de tecidos adultos.

Um procedimento otimizado para fluorescência-ativado Isolamento classificação celular (FACS) da Autônomo progenitores neurais a partir de vísceras de ratos fetais

Fonte: Yang, E., et al. Isolamento de comunidades bacterianas intracelulares individuais geradas a partir de um modelo murino de infecção urinária para análise de células únicas a jusante. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o isolamento manual de células epiteliais individuais contendo comunidades bacterianas intracelulares a partir da bexiga de camundongos infectados usando micropipetamento oral, possibilitando a análise subsequente de células únicas de populações viáveis de E. coli...

Isolamento de Células Epiteliais da Bexiga de Camundongo Contendo Comunidades Bacterianas Intracelulares

O modelo estabelecido de transuretral cateterismo de ratos permite o estudo das patologias de bexiga, incluindo a infecção do trato urinário, mas só pode ser realizado nas fêmeas. Um novo modelo de instilação transuretral masculino, apresentado aqui, permitirá a pesquisa em uma área marcada por fortes diferenças clínicas e epidemiológicas entre os sexos.

Infecção do trato urinário em um modelo Animal de pequeno porte: transuretral cateterismo de ratos machos e fêmeas

Aqui, vamos demonstrar o desempenho de um modelo de lesão medular mínima em um rato adulto que poupa o nicho central canal habitação endógena células tronco neurais (NSCs). Mostramos como o ensaio de neurosphere pode ser usado para quantificar a ativação e migração de NSCs definitivos e primitivos, após lesão.

Um ensaio de Neurosphere para avaliar a ativação de células-tronco neurais endógena em um modelo do rato da lesão medular mínima

Este protocolo descreve um método simples de isolar células epiteliais única, infectados-bexiga de um modelo murino de infecção do trato urinário.

Isolamento de comunidades de bacterianas intracelulares único gerado a partir de um modelo murino de infecção do trato urinário para análise de célula única a jusante

Este protocolo tenta estabelecer um protocolo repetível para neurônios primários e isolamento de glia da bexiga de rato para novos experimentos celulares.

Isolamento e Cultura dos Neurônios Primários e Glia da Bexiga Urinária de Ratos Adultos

Este protocolo de dissociação de células neurais destina-se a amostras com uma baixa quantidade de material inicial e produz uma suspensão de célula única altamente viável para análise a jusante, com medidas de fixação e coloração opcionais.

Dissociação Mecânica e Enzimática Combinada do Tecido Hipocampal cerebral do rato

Este protocolo descreve o processo de geração e caracterização de organoides uroteliais de camundongos que abrigam exclusões em genes de interesse. Os métodos incluem a colheita de células uroteliais de camundongos, transdução ex vivo com expressão de Adenovírus conduzindo Cre com um promotor de CMV, e caracterização in vitro , bem como caracterização in vivo .

Ex Vivo Modelo organoide de deleções genéticas mediadas por Adenovírus-Cre em células uroteliais de camundongos

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

Este estudo apresenta duas técnicas experimentais cruciais: a construção de um modelo de ferida murina para avaliar o fechamento da ferida e a preparação de suspensões unicelulares de pele murina para preservar a viabilidade celular.

Modelos de Ferida em Camundongos e Preparação de Suspensões de Células Únicas

Aprenda um método otimizado de dissociação tecidual para análise de células únicas da bexiga em modelo de lesão medular em camundongo. Esta técnica gera suspensões celulares de alta viabilidade para citometria de fluxo.

Uma única abordagem de dissociação celular para análise molecular da bexiga urinária no rato após lesão medular

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