Name: Análise do Metabolismo celular assassino natural humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprenda a medir glicólise e respiração mitocondrial em células Natural Killer humanas primárias usando analisador de fluxo extracelular. Este método automatizado permite triagem de alta vazão para estudos de imunologia e aplicações clínicas.

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Os autores agradecem ao Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) pelo apoio e discussão. Este estudo foi apoiado pelos Programas de Pesquisa Intramuros dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Câncer e Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue. JT é apoiado pelo programa Ramon y Cajal (grant RYC2018-026050-I) da MICINN (Espanha).

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<li>Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+lipophilic+cation+for+determination+of+membrane+potential+in+neuroblastoma-glioma+hybrid+cell+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).</li>
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste artigo, estabelecemos um protocolo para isolar e culminar eficientemente células NK humanas primárias puras e viáveis a partir de sangue periférico. Também otimizamos as condições para a medição da atividade metabólica dessas células NK avaliadas pela taxa de consumo de oxigênio e taxa de acidificação extracelular usando um analisador de fluxo extracelular. Comparado com outros métodos respirométricos, o analisador de fluxo extracelular é rápido, requer um pequeno número de células e permite triagens de alto rendim...

As células do Natural Killer (NK) são linfócitos inatos que mediam respostas anti-tumor e antivirais. As células NK compreendem 5-15% de todos os linfócitos no sangue periférico humano, e também podem ser encontradas em baço, fígado, medula óssea e linfonodos. As células NK não expressam receptores clonotípicos polimórficos, como receptores de células T (TCR) ou receptores de células B (BCR). Em contraste, a ativação de suas funções citíticas é motivada pelo engajamento de receptores que reconhecem ligantes invariáveis na superfície de uma célula alvo1,2.
Células NK humanas descansando isoladas do sangue periférico podem sobreviver por vários dias em meio de cultura suplementada com soro humano. A ativação de células NK por citocinas como IL-15 ou IL-2 leva as células à proliferação e ao aumento de sua capacidade de matar, entre outros efeitos3,,4,,5. Vários estudos têm mostrado uma correlação direta entre a ativação celular NK e mudanças em sua atividade metabólica6. Essas alterações metabólicas são destinadas a atender aos requisitos particulares das células em termos de energia e biossíntese.
Células aeróbicas e organismos obtêm energia através de uma série de reações químicas que envolvem o catabolismo e oxidação de carboidratos, gorduras e proteínas. Através de uma combinação de glicólise, o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e a fosforilação oxidativa, as células eucarióticas atendem a maioria de sua demanda ATP e obtêm intermediários necessários como blocos de construção para macromoléculas essenciais para o crescimento e proliferação celular. O processo de glicólise (Figura 1A) começa com a entrada de glicose na célula. No citosol, a glicose é fosforilada e transformada em piruvato (com uma produção líquida de 2 moléculas de ATP por molécula de glicose), que pode ser reduzida a lactato ou transportada para as mitocôndrias para ser transformada em Acetil-CoA e entrar no ciclo TCA. O ciclo TCA continua pedalando abastecido com mais moléculas de Acetil-CoA e produz CO2 (que eventualmente se difundirá fora da célula e, reagindo com H2O no meio, gerará ácido carbônico que levará à acidificação do meio) e NADH, a molécula encarregada de doar elétrons para a cadeia de transporte de elétrons (ETC). Os elétrons viajam através de diferentes complexos proteicos e são finalmente aceitos pelo oxigênio. Esses complexos (I, III e IV) também bombeiam H+ da matriz mitocondrial para o espaço intermembrano. Como consequência do gradiente eletroquímico gerado, o H+ entrará novamente na matriz através do complexo V (ATP-synthase), investindo a energia potencial acumulada na geração de ATP.
Tanto a glicolise quanto a respiração mitocondrial podem ser bloqueadas em diferentes pontos usando inibidores. O conhecimento e o uso desses inibidores foram a base para o desenvolvimento do ensaio de fluxo extracelular. Medindo dois parâmetros simples em tempo real, como pH e oxigênio, o analisador de fluxo extracelular infere a taxa de glicolise e respiração mitocondrial em uma placa de 96 poços. O teste de estresse da glicólise é realizado em um meio basal sem glicose (Figura 1B)7. As primeiras medidas da taxa de acidificação extracelular (ECAR) são indicativas de acidificação independente da glicólise. É referido como acidificação não glicolítico e se correlaciona com o CO2 produzido pelo TCA que, como explicado anteriormente, combina com H2O no meio para gerar H+ (ECAR ligado ao TCA). A primeira injeção é a glicose para induzir a utilização da glicose e aumentar a glicólise. A segunda injeção combina ambos rotenone, um inibidor complexo I, e antimicina A, um inibidor complexo III em conjunto, para bloquear o ETC. As células respondem a essa dramática diminuição na produção de ATP mitocondrial ativando a glicolise para manter os níveis de ATP celular, e isso representa a quantidade de glicólise que não é usada pela célula no estado basal, mas poderia ser potencialmente recrutada em resposta ao aumento da demanda da ATP (glicolycolysis compensatória). A terceira injeção é a glicose analógica 2-Desoxicose (DG), que compete com a glicose como substrato para a enzima hexokinase. O produto desta fosforilação, 2-desoxicosglucose-6-fosfato não pode ser transformado em piruvato, e, portanto, a glicólise é bloqueada, o que reduz o ECAR ao seu mínimo. O ECAR medido neste ponto inclui outras fontes de acidificação extracelular que não são atribuídas à glicólise ou atividade respiratória, bem como qualquer glicolise residual não totalmente inibida pelo 2-DG (pós 2-DG-acidificação).
O teste de estresse mitocondrial é realizado em um meio com glicose (Figura 1C)8. As primeiras medições da taxa de consumo de oxigênio (OCR) correspondem à linha base da respiração mitocondrial (respiração basal). A primeira injeção é a oligomicina, que inibe o retorno de prótons através da sintetizadora ATP (complexa V), bloqueando a síntese de ATP e, assim, hiperpolarizar rapidamente a membrana mitocondrial, que impede o bombeamento de prótons através de complexos respiratórios, e leva a uma diminuição do OCR. A comparação entre a respiração da linha de base e o valor dado pela adição de oligomicina representa a respiração ligada à ATP. A taxa de consumo insensível de oligomicina remanescente é chamada de vazamento de prótons, que representa o fluxo de prótons através do bicamadorão lipídico ou proteínas na membrana mitocondrial interna, como o nucleotídeo de adenina translocase9. A segunda injeção é o uncoupler 2,4-dinitrophenol (DNP), um ionóforo que induz uma entrada maciça de H+ na matriz mitocondrial, o que leva à despolarização da membrana mitocondrial e à interrupção da síntese mitocondrial do ATP. As células respondem à dissipação da força-motivo do próton aumentando a taxa de transporte de elétrons e consumo de oxigênio para níveis máximos em uma tentativa fútil de recuperar o potencial da membrana (capacidade respiratória máxima). A diferença entre a capacidade respiratória máxima e a respiração basal é a capacidade respiratória sobressal da célula, que representa a quantidade de respiração que não é usada pela célula para gerar ATP no estado basal, mas pode ser potencialmente recrutada em resposta ao aumento da demanda de ATP ou sob condições de estresse8. A terceira injeção é uma combinação de rotenona e antimicina A. Esta injeção interrompe completamente o ETC e o OCR diminui para seu nível mais baixo, com o consumo restante de oxigênio sendo não mitocondrial (causado por NADPH-oxidases, etc.).
Mudanças nas vias metabólicas poderiam de alguma forma prever o funcionamento das células NK, como tem sido sugerido que a ativação contínua de células NK com citocinas in vitro poderia levar à exaustão celular NK pelo estudo de diferentes vias metabólicas10,,11. A correlação entre o estado metabólico das células NK e a função é muito importante do ponto de vista da imunoterapia do câncer. Neste campo, a ativação de células NK com infusão de IL-15, isoladamente ou em combinação com anticorpos terapêuticos monoclonais foram testadas a fim de melhorar a morte de células tumorais12,,13,14. O conhecimento do estado metabólico das células NK em resposta a essas estratégias de tratamento forneceria um valioso preditor do status de ativação celular NK e função de morte.
O estudo de vias metabólicas em outras células mieloides e linfoides, como monócitos, células T e B, foi descrito15 e métodos otimizados foram publicados16. Neste protocolo, fornecemos um método que combina tanto um protocolo de isolamento NK que produz altos números de células NK puras e viáveis e um protocolo otimizado para medir a atividade metabólica usando um analisador de fluxo extracelular. Aqui mostramos que este é um método válido para o estudo de alterações metabólicas em repouso e células NK humanas ativadas il-15. Para o ensaio de fluxo extracelular, parâmetros como número de células e concentrações de drogas foram testados e otimizados. Comparado com outros métodos respirométricos, o analisador de fluxo extracelular é totalmente automatizado e capaz de testar em tempo real, com quantidades muito baixas de células, até 92 amostras simultaneamente, e assim permite triagens de alto rendimento (com múltiplas amostras e réplicas) de forma relativamente rápida17.
Este método pode ser usado por pesquisadores interessados em avaliar a função celular NK estudando o metabolismo celular NK. Pode ser aplicado também às células ativadas por outras citocinas, anticorpos ou estímulos solúveis.

<table><tbody><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D8375-5G</td><td>Composto injetor de teste de estresse de glicólise</td></tr><tr><td>2,4-Dinotrofenol (2,4-DNP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D198501</td><td>ETC desacoplador / composto injetor de teste de estresse mitocondrial</td></tr><tr><td>96 Placa de Cultura de Células de Poços/ Fundo Redondo com Tampa</td><td>Costar</td><td>3799</td><td>NK cultura de células</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8674</td><td>Inibidor do complexo III / glicólise e composto injetor de teste de estresse mitocondrial</td></tr><tr><td>BD FACSDIVA Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Aquisição de dados de fluxo</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Aquisição de dados de fluxo</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Adesivo celular</td></tr><tr><td>CyQUANT ensaio de proliferação celular</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C7026</td><td>Ensaio de proliferação celular para quantificação de DNA. Contém tampão de lise celular e corante CyQUANT GR</td></tr><tr><td>Kit de Seleção Positiva CD3 Humano EasySep II</td><td>Stemcell technologies</td><td>17851</td><td>Isolamento de células NK de PBMCs</td></tr><tr><td>Kit de enriquecimento de células NK humanas EasySep</td><td>Stemcell technologies</td><td>19055</td><td>Isolamento de células NK de PBMCs</td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stemcell technologies</td><td>18001</td><td>Isolamento de células NK de PBMCs</td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8</td><td>Qualidade Biológico</td><td>10128-446</td><td>NK vender tampão de separação</td></tr><tr><td>Tubos FACS</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>352235</td><td>Experimento de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Tubos cônicos</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Separação de células NK</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>Tampão de separação de células NK</td></tr><tr><td>Software FlowJo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Análise de dados de fluxo</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8270</td><td>Componente do meio de teste de estresse mitocondrial. Composto injetor de teste de estresse de glicólise</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Inibidor de protease 100X. Uso em tampão de lise RIPA</td></tr><tr>Estimulação <td>de células NK</td><td>humana IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-50ug</td></tr><tr><td>Soro humano (HS)</td> <td>Valley Biomedical</td><td>9C0539</td><td>NK suplemento de meio de cultura de células</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td>célula NK meio de cultura</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td>Componente do meio de teste de estresse</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de Coloração de Células Mortas Aqua Fixável</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34965</td><td>Corante de viabilidade para coloração por citometria de fluxo</td></tr><tr><td>LSM</td><td>mpbio</td><td>50494X</td><td>PBMCs separação de sangue humano</td></tr><tr><td>Rato anti-humano CD3 BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563725</td><td>Coloração por citometria de fluxo de células T</td></tr> Coloração de citometria de fluxo <tr><td>de camundongo anti-humano CD56 PE</td><td>BD Pharmingen Pharmingen</td><td>555516</td><td>NK</td></tr><tr>Coloração de citometria de fluxo<td>de camundongo anti-humano NKp46</td><td>PE BD Pharmingen</td><td>557991</td><td>NK</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>MilliporeSigma</td><td>75351</td><td>Inibidor do complexo V / composto injetor de teste de estresse mitocondrial</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>Célula NK tampão de separação</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Para determinação da concentração de proteína</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td>Lise celular</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>MilliporeSigma</td><td>R8875</td><td>Inibidor do complexo II / glicólise e teste de estresse mitocondrial injetor composto</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Controller Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Controlador para o Analisador Seahorse XFe96</td></tr> Software <tr><td>de Desktop Seahorse Wave</td><td>Agilent</td><td></td><td>Para análise de dados</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium</td><td>Agilent</td><td>102353-100</td><td>Ensaio de Fluxo Extracelular base média</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td> Analisador de <td>Fluxo Extracelular</td><td>Agilent</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>Inclui 20 placas de cultura de células XF96, 18 cartuchos de sensor XFe96, guias de carregamento para transferência de compostos para o cartucho de ensaio e 1 frasco de solução calibrante (500 ml).</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>MilliporeSigma</td><td>S5761</td><td>Para preparar a solução Cell-Tak</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-070</td><td>Componente do meio de teste de estresse mitocondrial</td></tr></tbody></table>

análise do metabolismo celular assassino natural humano

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

As células do Natural Killer (NK) mediam principalmente respostas anti-tumor e imunes antivirais e respondem a uma variedade de citocinas e outros estímulos para promover a sobrevivência, a proliferação celular, a produção de citocinas como os programas de interferon gama (IFNγ) e/ou citotoxicidade. A ativação celular NK por estimulação de citocina requer uma remodelagem substancial das vias metabólicas para suportar seus requisitos bioenergésicos e biossintéticos. Há um grande conjunto de evidências que sugerem que o metabolismo celular NK prejudicado está associado a uma série de doenças crônicas, incluindo obesidade e câncer, o que destaca a importância clínica da disponibilidade de um método para determinar o metabolismo celular NK. Aqui descrevemos o uso de um analisador de fluxo extracelular, uma plataforma que permite medições em tempo real de glicolise e consumo mitocondrial de oxigênio, como uma ferramenta para monitorar mudanças no metabolismo energético das células NK humanas. O método aqui descrito também permite o monitoramento de alterações metabólicas após a estimulação de células NK com citocinas como o IL-15, um sistema que está sendo investigado atualmente em uma ampla gama de ensaios clínicos.

O isolamento das células NK do sangue periférico proporciona uma população pura e viável
O ensaio de fluxo extracelular baseia-se na medição da concentração de H+ e O2 no poço e não distinguirá entre diferentes populações de células ou sua viabilidade. Por essa razão, a obtenção de uma população altamente pura e viável da célula de interesse foi o passo fundamental para ter sucesso nesses experimentos.
O isolamento das células ...

Neste artigo, descrevemos um método para medir a glicólise e a respiração mitocondrial em células primárias do Assassino Natural (NK) humanas isoladas do sangue periférico, em repouso ou após a ativação induzida pelo IL15. O protocolo descrito poderia ser facilmente estendido para células NK humanas primárias ativadas por outras citocinas ou estímulos solúveis.

Análise do Metabolismo celular assassino natural humano

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Este método permite a determinação do metabolismo celular assassino natural. Um parâmetro-chave na ativação medindo o consumo de oxigênio e as alterações de pH no meio extracelular. A vantagem do analisador de fluxo extracelular é que ele é totalmente automatizado e capaz de testar até 92 amostras em tempo real com baixas quantidades de células.Permitindo assim telas de alto rendimento. Um método válido para determinar a glicólise e a respiração em células inky é muito importante na clínica. Uma vez que existem muitas doenças, incluindo obesidade e câncer, onde o metabolismo celular inky é prejudicado.Comece por tubos de 20 mililitros de meio de separação de linfócitos em um tubo cônico de 50 mililitros. Mantendo o tubo no ângulo de 30 graus, gentilmente pipeta 20 mililitros de sangue sobre o meio. Criando uma interface visível e bem definida entre os dois fluidos.Centrifugar os tubos por 25 minutos a 1000 vezes G.Em seguida, retire cuidadosamente os tubos da centrífuga e coloque-os em um rack. Verifique se há uma camada visível de células na interface entre LSM e plasma. Aspire suavemente a camada de célula mononuclear com uma pipeta de plástico de 10 mililitros e coloque-a em um novo tubo cônico de 50 mililitros.Lave as células mononucleares duas vezes com 45 mililitros de PBS. E centrifuá-los a 800 vezes G por cinco minutos. Para isolar as células assassinas naturais ou engaves, conte os mares PVM e resuspensá-los no tampão de separação NK em uma vez 10 para as oitavas células por mililitro.Em seguida, transfira 10 mililitros da suspensão celular para um novo tubo de 50 mililitros. Adicione 500 microliters da mistura de anticorpos de isolamento celular NK. E 10 microliters de anti CD três mistura de anticorpos de isolamento positivo para os PBMCs.E incuba-los à temperatura ambiente por 10 minutos. Contas magnéticas de vórtice e adicione um mililitro aos PBMCs e anticorpos. Em seguida, incubar o MIGS por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação ocasional.Adicione 35 mililitros de tampão de isolamento NK e coloque o tubo no ímã por 15 minutos. Colete cuidadosamente o supernatante com uma pipeta de plástico de 50 mililitros sem tocar nas laterais ou na parte inferior do tubo. Conte as células e centrífuga-as a 800 vezes G por cinco minutos.Para estimular as células NK com corredor solúvel 15, resuspenque 750.000 células em 100 microliters de IMDM contendo 10%HS em um poço de uma placa de poço 96. Diluir corredor humano 15 a um micrograma por mililitro no IMDM e 10% HS. E adicione 100 microliters do corredor humano diluído 15 às células.Repare uma amostra de controle com células não estimuladas e coloque ambas as amostras na incubadora a 37 graus Celsius. Estimule as células por 48 horas e realize o ensaio de fluxo extracelular. Um dia antes do experimento, ligue o analisador e deixe aquecer até 37 graus Celsius.Abra o pacote do cartucho de censura e separe o cartucho da placa de utilidade. Em seguida, adicione 200 microliters da solução calibrante a cada poço da placa de utilidade. E coloque o cartucho central de volta para garantir que os sensores estão completamente submersos.Para obter resultados ideais, incubar o cartucho durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora livre de dióxido de carbono. Que corretamente umidificado. Para preparar uma lâmina revestida de adesivo, pipeta 25 microliters da solução adesiva celular para cada poço da placa.E incubado à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, remova a solução e lave a placa duas vezes com 200 microliters de água estéril por poço. Mantenha a placa aberta por 15 minutos dentro do capô de cultura celular para permitir que os poços sequem.Centrifugar as células NK anteriormente isoladas adicionam 200 vezes G por cinco minutos. Em seguida, remova os supernacantes e lave as células em meio de teste de estresse mitocondrial aquecido ou meio de teste de estresse glicólise. Pelotar as células novamente e resuspensá-las para a concentração celular preferida no mesmo meio.Coloque 180 microliters de suspensão celular por poço na placa de ensaio. Use poços A, A 12 H um e H 12 como poços de controle para correção de fundo. Adicionando 180 microliters do meio de ensaio a estes Poços Incubar a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora livre de dióxido de carbono.Centrifugar a placa a 200 vezes G por cinco minutos. Em seguida, observe as células sob o microscópio para verificar se elas formam uma camada mano na parte inferior do poço. Incubar as células por mais 25 minutos.Soluções de trabalho quentes a 37 graus Celsius. E reajustar o pH para 7,4, se necessário. Carregue os compostos previamente preparados para um teste de estresse mitocondrial ou para um teste de estresse de glicolise nas placas A, B e C do cartucho de censura hidratado Coloque o cartucho de censura carregado de volta na incubadora durante a configuração do programa.Para configurar o protocolo de ensaio de fluxo extracelular, abra o software e use as definições do Grupo para definir as condições de pré-tratamento. Use a guia Mapa Placa para indicar os grupos de poços que possuem condições semelhantes Também indique a correção de fundo e os poços vazios. Em seguida, defina o programa na guia protocolos.Inicie o programa e coloque o cartucho do sensor e a placa de utilidade na bandeja. Após a etapa de calibração, substitua a placa calibrante pela placa de ensaio pelas células anexadas. Uma vez concluída a execução, recupere os dados e analise-os.A fim de avaliar a pureza e viabilidade das células NK. O pequeno Alec Watts dos mares PVM e a população isolada de células NK foram manchados e analisados por citometria de fluxo. A pureza da população celular NK foi estabelecida por dupla permanência contra CD três e CD 56 ou NKP 46.Muitas taxas de consumo de oxigênio mitocondrial para as células NK humanas são mostradas aqui. Como esperado, os números de células I apresentaram valores OCR mais altos. Os números celulares também se correlacionam linearmente com a quantidade de DNA ou proteína no poço.Por outro lado, os números de células mais elevados não foram ótimos. Porque após a adição de DNP, a concentração de oxigênio no poço foi totalmente esgotada em cada ciclo. O que impediu o cálculo preciso do OCR.Nas células NK humanas, 100 DNP micromolar foram encontrados como a dose ideal. Um típico experimento de teste de estresse mitocondrial com 750.000 células NK por poço é mostrado aqui. Neste teste, a oligomicina leva a uma redução drástica no consumo de oxigênio.E um aumento no ECAR. O que representa uma mudança para a glicólise e um esforço para manter os níveis de ATP celulares. A ativação das células NK pelo corredor 15 causou um aumento tanto no consumo mitocondrial de oxigênio quanto na acidificação extracelular.A respiração ligada a Basal Maximal e ATP aumentou, mas não o vazamento de prótons ou a respiração não mitocondrial. Além disso, a taxa de OCR/ECA diminuiu indicando uma mudança para um metabolismo glicóltico após a estimulação do IL 15. Ao realizar este protocolo, é muito importante obter uma população celular pura e saudável para determinar o número ideal da célula e para titular a concentração de uncablers.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o método para analisar o metabolismo energético em células NK humanas ativadas usando um analisador de fluxo extracelular. Diferentes inibidores dos complexos da cadeia de transporte de elétrons afetam a síntese de ATP, que é medida por meio da taxa de consumo de oxigênio ou OCR, fornecendo informações sobre o metabolismo celular e a bioenergética.

Monitoramento em tempo real do metabolismo energético em células NK humanas usando um analisador de fluxo extracelular

Este vídeo demonstra a atividade lítica das células natural killer contra as células-alvo coradas com fluorescência. O método permite a medição da citotoxicidade induzida por células NK colorindo células mortas e usando um citômetro de fluxo para quantificar células-alvo vivas e mortas.

Preparação de amostra de ensaio de citotoxicidade mediada por células natural killer para análise de citometria de fluxo

Um método simples e de confiança é descrito aqui para analisar um conjunto de funções das células NK, tais como desgranulação, produção de citocina e quimiocina dentro de diferentes subconjuntos de células NK.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Este trabalho descreve um fluxo de trabalho avançado para a determinação precisa e rápida da contagem de células NK (Natural Killer) e citotoxicidade de células NK em amostras de sangue humano.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

Um método baseado em citometria de fluxo para determinar quantitativamente a atividade citotóxica de células humanas de assassino natural é mostrado aqui.

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

A erradicação mediada por células por células cancerígenas é importante para a iniciação e progressão do câncer. Aqui, apresentamos dois protocolos não baseados em radioatividade para avaliar a citotoxicidade mediada por célulank em relação às células tumorais hepáticas. Além disso, um terceiro protocolo é apresentado para analisar a migração de células NK.

Medição da Citotoxicidade e Migração Mediadas por Células Assassinas Naturais no Contexto das Células Tumorais Hepáticas

Um protocolo para estudar eventos orientados pela FcγRIIIa por anticorpos terapêuticos em células assassinas naturais humanas é descrito aqui. Esta plataforma de estimulação artificial permite o interrogatório de funções de efeitos a jusante, como degranulação, produção de quimiocina/citocina, e caminhos de sinalização mediados pelas porções fcγriiia e fc de anticorpos envolvidos na vinculação.

Avaliação de Eventos celulares assassinos naturais humanos impulsionados pelo engajamento da FcγRIIIa na presença de anticorpos terapêuticos

O presente protocolo mostra como diferenciar células CD3−/CD45+CD56+ com citotoxicidade leve de células-tronco potenciais expandidas humanas (hEPSCs) em condições de cultura 3D e 2D. Isso permite a validação fenotípica de rotina sem a destruição do microambiente complexo.

Geração de células assassinas naturais a partir de células-tronco de potencial expandido humano

Este protocolo descreve um método sem rótulo para a análise rápida de uma única célula da contagem e atividade de células natural killer (NK) usando a tecnologia de imagem de sombra sem lente. Este método quantifica as mudanças morfológicas em células NK individuais por meio de análise computadorizada de seus padrões de difração.

Plataforma de imagem sem lentes implantável em campo para análise rápida e sem rótulos da ativação de células assassinas naturais

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho padronizado in vitro. para medição consistente da citotoxicidade natural, mediada pelo receptor de antígeno quimérico e dependente de anticorpos de células humanas natural killer, utilizando imagens de células vivas e citometria de fluxo.

Quantificação da citotoxicidade de células NK potenciada por receptores de antígeno quiméricos e anticorpos terapêuticos usando imagem de células vivas e citometria de fluxo

Aprenda a medir glicólise e respiração mitocondrial em células Natural Killer humanas primárias usando analisador de fluxo extracelular. Este método automatizado permite triagem de alta vazão para estudos de imunologia e aplicações clínicas.

Análise do Metabolismo celular assassino natural humano

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