Avaliando o engajamento de alvos celulares por inibidores de fosfattase de PHOsphatase

A fosfattase de tirasina SHP2 é um dos principais mediadores da sinalização celular, promovendo a sobrevivência e a proliferação celular. Minha equipe está focada em encontrar inibidores de pequenas moléculas SHP2 para o tratamento do câncer. Nossa técnica fornece um método rápido e poderoso para estabelecer penetrantes celulares, bem como o engajamento de inibidores de pequenas moléculas SHP2, em células.

Isso garante que os recursos de descoberta são direcionados eficientemente. SHP2 como um alvo atraente para a terapia do câncer. E vários inibidores de SHP2 estão em testes clínicos.

Nossa técnica para facilitar a descoberta de inibidores da próxima geração com perfis de eficácia melhorados. Demonstrando o procedimento estaria Celeste Romero, assistente de pesquisa e Douglas Sheffler, professor assistente de pesquisa, do nosso laboratório. Para iniciar desapego HEK293 T-cells das placas, usando três mililitros de reagente de descolamento celular.

Diluir as células com 12 mililitros de mídia de crescimento, e colecioná-las por centrifugação a 1.400 vezes G, por quatro minutos. Resuspend o paladar celular em 10 mililitros de mídia de crescimento e medir a concentração e viabilidade das células com azul trypan e um contador celular. Placa 700.000 células de crescimento exponencial em cada poço de uma placa de seis poços de cultura e incuba-las por 24 horas a 37 graus Celsius, e 5% de dióxido de carbono.

No dia seguinte, dilui dois microgramas de DNA de plasma em 200 microliters de tampão de transfecção. Vórtice o DNA de plasma por 10 segundos e centralizado-o a 1.400 vezes G por quatro minutos. Adicione quatro microliters de reagente de transfecção ao DNA diluído.

Vórtice por 10 segundos, e repita a centrifugação. Incubar o DNA a 23 graus Celsius por 10 minutos, depois adicionar a mistura de transfecção às células HEK293 T anexadas na placa de seis poços, e retornar as células à incubadora por mais 24 horas. Para preparar placas de ensaio, diluir soluções inibidoras em DMSO, para uma concentração de estoque de 10 mililitros e dispensá-las em uma placa de origem de volume morto de 384 bem baixa, para uso imediato.

Localmente o volume desejado de inibidores ou veículo, utilizando um manipulador líquido em 384 placas PCR em tempo real com um volume final de alvo inferior a 0,5% DMSO. Sele as placas usando um selador de placas com purificação de gás inerte. Para preparar as células transfeinadas pré incubar a mídia de crescimento e vender reagente de descolamento em um banho de água de 37 graus Celsius.

Remova as células da incubadora e aspire suavemente a mídia dos poços. Adicione 0,3 mililitros do reagente de descolamento celular a cada poço, e balance suavemente a placa para frente e para trás para cobrir completamente a superfície do fundo da placa. Incubar a placa a 23 graus Celsius por dois minutos.

Adicione um mililitro de mídia de crescimento a cada poço, e gentilmente pipete as células no poço. Em seguida, transfira-as para um tubo de centrífuga Falcon de 15 mililitros Centrifuge as células a 1.400 vezes G por quatro minutos para coletar as células. Aspire suavemente a mídia, depois resuspenque a pelota de célula em dois mililitros de mídia de crescimento.

Certifique-se de que a viabilidade da célula é superior a 90% usando o try pan blue e um contador de células. Diluir células a uma concentração de 125 células por microliter, mantendo as células em suspensão por não mais do que duas horas para a viabilidade ideal. Para incubação com inibidores SHP2, dispense as células em uma solução de canal único estéril.

Centrifugar a placa PCR de 384 bem em tempo real preparada a 2.500 vezes G durante cinco minutos, em seguida, remova o selo e use uma pipeta multicanal de 125 microliteres, para adicionar cinco microliters das células diluídas aos Poços desejados. Centrifugar a placa a 42 vezes G durante 30 segundos sem tampa, em seguida, anexar uma tampa e incubar a placa por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Programe o ciclo de termo, de acordo com as instruções do manuscrito para o gradiente do perfil térmico ou o experimento isotémico.

Inicie o programa de pulso de calor do termociclador e coloque a placa de ensaio no bloco térmico. Quando o programa estiver concluído, remova a placa de ensaio. Suplemine cada poço da placa de ensaio com cinco microliters de mistura mestre de detecção licenciada.

Centrifugar a placa a 42 vezes G por 30 segundos, e armazená-la a 23 graus Celsius na escuridão por 30 a 60 minutos. Meça a chemiluminescência usando um leitor de microplaca com o tempo de integração otimizado. O experimento de gradiente térmico para o tipo selvagem SHP2, resultou em um perfil térmico celular sigmoidal com uma transição estreita de fusão que é típica para uma proteína dobrada.

Incubação do tipo selvagem SHP2 com o inibidor alésterico SHP099, estabilizado ao perfil térmico em um grau significativo e mensurável. A estabilização do SHP2, também acompanhada com a potência de SHP099 como compostos alusicos. Com 10 micromolar, o RMC-4550 mais potente, produziu um grau de estabilização maior do que o SHP099 para o tipo selvagem SHP2.

Devido ao seu mecanismo único, sHP099 como inibidores alergênicos são menos eficazes contra muitos mutantes oncogênicos SHP2, incluindo SHP2-E76K. Consistente com essas propriedades conhecidas, apenas a estabilização térmica marginal de SHP2-E76K por SHP099 é observada. O nível de expressão da proteína de etiqueta EPL pode influenciar drasticamente a intensidade do sinal.

Perfis térmicos para células do tipo selvagem transitórios e stably integradas. em condições de ativos idênticas são mostrados. A normalização das curvas díspares proporciona perfis térmicos comparáveis, revelando a ampla gama do sistema de detecção de EFC.

Aproveitando a capacidade do cicloviário térmico para produzir gradientes térmicos no eixo curto de uma placa de poço 384. uma série de titulações istermais podem ser realizadas em uma única placa. A uma temperatura ideal, uma titulação isotérmica usando uma dose-resposta de 10 pontos completa, rendeu um EC50 útil, para RMC-4550.

Os princípios desse ativo poderiam ser usados para monitorar a degradação de proteínas nas células, induzidas por compostos PROTAC. Estamos usando a técnica de mudança de Thelma celular para descobrir inibidores de mutantes SHP2 e leucemias, drogas específicas contra mutantes oncogênicos SHP2 frequentes terão um impacto significativo para o tratamento desses cânceres.