Name: Contribuição da Na+/K+ Bomba para Estouro Rítmico, Explorada com Modelagem e Análises dinâmicas de grampo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Explore a técnica de grampo dinâmico para estudar a contribuição da bomba Na+/K+ e da corrente persistente de Na+ em interneurônios cardíacos de sanguessuga. Este método permite controlar correntes iônicas em tempo real para investigar a atividade neuronal.

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Agradecemos a Christian Erxleben por experimentos preliminares de grampo dinâmico em neurônios HN(7) que demonstraram suas capacidades de estouro. Angela Wenning ajudou os experimentos com conselhos de especialistas. Reconhecemos o NIH por financiar este trabalho através do Grant 1 R21 NS111355 para gsc e RLC.

NOTA: Os indivíduos experimentais animais invertebrados não são regulados pelo NIH ou pelas Universidades Estaduais de Emory e Geórgia. Todas as medidas foram tomadas, no entanto, para minimizar o sofrimento das sanguessugas utilizadas neste trabalho.
1. Prepare o gânglio isolado 7 do fio nervoso sanguessuga
<ol><li>Mantenha as sanguessugas Hirudo verbana em água artificial da lagoa (contendo 0,05% c/v de sal marinho) diluída em água desionizada a 16 °C em um ciclo claro-escuro de 12:12.</li>
	<li>Prepare as sanguessugas para dissecção anestesizando-as em uma cama de gelo esmagado por &gt;10 min até ficar imóvel.</li>
	<li>Encha um prato de dissecação preto, forrado de resina a uma profundidade de ~1 cm com soro fisiológico refrigerado contendo 115 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,7 mM CaCl2,10 mM D-glicose e 10 mM HEPES em água desominada; pH ajustado para 7,4 com 1 M NaOH. Fixar o lado dorsal de sanguessuga na câmara revestida de resina preta (pelo menos 20 cm x 10 cm com uma profundidade de pelo menos 2 cm acima da resina que tem pelo menos 2 cm de espessura).</li>
	<li>Sob um steromicroscópio a 20x de ampliação com iluminação guia de luz oblíqua, faça um corte longitudinal de pelo menos 3 cm de comprimento com uma tesoura de mola de 5 mm através da parede do corpo na parte 1/3do rostral do corpo. Use pinos para puxar a parede do corpo e expor os órgãos internos. NOTA: Qualquer refeição de sangue armazenada pode ser removida por sucção com uma pipeta Pasteur polida com fogo.</li>
	<li>Isole um gânglio médio individual 7 (sétimo gânglio segmental livre caudal para o cérebro).<ol>
<li>Abra o seio no qual o fio nervoso reside usando a tesoura de mola de 5 mm. Certifique-se de dividir o seio dorsalmente e ventrally deixando duas tiras de seio. Use fórceps nítidos nítidos para ajudar a guiar o corte e segurar o seio.</li>
		<li>Mantenha o seio ligado a cada uma das duas raízes nervosas bilaterais que emergem do gânglio (ele adere firmemente a cada raiz) para usar essas tiras de seios para fixar o gânglio.</li>
		<li>Remova o gânglio do corpo cortando os feixes de nervos rostral e caudal que ligam o gânglio (o mais longe possível do7º gânglio) e as tiras sinusas, e então corte as raízes laterais para onde elas emergem do seio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixar o gânglio (usando fórceps nº 5 enlatados) com pinos de insetos minuten encurtados, lado ventral para cima, em pratos de Petri claros e forrados de resina. Insira pinos nas tiras de seios e tecidos soltos aderindo às raízes e aos conectivos rostrais e caudais, o mais longe possível do gânglio. NOTA: A resina não deve ser mais espessa que 3 mm se uma boa iluminação de baixo for alcançada durante a gravação. Certifique-se de que o gânglio está tenso, tanto longitudinalmente quanto lateralmente</li>
	<li>Aumente a ampliação do estereótipo para 40x ou mais, e ajuste a iluminação oblíqua para que os corpos das células neuronais possam ser facilmente vistos na superfície ventral do gânglio logo abaixo do perineurium.</li>
	<li>Remova o perineúrio do gânglio (desheath) com microscissores.<ol>
<li>Comece a desheathing cortando a baia solta entre as raízes de um lado, e continue o corte lateralmente para o outro lado, certificando-se de manter as lâminas da tesoura superficiais e não prejudicar os corpos celulares neuronais diretamente abaixo da baia.</li>
		<li>Faça um corte superficial semelhante caudally do corte lateral ao longo da linha média.</li>
		<li>Agora pegue o retalho caudolateral de bainha de um lado com as fórceps finas #5, puxe-o para longe do gânglio, e corte-o com os microscisores.</li>
		<li>Repita do outro lado; este procedimento expõe ambos os neurônios HN(7) para registro com microeletros.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o prato de preparação na configuração de gravação e superfuse com soro fisiológico a uma vazão de 5 mL/min à temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Identifique e grave interneurônios de coração de sanguessuga com microeletrodos afiados
<ol><li>Durante a duração do registro do neurônio HN(7) (gravações duram entre 30 a 60 min), adquira e digitalize os traços de corrente intracelular e tensão a partir de uma amostragem de eletrometro neurofisiológico à taxa de 5 kHz com uma aquisição de dados digitais (Analógico ao Digital, A a D) e sistema de estimulação (Digital to Analógico, D a A), e exibir em uma tela de computador. NOTA: Qualquer software comercial ou personalizado e placa de A a D/D para A pode ser usada para aquisição de dados (A a D). D para A e software personalizado são necessários para grampo dinâmico.</li>
	<li>Sob um steromicroscope a 50-100x com iluminação de campo escuro de baixo, identifique provisoriamente um neurônio HN(7) do par bilateral por sua localização canônica na posição posteriolateral no gânglio do corpo médio sete.</li>
	<li>Agora procure penetrar no neurônio putativo HN(7) com uma microeletrodiça afiada preenchida com acetato de potássio de 2 M e 20 mM KCl usando um micromanipulador.<ol>
<li>Coloque a microeletrídria bem perto do corpo da célula alvo.</li>
		<li>Observe continuamente o potencial registrado com o eletrometro, e estabeleça esse potencial para zero mV antes de penetrar no neurônio.</li>
		<li>Penetre o neurônio com o microeletro, dirigindo lentamente o eletrodo ao longo de seu longo eixo com o manipulador. Utilizando a função de zumbido eletrometro, fixada em 100 ms de duração do zumbido, até que seja observada uma mudança negativa no potencial da membrana e atividade de espeto vigoroso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina o eletrometro no modo de fixação atual descontínua (DCC) ≥ 3 kHz para registrar simultaneamente o potencial da membrana e passar corrente com o microeletrol (compensação de capacidade definida para um pouco abaixo do toque e, em seguida, discada para trás 10%).<ol>
<li>Monitore a fixação do eletrodo durante o DCC em um osciloscópio.</li>
		<li>Injete uma corrente constante de -0,1 nA com o injetor de corrente estável eletrometro por um minuto ou dois para estabilizar a gravação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifique definitivamente o neurônio HN(7) por sua forma característica de pico e atividade de estouro fraca(Figura 1Ci).</li>
	<li>Execute qualquer análise de dados offline após a conclusão do experimento e salve todos os dados em um disco.</li>
</ol>3. Construa um HN em tempo real ou outro neurônio modelo
<ol><li>Crie software personalizado usando uma placa de processamento de sinal digital (DSB; D para A e A a D) em um computador de mesa para implementar em tempo real as correntes do modelo descritas em2,4 ou diferentes correntes de modelo para outros neurônios ou experimentos.<ol>
<li>Use equações de estilo Hodgkin-Huxley, pois elas são o método geralmente preferido para representar correntes de modelos.</li>
		<li>Consulte7 para obter uma descrição detalhada da implementação do modelo HN em tempo real e do grampo dinâmico antes da adição da corrente da bomba. Consulte a seção de introdução para a descrição das correntes, na+ concentração intracelular e conduções do neurônio HN(7) vivo no modelo HN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Implementar e variar conduências/correntes dinâmicas do grampo
<ol><li>Use o software de grampo dinâmico personalizado para o DSB implementar e alterar em tempo real grampo dinâmico qualquer uma das interfaces de usuáriográfica (Figura 3) (GUI) acessíveis, conducionas programadas e correntes do modelo HN em tempo real do neurônio HN(7). NOTA: Como lembrete, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> e <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> são a condutância máxima da persistente Corrente Na+ (IP) e da corrente máxima da bomba(eubomba),respectivamente.</li>
	<li>Use caixas de entrada GUI no software para fazer alterações, pois o modelo está em execução, na <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> (caixa PumpMaxL) e <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (caixa GpinHNLive)(Figura 3). NOTA: As caixas de entrada gui aceitam valores digitados, e são recomendadas etapas de 0,1 nA <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> para e as etapas de 1 nS são recomendadas para <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> .<ol>
<li>Adicione pequenas quantidades de <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> e com grampo dinâmico para estabilizar o estouro do neurônio <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> HN(7), que é enfraquecido por um vazamento induzido por microeletrodos, como mostrado na Figura 1Cii. NOTA: A penetração acentuada da microelerodia causa danos à membrana expressos como aumento da condutância do vazamento ou diminuição da resistência à entrada.</li>
		<li>Comece adicionando um valor <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> de 0,1-0,2 nA, que compensa o vazamento induzido pela microeletrico, mas deprime a excitabilidade e, em seguida, aumenta <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> gradualmente, o que aumenta a excitabilidade, até que o estouro regular se segue, geralmente em <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ~1-4 nS(Figura 4A).</li>
	</ol></li>
	<li>Sistematicamente co-variam essas correntes (incrementos de 0,1 nA para <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> e 1 nS para <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> ) ao neurônio HN(7) registrado com grampo dinâmico(Figura 3),e avaliam seus efeitos sobre características de explosão: frequência de pico (f: a recíproca da média do intervalo interspique durante uma explosão), intervalo interexplorativo (IBI: o tempo entre o último pico em um estouro para o primeiro pico na próxima rajada), duração do estouro (BD: o tempo entre o primeiro pico em uma rajada e o último pico em uma rajada), e período de explosão (T: o tempo entre o primeiro pico em uma rajada e o primeiro pico na explosão subsequente).<ol>
<li>Mude os valores <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> e, como na demonstração de vídeo, para se familiarizar com a técnica e, em seguida, se aventurar.<ol>
<li><img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">Segure-se em um valor fixo específico e varrer em incrementos de 1 nS sobre uma gama de suporte atividade <img alt="Equation 21" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> de estouro regular.</li>
			<li>Agora aumente o valor fixo de <img alt="Equation 22" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> 0,1 nA e volte a varrer uma gama de <img alt="Equation 23" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> suporte à atividade de estouro regular.</li>
			<li>Para cada par de parâmetros implementados, colete dados contendo pelo menos 8 rajadas para que medidas médias confiáveis de f, IBI, BD e T possam ser feitas.</li>
			<li>Continue com varreduras enquanto o neurônio permanecer viável, como avaliado por forte espetamento e um potencial de oscilação estável na linha de base.</li>
			<li>Coletar dados de vários neurônios (de diferentes animais) para gerar um gráfico composto(Figura 5).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cymbalyuk, G. S., Gaudry, Q., Masino, M. A., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursting+in+leech+heart+interneurons%3A+cell-autonomous+and+network-based+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bursting in leech heart interneurons: cell-autonomous and network-based mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 22, 10580-10592 (2002).</li>
<li>Hill, A. A., Lu, J., Masino, M. A., Olsen, O. H., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+a+segmental+oscillator+in+the+leech+heartbeat+neuronal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A model of a segmental oscillator in the leech heartbeat neuronal network.</a> Journal of Computational Neuroscience. 10, 281-302 (2001).</li>
<li>Tobin, A. E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myomodulin+increases+Ih+and+inhibits+the+NA%2FK+pump+to+modulate+bursting+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Myomodulin increases Ih and inhibits the NA/K pump to modulate bursting in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 94, 3938-3950 (2005).</li>
<li>Kueh, D., Barnett, W. H., Cymbalyuk, G. S., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29%2FK%28%2B%29+pump+interacts+with+the+h-current+to+control+bursting+activity+in+central+pattern+generator+neurons+of+leeches%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Na(+)/K(+) pump interacts with the h-current to control bursting activity in central pattern generator neurons of leeches.</a> eLife. 5, 19322(2016).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Barnett, W., Cymbalyuk, G. Hybrid systems analysis: real-time systems for design and prototyping of neural interfaces and prostheses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarnett%2C+W+%22Biohybrid+systems%3A+nerves%2C+interfaces%2C+and+machines%22">Biohybrid systems: nerves, interfaces, and machines</a>. Jung, R. , Wiley VCH Verlag. Weinheim. 115-138 (2011).</li>
<li>Sorensen, M., DeWeerth, S., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+hybrid+neural+system+to+reveal+regulation+of+neuronal+network+activity+by+an+intrinsic+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Using a hybrid neural system to reveal regulation of neuronal network activity by an intrinsic current.</a> Journal of Neuroscience. 24, 5427-5438 (2004).</li>
<li>Olypher, A., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+systems+analysis+of+the+control+of+burst+duration+by+low-voltage-activated+calcium+current+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Hybrid systems analysis of the control of burst duration by low-voltage-activated calcium current in leech heart interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 2857-2867 (2006).</li>
<li>Calabrese, R. L., Prinz, A. A. Realistic modeling of small neuronal networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalabrese%2C+RL+%22Computational+Modeling+Methods+for+Neuroscientists%22">Computational Modeling Methods for Neuroscientists</a>. DeSchutter, E. , MIT Press. MA, USA. 285-316 (2010).</li>
<li>Rybak, I. A., Molkov, Y. I., Jasinski, P. E., Shevtsova, N. A., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+bursting+in+the+pre-B%C3%B6tzinger+complex%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rhythmic bursting in the pre-Bötzinger complex: mechanisms and models.</a> Progress in Brain Research. 209, 1-23 (2014).</li>
<li>Picton, L. D., Nascimento, F., Broadhead, M. J., Sillar, K. T., Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+pumps+mediate+activity-dependent+changes+in+mammalian+motor+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sodium pumps mediate activity-dependent changes in mammalian motor networks.</a> Journal of Neuroscience. 37, 906-921 (2017).</li>
</ol>

Modelagem, grampo dinâmico e as análises resultantes que permitem são técnicas úteis para explorar como indivíduos e grupos de conduência/correntes iônicas contribuem para a atividade elétrica dos neurônios(Figura 1, Figura 2,Figura 4e Figura 5). O uso dessas técnicas mostra como a corrente de bomba Na+/K+ (eubombeio)interage com correntes fechadas de tensão, particularmente a persistente Corrente Na+ (IP),para promover uma explosão robusta no núcleo de HNs do gerador de batimentos cardíacos de sanguessuga. Combinando experimentos dinâmicos de grampos e modelagem, é possível testar modelos mais diretamente do que é possível com técnicas comuns de gravação de tensão e grampo de corrente. Os resultados obtidos a partir dos experimentos dinâmicos de grampo(Figura 5) serãoutilizados para refinar ainda mais o modelo HN. O método básico de fixação dinâmica demonstrado aqui pode ser personalizado para refletir as propriedades de qualquer neurônio em estudo se um modelo matemático de correntes neuronais pode ser determinado com experimentos de grampo de tensão.
A conclusão bem sucedida dos experimentos do tipo aqui mostrados requer um empetivo cuidadoso de um HN ou outro neurônio ao usar uma microeletrídra afiada, pois o forte estouro é reduzido pela penetração de eletrodos1. (Técnicas de gravação de patches de células inteiras, que minimizam o vazamento introduzido, também são aplicáveis a outros neurônios, mas não funcionam bem em neurônios de sanguessuga.) É fundamental que o emalamento do neurônio HN cause danos mínimos ao neurônio (vazamento adicional), e a resistência à entrada deve ser monitorada e deve estar na faixa de 60-100 MOhms para experimentos bem sucedidos4.
O grampo dinâmico é uma técnica poderosa, mas tem limitações impostas pela geometria neuronal porque as condutâncias artificiais são implementadas no local do eletrodo de gravação - geralmente o corpo celular não no local onde as correntes geradoras de ritmo são geralmente localizadas5,6,10. Nos neurônios HN de sanguessuga, o corpo celular está eletricamente próximo da zona de integração (neurite principal) do neurônio onde a maioria das correntes ativas são localizadas, e picos são iniciados.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.
The&#160;name of the first author was updated from:
Ricardo Javier Erazo Toscano
to:
Ricardo Javier Erazo-Toscano

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61473">Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses</a>. An author name was updated.

Erratum: Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

O batimento cardíaco em sanguessugas é impulsionado por um CPG composto por 9 pares bilaterais de interneurônios cardíacos (HNs) distribuídos em tantos gânglios segmentais do corpo médio. No núcleo do CPG estão pares mutuamente inibidores de interneurônios localizados nos gânglios3º e 4segmentos que formam osciladores de meio centro (HCOs)(Figura 1A). Esses neurônios continuam a estourar quando isolados farmacologicamente sinacicamente usando bicuculina1. Outros, como a dupla no7º gânglios segmentais (foco deste protocolo), também são estouros, capazes de produzir atividade estourando quando isolados sinapticamente. Eles não estão mutuamente conectados e recebem apenas entrada descendente, e assim são facilmente isolados cortando o gânglio do resto do cordão nervoso. Esta atividade de estouro independente é sensível à introdução da corrente de vazamento causada pela penetração com microeletrodos afiados para gravação, mas vigorosamente estourada quando gravada com métodos de patch soltos1.
Ambos os neurônios HN individuais e HCOs HN foram modelados (modelos individuais de compartimento isopotencial baseados em Hodgkin-Huxley de neurônios HN contendo todas as correntes sinopáticas e de tensão identificadas experimentalmente), e todas as características de explosão do sistema vivo foram capturadas com sucesso2. A miomodulina, um neuropeptídeo endógeno em sanguessugas, diminui significativamente o período (T) do ritmo de explosão de neurônios HN isolados e HN HCOs. Este modulador atua para aumentar a corrente h (corrente interna ativada por hiperpolarização, Ih) e diminuir abomba3. Essa observação levou à exploração de como eubombeio interage com Ih, e como sua co-modulação contribui para a atividade rítmica dos neurônios HN. A ativação da bomba aumentando [Na+]i (usando o monensin ionophore) acelera o ritmo de explosão hn tanto em HCOs HN quanto em neurônios HN isolados4. Essa aceleração dependia de Ih. Quando ih foi bloqueado (2 mM Cs+), o período de estouro não foi alterado por este método de ativação da bomba; no entanto, a duração da explosão (BD) foi reduzida, e o intervalo de interexploração (IBI) aumentou tanto em HN HCOs quanto em neurônios HN isolados4.
Para este protocolo, todas as correntes de um neurônio HN(7) vivo, incluindo a corrente da bomba, eubombeio,são incorporadas no modelo HN da seguinte forma:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq01v2.jpg"> (1)
onde C é a capacitância de membrana (em nF), V é o potencial de membrana (em V), t é tempo (em s). Descrições e equações detalhadas da corrente iônica foram descritas em outros lugares2,4. O neurônio modelo HN completo é executado em tempo real(Figura 2). O software será disponibilizado no GitHub após a publicação e será adequado para ser executado na placa de processamento de sinal digital descrita na Tabela de Materiais. Aqui, o foco da investigação é a corrente na+/K+ da bomba(eubombeio)e as correntes fechadas de tensão contribuindo significativamente na+ fluxo: um Na+ corrente rápida (INa) e uma corrente na+ persistente(IP). As conduções máximas dessas correntes <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1a.jpg"> <img alt="Equation 1b" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq1b.jpg"> são, respectivamente,. A bomba Na+/K+ troca três íons Intracelulares Na+ por dois íons extracelulares K+ ions, produzindo assim uma corrente externa líquida. É importante ressaltar que ele bombeia 3 vezes mais Na+ para fora do neurônio do que esta corrente indica, o que é importante para calcular a concentração intracelular Na+.
A corrente de bomba Na+/K+ depende de concentrações na+ intracelulares e é expressa pela seguinte função sigmoidal:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq02.jpg"> (2)
onde [Na]i é a concentração intracelular Na+, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> é a máxima Na+/K+ corrente de bomba, [Na]ih é a concentração intracelular Na+ para a meia-ativação da bomba Na+/K+ e [Na]é a sensibilidade da bomba Na+/K+ para [Na]i. [Na]eu constrói como resultado dos influxos Na+ transportados por IP e INa e é diminuído pelo Na+ efflux da bomba Na+/K+. A contribuição de Ih e ILeak para o fluxo na+ total é pequena e não é considerada no modelo em tempo real.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61473/61473eq03.jpg"> (3)
onde, v é o volume (~6,7 pL) do reservatório intracelular Na+ , F é constante de Faraday, e a concentração extracelular Na+ é mantida constante.
As condutenções de tensão e de vazamento têm sido diferenciadas - estas respondem ao potencial da membrana - da corrente da bomba, que é regulada pela concentração na+ intracelular calculada ([Na+]i). [Na+] i é construído através da entrada Na+ através da rápida Na+ corrente (INa) que produz potenciais de ação (picos) e a persistente Corrente Na+ (IP) que fornece a despolarização para suportar o spiking. [Na+] i é, por sua vez, reduzido pela ação da bomba através da extrusão de Na+. Os valores hn vivos da linha de base de <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (5nS) e <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgna.jpg"> (150 nS) foram assumidos, e levamos em conta qualquer grampo dinâmico <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> adicionado.
O objetivo do protocolo descrito aqui é manipular eubombear com precisão e reversivelmente em tempo real para descobrir como ele interage com correntes fechadas de tensão (corrente na+ persistente no protocolo atual) para controlar o estouro rítmico em HNs únicos. Para atingir esse objetivo, utilizou-se um grampo dinâmico, que introduz artificialmente, sob o comando, uma quantidade precisa de qualquer corrente que possa ser calculada à medida que o modelo está em execução. Este método tem vantagens sobre a manipulação farmacológica da bomba, que afeta todo o tecido, pode ter efeitos fora do alvo que muitas vezes são difíceis de reverter, e não podem ser precisamente manipulados. O grampo dinâmico5,6 lê a tensão de um neurônio registrado em tempo real(Figura 1B) e calcula e injeta, em tempo real, a quantidade de qualquer corrente baseada em equações de modelo e os valores definidos de qualquer <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> ou <img alt="Equation 1a" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> . Métodos semelhantes podem ser facilmente aplicados a qualquer neurônio que possa ser registrado intracelularmente. No entanto, os parâmetros terão que ser redimensionados ao neurônio escolhido, e o neurônio deve ser isolado de entradas sinápticas, por exemplo, farmacologicamente.

<table><tbody><tr><td>ANIMALS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hirudo verbana</td><td>Leech.com, sanguessugas vivas https://www.leech.com/collections/live-leeches</td><td></td><td>2-3 gramas</td></tr><tr><td>CHEMICALS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARTIFICIAL POND WATER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670-100G</td><td>1.8 mM adicionar por último após ajustar o pH</td></tr><tr><td>glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Instant Ocean (sal marinho)</td> <td>Spectrum Brands Inc., Madison, WI</td><td></td><td>0.05% (p/v) diluído em água deionizada</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>4 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>NaOH 0.1 N Solução</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2105-50ML</td><td>Ajuste para pH 7.4 com NaOH</td></tr><<tr><td>strong>MICROELECTRODES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K Acetato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1190-100G</td><td>2 M</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>SALINE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools Dumont</td><td>11251-30 OU 11251-20</td><td>Para dissecção geral de sanguessugas</td></tr><tr><td>AxoClamp 2A/2B Electrómetro DCC</td><td>Axon Instruments Molecular Devices</td><td>2A/2B</td><td>Para registo do potencial da membrana neuronal e da pinça de corrente descontínua</td></tr><tr><td>Resina preta</td><td>Dow Sylguard</td><td>170</td><td>Linhas gerais prato de dissecação</td></tr><tr><td>Vidro capilar 1 mm de diâmetro externo, 0,75 mm de diâmetro interno</td><td>A-M Systems</td><td>615000</td><td>Para a fabricação de microeletrodos afiados</td></tr><tr><td>Resina transparente</td><td>Dow Sylguard</td><td>184</td><td>Linhas Placa de Petri usada para montar gânglios para eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Condensador de campo escuro</td><td>Nikon</td><td>Dry 0,95-0,80 MBL 1210</td><td>Para iluminar a preparação do gânglio durante o empalamento celular</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Axon CNS Molecular Devices</td><td>1440A</td><td>Executa A a D e D a A para aquisição e estimulação de dados durante a eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Placa de processamento de sinal digital</td><td>dSpace</td><td>CLP1104</td><td>Nosso software implementa todas as condutâncias/correntes em nosso neurônio modelo HN em uma placa controladora DS1103 dSPACE PPC em tempo real a uma taxa de 20 kHz com uma GUI ControlDesk (dSPACE, Paderborn, Alemanha)9.&nbsp;</td></tr><tr><td>Extrator de Microeletrodos Falming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Para fabricar microeletrodos afiados</td></tr><tr><td>Iluminador de alta intensidade Fiber-Lite</td><td>Dolan Jenner Industries</td><td>170D</td><td>Para iluminar a dissecção geral e para iluminar a preparação do gânglio durante o empalamento celular</td></tr><tr><td>Amplificador de cabeceira para AxoClamp 2A</td><td>Axon Instruments</td><td>HS-2A Ganho:0.1LU</td><td>Agora parte da Molecular Devices para registro do potencial da membrana neuronal e pinça de corrente descontínua</td></tr><tr><td>Guia de luz</td><td>Dolan Jenner Industries</td><td>Rev R 38 08 3729107</td><td>Para iluminar a dissecção geral e para iluminar a preparação do gânglio durante o empalamento celular</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-385</td><td>Micromanipulador para empalamento celular com microeletrodos</td></tr><tr><td>Micromanipulador controlador</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td>Controla micromanipuladores para empalamento celular com microeletrodos</td></tr><tr><td>Pinos minúsculos</td><td>BioQuip</td><td>0,15 mm de diâmetro 1208SA</td><td>Deve ser encurtado curvando-se para ~5 mm</td></tr><tr><td>Placa de Ensaio Óptica 3' x 5' x 8"</td><td>Newport</td><td>Obsoleto</td><td>Com os 4 isoladores pneumáticos abaixo usados para construir um espaço de trabalho livre de vibrações para eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Osciloscópio</td><td>HAMEG Instruments</td><td>HM303-6</td><td>Para monitorar o setteling do eletrodo durante</td></tr><tr><td>a tesoura de mola DCC Pascheff-Wolff</td><td>Moria</td><td></td><td>Fornecido pela Fine Science Tools (Foster City, CA) catálogo # 15371-92</td></tr><tr><td>pClamp 9 Software</td><td>Axon Instruments</td><td>9</td><td>Agora parte da Moleculear Devices usa o Digidata 1440 para aquisição de dados e estimulação durante a eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Isoladores pneumáticos 28"</td><td>Newport</td><td>Obsoleto</td><td>Com placa de ensaio óptica usada para construir um espaço de trabalho livre de vibração para eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Software Simulink / MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2006 (Obsoleto)</td><td>Implementa braçadeira dinâmica na placa de processamento de sinal digital</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Wild</td><td>M5A</td><td>10x Eye Pieces usado para dissecar a sanguessuga e remover e desembainhar gânglios</td></tr><tr><td>Steromicroscópio</td><td>Partes selvagens</td><td>do olho de M5</td><td>20x usadas na estação electrophysiologcal para visualizar o neurônio para a penetração do microelectrodo</td></tr><tr><td>A mola de Vannas do estudante Scissors</td> ferramentas <td>91500-09</td> da <td>ciência fina</td><td>para a dissecção geral da sanguessuga</td></tr></tbody></table>

contribuição da na+/k+ bomba para estouro rítmico, explorada com modelagem e análises dinâmicas de grampo

Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses

A bomba Na+/K+, muitas vezes considerada como uma função de fundo na atividade neuronal, contribui com uma corrente externa (eubombeio) que responde à concentração interna de Na+ ([Na+]i). Em neurônios estourando, como os encontrados em redes neuronais geradoras de padrão central (CPG) que produzem movimentos rítmicos, o [Na+]i e, portanto, a bombaI, pode-se esperar que varie ao longo do ciclo de estouro. Essa capacidade de resposta à atividade elétrica, combinada com a independência do potencial da membrana, doto que eubombeio com propriedades dinâmicas não comuns às correntes baseadas em canais (por exemplo, canais de tensão ou transmissores ou canais de vazamento). Além disso, em muitos neurônios, a atividade da bomba é modulada por uma variedade de moduladores, expandindo ainda mais o papel potencial de eubombear em atividade de estouro rítmico. Este artigo mostra como usar uma combinação de modelagem e métodos dinâmicos de grampo para determinar como eubombeio e sua interação com a atividade rítmica de Na+ corrente persistente em um CPG. Especificamente, este artigo se concentrará em um protocolo de grampo dinâmico e métodos de modelagem computacional em interneurônios cardíacos de sanguessugas medicinais.

A modelagem com a adição de Ipump4 trouxe os achados experimentais apresentados na seção de introdução em foco mais nítido e começou a explicar o mecanismo assistido pela bomba de estouro. O modelo em tempo real demonstrado aqui foi ajustado ( <img alt="Equation 30" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> e <img alt="Equation 31" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> parâmetros escolhidos) para que produza atividade rítmica regular caindo dentro dos limites da atividade normal, como observado em experimentos - f, IBI, BD, T - e continue a produzir tal atividade quando os parâmetros modulados pela miomodulina <img alt="Equation 32" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> (a corrente máxima da bomba) e <img alt="Equation 33" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg"> (condutância máxima da corrente H) são variados ou co-variados no modelo. Os valores dos parâmetros determinados podem ser usados como um conjunto de referência ou canônico para experimentos de modelagem. Nestes casos de modelo, eubombeio oscila ao longo do ciclo de estouro como [Na+]i em torno de um nível de linha de base. Abomba contribui para o término do estouro durante a fase de estouro, e a hiperpolarização que produz ativa Ih durante o IBI; observe o nível máximo de Ih perto de iniciação de explosão(Figura 2).
Embora o modelo HN em tempo real tenha implementado todas as correntes2,4 disponíveis para fixação dinâmica, o foco aqui estava e <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> , que estão disponíveis <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> para alterações enquanto o modelo está em execução no grampo dinâmico GUI (Figura 3). O grampo dinâmico permite que o experimentador adicione (ou subtraia com uma ou ) conduance negativa <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgx.jpg"> ou corrente em um neurônio <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> artificialmente que imita a tensão e a dependência iônica de uma condutância real ou corrente. Assim, é possível explorar plenamente como uma determinada conduência/corrente interage com as conduências/correntes endógenas dentro das células(Figura 1). O modelo HN em tempo real indica que a persistente corrente Na+ (IP) nos neurônios HN contribui muito com a entrada Na+ que afeta fortemente [Na+]i (Figura 2) e, portanto, eubombeio. Como iP é ativo em potenciais de membrana relativamente negativos, ele se opõe a eubombear mesmo durante o IBI.
Essas observações indicam que é instrutivo explorar interações entre <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimx.jpg"> e <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> em neurônios HN isolados com grampo dinâmico como discutido anteriormente8,9,10. Esses experimentos (em andamento) são realizados com gravações afiadas de microeletrodos em neurônios HN(7) isolados (sétimo gânglio cortado do cabo nervoso). Até o momento, esses experimentos mostram que o estouro robusto é restaurado em neurônios HN tonicamente ativos (devido à penetração de microeletrodo introduzido vazamento) por co-adição de bomba IP e I com grampo dinâmico(Figura 4). Esta é uma observação importante indicando que um mecanismo de estouro está disponível nesses neurônios (mesmo quando o vazamento está comprometido) que resulta da interação de Ibomba e IP. Resultados preliminares indicam sua forte interação complicada, que pode ser explorada no modelo e experimentos(Figura 5).
Em conclusão, eu bombeio em resposta a aumentos periódicos em [Na+]i durante a atividade de estouro contribui para o ritmo de estouro através de terminação de estouro (diminuição de BD). A interação da bomba IP e I constitui um mecanismo suficiente para suportar a atividade de estouro endógeno; este mecanismo pode restabelecer o estouro robusto em interneurônios HN registrados intracelularmente no gânglio 7. A interação entre IP e Ibombeio através [Na+]afeta o período de estouro HN não monotonicamente e garante robustez do estouro autônomo. Essas conclusões estão em consonância com experimentos e modelagem em sistemas de vertebrados11,12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig01.jpg"> Figura 1: Cirurgia elétrica de coração de sanguessuga e implementação de I bomba e IP com grampo dinâmico. (A) Atividade normal de estouro registrada simultaneamente, extracelularmente (superior) e intracelular (inferior), em um HCO de batimentos cardíacos de sanguessuga de um terceiro gânglio, um esquema dos neurônios registrados e suas conexões sinápticas mutuamente inibitórias à direita. (B) Esquema de grampo dinâmico ao registrar um interneuron HN(7) em um gânglio isolado 7; note que não há interação sináptica entre os dois interneurônios HN(7). (Ci) Estourando em um interneuron HN(7) comprometido por vazamento. (Cii) Um estouro mais robusto pode ser produzido adicionando a bomba dinâmica de grampo I ( <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> = 0,1 nA), que compensa o vazamento induzido por microeletroda, mas deprime a excitabilidade, e <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (1 nS), o que aumenta a excitabilidade. Linhas tracejadas pretas indicam valores de linha de base. Abreviaturas: HN = interneuron cardíaco; HCO = oscilador de meio centro; Eubombeio = corrente externa; IP = Na persistente+ corrente; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= maximal Na+/K+ corrente da bomba; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = condutância máxima da persistente Na+ corrente; Vm = potencial de membrana; [Na+] i = concentração interna de Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig02.jpg"> Figura 2: Modelo de interneurônio HN único mostrando traços para potencial de membrana (Vm), I h, Ipump, [Na+]i, e IP. As correntes hiperpolarizantes externas são negativas, e as correntes despolarizantes para dentro são positivas. Linhas tracejadas pretas indicam valores de linha de base. Abreviaturas: HN = interneuron cardíaco; Eubombeio = corrente externa; IP = Na persistente+ corrente; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= maximal Na+/K+ corrente da bomba; Ih = corrente interior ativada por hiperpolarização; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg">= condutância máxima da persistente Na+ corrente; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgh.jpg"> = condutância máxima da corrente interior ativada pela hiperpolarização; Vm = potencial de membrana; [Na+] i = concentração interna de Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig03.jpg"> Figura 3: Interface gráfica do usuário do modelo de interneuron cardíaco (HN) em tempo real e grampo dinâmico implementado em uma placa de processamento de sinal digital. Superior Esquerdo: As caixas de matemática vermelha são caixas de parâmetros determinadas pelo usuário para o modelo em tempo real, enquanto as caixas Blue Live são caixas de parâmetros determinadas pelo usuário usadas no grampo dinâmico. El = o potencial de reversão da corrente de vazamento; Gl = condução de vazamento; Gh = condução máxima h-corrente; Gp = Condução máxima de corrente P; GCaS = condução máxima de corrente de cálcio lento; PumpMax = corrente máxima da bomba; [Condutância sinapática máxima GSyn2 para o respectivo neurônio; ThreshSyn2 limiar de cruzamento de picos para mediar um potencial sináptico - estes usados para fazer um híbrido (vivo/modelo) oscilador de meio centro não ilustrado aqui.]. Inferior esquerdo para grampo dinâmico. À esquerda estão 5 valores computados de variáveis de grampo dinâmico: Ibomba = corrente de bomba injetada; Ih = corrente h injetada (não utilizada aqui); IP = Corrente P injetada; NaI = na+ concentração interna calculada; ENa = potencial de reversão de sódio calculado. Inferior esquerdo para grampo dinâmico. À direita das variáveis computadas estão 6 caixas de parâmetros determinadas pelo usuário: GNa = uso de condutância máxima de sódio rápido e endógeno para calcular Na+ fluxo associado aos potenciais de ação; PumpMaxL = corrente máxima da bomba a ser injetada por grampo dinâmico; Naih ver equação (2); Gh = condutalidade máxima para determinar a corrente h a ser injetada por grampo dinâmico; Gp = uso de condutância máxima de corrente endogensa P para calcular Na+ fluxo associado à corrente P endógena; GpinHNLive = condução máxima para determinar a corrente P a ser injetada por grampo dinâmico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig04.jpg"> Figura 4: Análise dinâmica do grampo do estouro independente de HN(7). A regulação de <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> (A) 4.0 nS para(B) 9.0 nS retarda o ritmo de explosão HN independente. Traços experimentais mostram estouro rítmico em neurônio HN(7) isolado com grampo dinâmico. As faixas de oscilação de [Na+]i e Vm aumentam com o aumento regulamentado <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> . Traços de cima a baixo: Vm gravado, injetado i bomba,calculado [Na+]i, e injetado IP. Linhas tracejadas pretas indicam valores de linha de base. Abreviaturas: HN = interneuron cardíaco; Eubombeio = corrente externa; IP = Na persistente+ corrente; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg">= maximal Na+/K+ corrente da bomba; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = condutância máxima da persistente Na+ corrente; Vm = potencial de membrana; [Na+] i = concentração interna de Na+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61473/61473fig05.jpg"> Figura 5: Análise dinâmica do grampo do HN(7) independente. A regulação tende <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> a diminuir, seguida de um aumento do período de estouro do HN. Em experimentos individuais (pontos conectados por linhas) utilizando grampo dinâmico, <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> os valores foram varridos enquanto <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> eram mantidos constantes. As cores representam diferentes níveis constantes de <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> adicionados usados em diferentes experimentos. Abreviaturas: HN = interneuron cardíaco; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqimp.jpg"> = maximal Na+/K+ corrente da bomba; <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/61473/61473eqgp.jpg"> = condutância máxima da corrente na+ persistente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61473/61473fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentado aqui é um método de investigação dos papéis da bomba Na+/K+ e persistente Na+ corrente em interneurônios de coração de sanguessuga usando grampo dinâmico.

Contribuição da Na+/K+ Bomba para Estouro Rítmico, Explorada com Modelagem e Análises dinâmicas de grampo

The Na+/K+ pump, often thought of as a background function in neuronal activity, contributes an outward current (Ipump) that responds to the internal ...

A fixação dinâmica pode modificar ou introduzir qualquer corrente de membrana em um neurônio. Introduzimos e modificamos a bomba de potássio de sódio e a corrente de sódio persistente em um internaeuron cardíaco vivo de uma sanguessuga. O uso de uma lâmpada dinâmica permite um controle completo com uma tecla da dinâmica e amplitude de qualquer corrente introduzida em um neurônio em tempo real.O desenvolvimento de sistemas interativos em tempo real, como o grampo dinâmico, sustenta todas as pesquisas do IMC. Todos os aspectos dos estudos celulares sobre a atividade elétrica de neurônios e redes podem potencialmente se beneficiar do uso de grampo dinâmico. Os principais desafios dessa técnica são desenvolver os modelos em tempo real no neurônio e calibrar os ajustes dinâmicos de cãibra no neurônio selecionado para estudo.Para o isolamento do gânglio 7 de um fio nervoso de sanguessuga, encha um prato de dissecação de linha de resina preta com cerca de um centímetro de soro gelado suplementado com cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, D-glicose e HEPES em água desionizada e fixar um lado dorsal de sanguessuga anestinada fria na câmara. Use um microscópio estéreo em uma ampliação de 20X com iluminação guia de luz oblíqua e uma tesoura de mola de cinco milímetros para fazer um corte longitudinal de pelo menos três centímetros de comprimento através da parede do corpo na terceira porção rostral do corpo. Use pinos para separar o tecido da parede do corpo para expor os órgãos internos e aspirar o sangue para ter uma visão melhor.Isole um gânglio médio individual 7. Usando fórceps nítidos para ajudar a orientar o corte e segurar o seio, use a tesoura para abrir o seio em que o fio nervoso reside, tomando o cuidado de dividir o seio dorsalmente e ventrally. Mantendo o seio ligado a cada uma das duas raízes nervosas bilaterais que emergem do gânglio, corte os feixes de nervos rostral e caudal para remover o gânglio do corpo e corte as raízes laterais para onde emergem do seio.Use fórceps antigos de número cinco para fixar as tiras sinusal e tecido solto com pinos de inseto Minutien encurtados do lado ventral para cima em placas de Petri claras revestidas de resina. Fixar os conectivos rostral e caudal o mais longe possível do gânglio e fixar as raízes com segurança. Aumente a ampliação do microscópio estéreo para 40X ou mais e ajuste a iluminação oblíqua de modo que os corpos das células neuronais possam ser facilmente observados no lado ventral do gânglio logo abaixo do perineúrio.Usando micro tesoura, comece a cortar a baia peroneal solta entre as raízes de um lado do gânglio, continuando o corte lateralmente para o outro lado e certificando-se de manter a lâmina da tesoura superficial sem prejudicar os corpos celulares neuronais diretamente abaixo da baia. Faça um corte superficial semelhante caudally do corte lateral ao longo da linha média e use fórceps de número cinco fino para puxar um retalho lateral caudal de bainha longe do gânglio de cada vez para permitir que cada um seja extirpado. Quando ambos os retalhos tiverem sido removidos, ambos os internos do coração devem ser expostos.Coloque o prato na configuração de gravação e superfuse a amostra com soro fisiológico a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto à temperatura ambiente. Para identificar os interneurônios na configuração de gravação, selecione uma ampliação de 50 a 100X com iluminação de campo escuro abaixo e localize um neurônio HN 7 do par bilateral por sua localização canônica na posição posteriolateral no gânglio médio do corpo 7. Em seguida, use um micro manipulador para posicionar um micro eletrodo afiado preenchido com dois acetato de potássio molar e 20 milmolars de cloreto de potássio micro eletrodo muito perto do corpo da célula alvo e use um eletroômetro neurofisiológico para observar continuamente o potencial registrado.Defina esse potencial para zero milvolts e penetre o neurônio com o microeletrodo usando o manipulador para conduzir lentamente o eletrodo ao longo de seu longo eixo. Use uma função de zumbido de 100 milissegundos até que seja observada uma mudança negativa no potencial da membrana e uma atividade vigorosa de espinagem. Defina o eletrometro em pelo menos três quilohertz em modo de fixação de corrente descontínua para registrar simultaneamente o potencial da membrana enquanto passa a corrente para o neurônio.Use um osciloscópio para monitorar a configuração do eletrodo e use um injetor de corrente constante para injetar uma corrente constante de menos 0,1 nanoampes por um a dois minutos para estabilizar a gravação. O neurônio HN 7 pode ser identificado por sua forma característica de pico e atividade de estouro fraca. Para condução dinâmica de grampos e implementação atual, abra um programa de software de grampo dinâmico personalizado construído para a placa de processamento de sinal digital.E enquanto o modelo estiver em funcionamento, ajuste a corrente máxima da bomba para 0,1 a 0,2 nanoamps e aumente gradualmente a condução máxima da corrente de sódio persistente até que o estouro regular se segue. Sistematicamente co-variam essas correntes em incrementos de nanoampa de 0,1 para a saída máxima da corrente da bomba e um incremento de nanosiemens para a condutância máxima da corrente de sódio persistente e avaliar os efeitos desses aumentos na frequência de pico, intervalo entre rajadas, duração da explosão e período de estouro. Segure a condução máxima da corrente de sódio a um valor fixo específico e varre em um incremento de nanoampa sobre uma gama de correntes máximas de bomba para suportar a atividade de estouro regular antes de aumentar o valor fixo da condução de sódio por um nanosiemens e varrer uma segunda gama de correntes máximas de bomba.Para cada par de parâmetros implementado, colete dados contendo pelo menos oito rajadas para que medidas médias confiáveis da frequência de pico, intervalo entre rajadas, duração da explosão e período de explosão possam ser feitas. Em seguida, colete dados de vários neurônios adicionais como apenas demonstrado para gerar um gráfico composto. Usando este modelo, a corrente da bomba externa oscila ao longo do ciclo de estouro como a concentração interna de sódio em torno de um nível de linha de base.Esta corrente da bomba contribui para o término do estouro durante a fase de estouro. A hiperpolarização produzida pela corrente da bomba ativa a hiperpolarização ativada corrente interna durante o intervalo entre rajadas. O modelo de interneurônio cardíaco em tempo real indica que a corrente persistente de sódio em interneurônios cardíacos contribui para grande parte da entrada de sódio que afeta fortemente a concentração interna do sódio e, portanto, a corrente da bomba.Como a corrente de sódio persistente está ativa em potenciais de membrana relativamente negativos, ela se opõe à corrente da bomba durante os intervalos de estouro e inter-rajadas. Como ilustrado, o estouro robusto é restaurado em interneurônios cardíacos tonicamente ativos pela co-adição de correntes persistentes de bomba de sódio e potássio de sódio com um grampo dinâmico. Resultados preliminares indicam uma forte interação complicada entre as duas correntes, que podem ser ainda mais exploradas usando o modelo.Um experimento bem sucedido depende da boa desheathing do gânglio e condução cuidadosamente direcionada, penetrante e zumbido da microeletrídra. Aumentamos o grampo dinâmico implementando uma corrente de bomba dependente de sódio que é calculada estimando a concentração intracelular de um íon. Tais estimativas podem ser usadas para injetar qualquer corrente dependente de íons em um neurônio.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo vídeo ilustra os set-up, os procedimentos para consertar os corpos celulares e como implementar as gravações braçadeira dinâmicas a partir de células ganglionares em todo o monte do mouse retina. Esta técnica permite a investigação da contribuição precisa de inputs sinápticos excitatórios e inibitórios, e sua magnitude relativa e tempo para spiking neuronal.

Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

Accurate, quantificação baseada em causalidade da função diastólica global tem sido alcançado por meio de análise baseada na modelização cinemática do fluxo transmitral através do parametrizada enchimento diastólico formalismo (PDF). PDF gera rigidez, relaxamento e parâmetros de carga únicas e elucida 'novo' fisiologia, proporcionando índices sensíveis e específicos de disfunção.

Quantificação da função global diastólica por análise baseada em Modelagem cinemática de transmitral fluxo através do formalismo de enchimento parametrizada diastólica

Aqui um romance região do protocolo de análise de juros com base na classificação elipses melhor ajuste atribuídos a regiões de sinal positivo dentro de sequências de imagens de lapso de tempo bidimensional é demonstrada. Este algoritmo pode permitir que os investigadores a analisar exaustivamente sinais fisiológicos Ca + 2 com entrada mínima do usuário e preconceito.

Automated Análise de Ca dinâmico<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais em seqüências de imagens

A voltametria cíclica de varredura rápida pode monitorar neurotransmissão de dopamina in vivo no contexto de drogas, doenças e outras manipulações experimentais. Este trabalho descreve a implementação do QNsim1.0, um software para modelar respostas de dopamina estimuladas eletricamente de acordo com o modelo neurobiológico quantitativo para quantificar estimativas de liberação de dopamina e dinâmica de recaptação.

Modelagem de Dados de Voltammetria Cíclica de Dados Rápidos de Dados de Neurotransmissão de Dopamina Estimulados Eletricamente Usando QNsim1.0

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar sarcoplasmático Ca2 + reserva e função de remoção de cálcio diastólica em cardiomyocytes por um sistema de imagem de cálcio.

Avaliação da remoção de reserva e intracelular do cálcio diastólica cálcio sarcoplasmático em Cardiomyocytes Ventricular isolado

Uma técnica rápida e confiável é proposta para controlar as oscilações de forma de uma única bolha acústica aprisionada que é baseada na técnica de coalescência entre duas bolhas. As oscilações em forma de bolhas controladas por simetria em estado estacionário permitem a análise do fluxo de fluido gerado nas proximidades da interface de bolhas.

Indução de Microstreaming por Oscilações de Bolhas Não Esféricas em um Sistema de Levitação Acústica

O rápido relaxamento miocárdico e cardíaco é essencial para a fisiologia normal. Sabe-se hoje que os mecanismos de relaxação mecânica são dependentes da taxa de deformação. Este protocolo fornece uma visão geral da aquisição e análise de experimentos para aprofundar o estudo do controle mecânico da relaxação.

Controle mecânico do relaxamento utilizando trabéculas cardíacas íntegras

O dispositivo de sucção não nutritiva (NNS) pode facilmente coletar e quantificar as características do NNS usando uma chupeta conectada a um transdutor de pressão e registrada por meio de um sistema de aquisição de dados e laptop. A quantificação dos parâmetros do NNS pode fornecer informações valiosas sobre o neurodesenvolvimento atual e futuro de uma criança.

Medições de parâmetros de sucção não nutritivos usando um sistema de transdutor de pressão personalizado

Este protocolo apresenta uma caixa comportamental baseada em microcontrolador para avaliar a inibição pré-pulso (PPI) coletando dados de aceleração de um sensor abaixo da caixa. Esses dados avaliam déficits sensoriais em ratos socialmente isolados, com um método adicional para sincronizar dados com a atividade neuronal para avançar em estudos de neurofisiologia sobre distúrbios comportamentais.

Desenvolvendo uma caixa comportamental para avaliar a inibição pré-pulso e a atividade neural em modelos animais psiquiátricos

A eletrofisiologia dinâmica do clamp pode estabelecer ligações causais entre déficits de disparo neuronal e disfunção do canal iônico. Descrevemos métodos e protocolos de grampo dinâmico em neurônios de Purkinje cerebelares de camundongos, observando recursos úteis e considerações técnicas. Em um estudo representativo, adicionamos condutância de sódio modelada aos neurônios Tsc1-/- Purkinje para resgatar disparos repetitivos.

Métodos dinâmicos de grampo para investigar a excitabilidade neuronal prejudicada associada ao autismo

Um protocolo experimental é apresentado para montar, estimular eletricamente e analisar bicamadas de interface de gotículas dopadas com gramicidina A. As relações estrutura-função lipídio-proteína são quantificadas medindo mudanças na área da membrana, fluxo iônico e condutância de canal único, e relacionando essas respostas a mudanças semelhantes à plasticidade na condução iônica em um modelo de membrana inspirado em sinapses elétricas.

Caracterização da Estrutura e Função da Membrana Lipídio-Proteína usando Bicamadas de Interface de Gotículas

Explore a técnica de grampo dinâmico para estudar a contribuição da bomba Na+/K+ e da corrente persistente de Na+ em interneurônios cardíacos de sanguessuga. Este método permite controlar correntes iônicas em tempo real para investigar a atividade neuronal.

Contribuição da Na⁺/K⁺ Bomba para Estouro Rítmico, Explorada com Modelagem e Análises dinâmicas de grampo

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