Name: Coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a cultivar blastocistos humanos vitrificados até o estágio de peri-implantação e coletar células trophoblastos únicas para análise. Este método permite estudar mecanismos de implantação e formação placentária precoce.

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Gostaríamos de reconhecer os muitos pacientes do Centro de Medicina Reprodutiva do Colorado (CCRM) que graciosamente doaram seus embriões para pesquisa. Também gostaríamos de agradecer a Karen Maruniak e ao laboratório clínico da CCRM por sua ajuda no processamento de amostras de hCG, bem como Sue McCormick e sua equipe clínica de embriologia de FIV na CCRM por sua ajuda na coleta, armazenamento, rastreamento e doação de embriões. O financiamento foi fornecido internamente pela CCRM.

Todos os embriões humanos foram doados com consentimento para uso em pesquisa. Os protocolos para a cultura estendida do embrião humano foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional ocidental (estudo nº 1179872) e seguem diretrizes internacionais. Qualquer uso de embriões humanos deve ser revisto pelos órgãos de ética e governo adequados associados à instituição de pesquisa por meio deste protocolo.
1. Preparação
<ol><li>Prepare a mídia e as placas de recuperação um dia antes do aquecimento do embrião em um capô de fluxo laminar estéril.<ol>
<li>Prepare 2 mL de mídia de cultura blastocisto (BM) com 10% v/v substituto de proteína sérico (SPS). NOTA: A mídia de cultura blastocisto pode ou não conter proteína adicionada. Aqui, utilizamos um meio que deve ser suplementado com 10% da proteína albumina indicada. Verifique as orientações do fabricante para obter a variação desta suplementação. Todas as mídias devem ser filtradas usando um filtro estéril de 0,22 μM conectado a uma seringa estéril antes do equilíbrio.</li>
		<li>Encha dois pratos de lavagem de cultura de órgãos de centro-bem com 500 μL de BM com 10% v/v SPS cobertos com 500 μL de óleo de grau de cultura embrionária.</li>
		<li>Em um prato de cultura de tecido de 60 mm, camada 8 mL de óleo de cultura de embriões e, em seguida, ancorar 20 gotas de μL de BM com 10% v/v SPS para o fundo da placa de cultura. Faça 1 gota para cada embrião aquecido. NOTA: Mais mídia, gotas e lavar pratos podem ser feitos conforme necessário. As gotas também podem ser adicionadas ao prato antes que o óleo seja em camadas. As gotas de ancoragem sob o óleo ajudarão a reduzir a evaporação e quaisquer alterações subsequentes na osmolalidade.</li>
		<li>Equilibre a BM com 10% v/v SPS lavar pratos e placa de recuperação em uma incubadora a 37 °C, 6% DE CO2, 5% O2 por pelo menos 4h.</li>
		<li>Descongele um frasco da primeira etapa da mídia de cultura estendida (IVC1) em 4 °C ou na parte superior do banco.</li>
		<li>Prepare um prato de lavagem de 500 μL de IVC1 sem sobreposição de óleo. Alíquota de aproximadamente 4 mL de IVC1 em um tubo de tampa de snap de 5 mL.</li>
		<li>Equilibre o prato de lavagem IVC1 e pequeno tubo de tampa de estalo de IVC1 em 37 °C, 6% CO2 e O2 atmosférico por pelo menos 4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare placas de cultura estendidas um dia antes do aquecimento do embrião em uma capa de fluxo laminar estéril.<ol>
<li>Fibronectina diluída do soro humano em soro tamponado de fosfato (PBS) a 30 μg/mL. Serão necessários 250 μL de fibronectina de 30 μg/mL por embrião para revestir as câmaras.</li>
		<li>Abra o pacote de tampas bem câmara sob o capô enquanto toma cuidado para não tocar nos poços. Pipeta suavemente 250 μL de 30 μg/mL fibronectina em cada poço.</li>
		<li>Retorne a tampa para o deslizamento de cobertura câmara e coloque em 4 °C para 20-24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a placa de cultura estendida na manhã do aquecimento do embrião.<ol>
<li>Recupere o deslizamento de cobertura com fibronectina e coloque na capa de fluxo laminar. Remova a mistura de fibronectina com uma pipeta de 1 mL e descarte no recipiente de resíduos.</li>
		<li>Recuperar mídia IVC1 aquecida e equilibrada a partir de um pequeno tubo de tampa de snap de 5 mL.</li>
		<li>Pipeta 300 μL de IVC1 equilibrado em cada poço. Tenha cuidado para não deixar nenhum fluido tocar na tampa, pois isso aumentará o risco de contaminação.</li>
		<li>Retorne o deslizamento de cobertura câmara com IVC1 para incubar em 37 °C, 6% DE CO2 e atmosférico O2 até a remoção da zona pellucida na etapa 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Aquecimento vitrificado D5 embriões humanos
NOTA: Outros fabricantes podem ter protocolos ligeiramente diferentes de acordo com sua própria tecnologia de vitrificação. Consulte as instruções do fabricante para uso quando aplicável.
<ol><li>Aqueça 3,0 mL de solução de descongelamento (TS) em prato de 35 mm a 37 °C. Leve 300 μL de solução de diluição (DS) e dois poços de 300 μL de solução de lavagem (WS) em uma placa de 6 poços à temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando fórceps, remova cuidadosamente a manga do dispositivo criogeno, garantindo que o embrião vitrificado permaneça sempre sob nitrogênio líquido.</li>
	<li>Mova rapidamente o dispositivo criogeno de nitrogênio líquido e mergulhe a ponta do dispositivo criogeno em TS a 37 °C. Defina um temporizador por 1 min e mantenha o dispositivo criomerado até que o embrião se desprende no TS. NOTA: Embriões quentes um de cada vez para acompanhar as identidades dos embriões, pois podem estar relacionados com informações demográficas dos pacientes na análise a jusante.</li>
	<li>Durante a incubação de 1 min em TS, remova cuidadosamente o dispositivo criogeno e pegue suavemente o embrião e mova-se para o lado oposto do prato TS. NOTA: Se aculturar vários embriões, seja diligente para manter os embriões separados para garantir que as identidades adequadas sejam mantidas.</li>
	<li>Após 1 min, pegue suavemente o embrião com uma pequena quantidade de TS, aproximadamente 2 μL. Mova o embrião para o fundo do poço de 300 μL DS enquanto cobre o embrião em uma fina camada de TS da pipeta. Coloque um temporizador por 3 minutos e coloque a placa de 6 poços na parte superior do banco à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após 3 min, pegue o embrião com uma pequena quantidade de DS, aproximadamente 2 μL, e mova o embrião para o fundo do próximo poço contendo 300 μL de WS. Novamente, coloque suavemente uma pequena quantidade de DS da pipeta sobre o embrião. Defina um temporizador por 5 minutos e retorne ao banco de cima.</li>
	<li>Depois de 5 min, pegue o embrião com volume mínimo de WS e passe para o topo do poço final de 300 μL WS. O embrião cairá lentamente e lavará através do WS até o fundo. Expulse qualquer WS retido da pipeta para um poço vazio.</li>
	<li>Pegue o embrião com volume mínimo e retorne ao topo do mesmo poço de 300 μL de WS. O embrião cairá mais uma vez para o fundo do poço. Defina um temporizador por 1 min e devolva a placa de 6-well para o banco de cima.</li>
</ol>3. Recuperação de embriões aquecidos
<ol><li>Um de cada vez, mova embriões aquecidos para um prato de tecido de órgãos de poço central contendo 500 μL de BM equilibrado com 10% v/v SPS abaixo de 500 μL de óleo de grau de cultura de embriões equilibrado.</li>
	<li>Lave embriões pegando cada embrião e movendo-os para várias áreas do prato enquanto sopram a velha mídia entre os movimentos. Pegue o embrião e mova-o para uma queda de cultura individual de 20 μL de BM equilibrada com 10% v/v SPS sob óleo.</li>
	<li>Deixe os embriões aquecidos se recuperarem por 2h em uma incubadora a 37 °C, 6% DE CO2, 5% O2.
</li>
</ol>4. Remoção da zona
<ol><li>Após uma recuperação de 2h, avalie os embriões para a reese expansão e tire fotos de cada embrião.</li>
	<li>Mova embriões individualmente em 500 μL de um ácido 3-(N-morpholino)-ácido propanesulfônico (MOPS) com soro de bezerro fetal (V/v) antes do tratamento com solução ácida de Tyrode.</li>
	<li>Mova um embrião rapidamente através de 300 μL da solução de Tyrode ácido aquecido enquanto observa ativamente através do microscópio. A zona pellucida começará a se dissolver visualmente. Isso vai levar aproximadamente 5 s.</li>
	<li>Mova imediatamente o embrião com zona dissolução em 300 μL de mops aquecido médio tamponado para saciar a solução do ácido Tyrode.</li>
	<li>Mova o embrião com volume mínimo de mops tamponado médio em uma antena de tecido de órgão de poço central contendo 500 μL de BM equilibrado com 10% v/v SPS abaixo de 500 μL de óleo de grau de cultura de embriões equilibrado para lavar.</li>
	<li>Retorne o embrião à queda de recuperação de 20 μL da etapa 3.2. NOTA: Após o exame visual após a remoção da zona, quaisquer embriões com pellucida zona retida podem ser tratados com solução de Tyrode ácida, se necessário, repetindo as etapas 4.2-4.6. É desejado minimizar a exposição à solução do Tyrode.</li>
</ol>5. Cultura estendida do blastocisto
<ol><li>Mova os embriões individualmente para o prato de lavagem com mídia IVC1 equilibrada a partir da etapa 1.1.6. Mova cuidadosamente um embrião para um poço do deslizamento de coberturas com IVC1 equilibrado e mantenha a identificação do embrião. NOTA: Esta etapa precisa ser concluída o mais rápido possível para minimizar a evaporação média.</li>
	<li>Deslizamento de cobertura com câmara de retorno para uma incubadora definida para 37 °C, 6% CO2, atmosférico O2 por 2 dias. NOTA: Certifique-se de descongelar e equilibrar a mídia em 37 °C, 6% DE CO2, o atmosférico O2 para a troca de mídia 4h de antecedência.</li>
	<li>No outgrowth D2 (D7 pós fertilização), examine cuidadosamente a fixação de embriões sob o microscópio e realize a troca de mídia.<ol>
<li>Observe qual embrião está preso ao prato antes de trocar mídia. Bata suavemente na placa e examine se um embrião está firmemente preso à placa sob o microscópio.</li>
		<li>Retire a tampa e remova cuidadosamente 150 μL de IVC1 e descarte sem perturbar o embrião anexado. Se um embrião ainda não tiver ligado à placa, não troque a mídia, pois o soro em IVC1 ajudará na fixação de embriões.</li>
		<li>Pipeta 150 μL de mídia de cultura estendida equilibrada, IVC2, lentamente em cada poço e retornar a tampa para o deslizamento de cobertura câmara. NOTA: Certifique-se de que a remoção da tampa da tampa de câmara é minimizada para evitar a evaporação média.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Devolva cuidadosamente a tampa de câmara para a incubadora sem espirrar qualquer mídia na tampa. Repita a troca de mídia e verifique o anexo todos os dias de cultura estendida até que os embriões estejam prontos para fixação ou digestão de células únicas.</li>
</ol>6. Coleta opcional de mídia gasta
<ol><li>Opcionalmente, colete mídia gasta durante a troca de mídia cultural após d7 ou qualquer dia depois. Durante a etapa 5.3.2, em vez de descartar o snap-freeze médio os 150 μL do IVC1 removido em um tubo estéril e de baixa ligação de 0,5 mL para análise futura.</li>
</ol>7. Fixação opcional para imunofluorescência
<ol><li>Use uma pipeta de 200 μL para lavar embriões com trocas de mídia de 1/2 de PBS por 3x antes da fixação para remover quaisquer detritos extracelulares. Lavar detritos e proteínas em excesso ajudará a otimizar a clareza e reduzir o fundo em imagens obtidas com imunofluorescência.</li>
	<li>Remova todas as mídias e adicione lentamente 200 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) no PBS ao poço. O embrião vai querer grudar na superfície do fluido. Várias lavagens de 150 μL com 4% de PFA antes de remover todo o fluido ajudarão a minimizar qualquer dano ao embrião.</li>
	<li>Incubar os embriões em 4% de PFA por 20 minutos para fixação.</li>
	<li>Lave os embriões 3x por 10 min por lavagem com 200 μL de 0,1% v/v polisorbato 20 em PBS fresco.</li>
	<li>Armazene embriões fixos em 0,1% v/v polisorbate 20 em PBS a 4 °C antes de prosseguir com o protocolo de imunofluorescência.</li>
</ol>8. Digestão celular única com Trippsin
NOTA: Embriões frescos (não fixos) são usados para digestão celular única.
<ol><li>Lave o embrião uma vez com 200 μL de PBS e adicione 200 μL de solução de trippsina a cada poço. Devolva a tampa de câmara para a incubadora por 5 minutos.</li>
	<li>Remova a tampa de câmara da incubadora e examine os embriões sob um estereoscópio. As células da periferia do embrião começarão a se retrair e o MTB ainda deve ser anexado à placa onde estão remotamente localizados a partir do embrião.</li>
	<li>Use uma pipeta pequena ou uma pipeta bucal finamente puxada para pegar MTB individual antes de quebrar todo o embrião. Pule para a etapa 9.1 para salvar mtb e volte à etapa 8.4 após a etapa 9.3.</li>
	<li>Use uma pipeta de micromanipulação portátil ou pipeta bucal para dissociar suavemente o embrião aspirando para cima e para baixo.</li>
	<li>As células começarão a se dissociar de todo o embrião. Continue aspirando o embrião suavemente e repetidamente usando uma ponta de pipeta de diâmetro menor ou pipeta bucal até que o embrião tenha sido incubado por um total de 10 minutos em trippsina.</li>
</ol>9. Seleção de células únicas e coleta de amostras
<ol><li>Com trippsina mínima, mova as células dissociadas através de três gotas de lavagem de 20 μL PBS + 0,1% de polivinylpyrrolidone (PVP) sob óleo de cultura de embriões com o cuidado de não perder nenhuma célula.</li>
	<li>Depois de lavar as células, use uma pipeta de vidro finamente puxada para selecionar uma célula. Pipete cuidadosamente a célula única em um tubo estéril de 0,2 mL de baixa ligação com volume mínimo de PBS+0,1% PVP.</li>
	<li>Esto a 1 a 1 em células únicas de congelamento em nitrogênio líquido (LN2), e armazene em -80 °C para uso futuro.</li>
</ol>

<ol><li>Carter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+placentation--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Animal models of human placentation--a review.</a> Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).</li>
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<li>Mall, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+upon+the+collection+of+human+embryos+at+the+johns+hopkins+university%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university.</a> The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).</li>
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<li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+description+of+34+human+ova+within+the+first+17+days+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">A description of 34 human ova within the first 17 days of development.</a> American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).</li>
<li>Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+cylinder+development+during+in+vitro+extended+embryo+culture+predicts+the+post+transfer+developmental+potential+of+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O desenvolvimento do protocolo para cultivar embriões humanos através da implantação permitiu aos cientistas explorar um tempo anteriormente inexplorado no desenvolvimento8,,9. Aqui, usamos um sistema de cultura estendido para cultivar embriões humanos e estudar a diferenciação do trophoblasto precoce antes da formação de placenta villous. Os métodos aqui descritos permitem coletar diferentes sublineagens de TB para uso na análise de células únicas a jusante. Est...

A implantação humana e o surgimento da placenta precoce são historicamente difíceis de investigar e permanecem em grande parte desconhecidos porque os tecidos humanos são inacessíveis nesta fase em que a gravidez é clinicamente indetectável. Modelos animais são inadequados, pois a placenta humana tem suas próprias características únicas em comparação com outros mamíferos euterianos. Por exemplo, a placenta humana invade profundamente a decidua com algumas células trophoblastas atingindo pelo menos o terço interno do miométrio uterino, enquanto outras células remodelam as artérias espiral uterinas. Mesmo nossos ancestrais evolutivos mais próximos, os primatas não humanos, mostram diferenças na morfologia placentária e interações trophoblastos com os tecidos deciduais maternos1,,2,3. A obtenção de embriões humanos pré-implantação in vitro não era possível até a década de 1980, quando a fertilização in vitro humana clínica (FIV) começou como uma prática de rotina para o tratamento da infertilidade4. Agora, blastocistos humanos podem ser cultivados in vitro para permitir a seleção de embriões mais viáveis para transferência, bem como permitir testes genéticos seguros. A melhoria das técnicas de cultura de embriões, bem como o uso crescente de FIV, produziram muitos blastocistos excedentes que permanecem após a conclusão dos ciclos de tratamento do paciente. Com o consentimento do paciente, aprovação do IRB e com certas restrições, esses blastocistos podem ser utilizados para estudos de pesquisa. Tornaram-se um recurso inestimável que foi utilizado para a derivação de células-tronco embrionárias humanas5, entendendo a transição da massa celular interna para células-tronco embrionárias6,,7e, mais recentemente, foram cultivadas com sucesso até o dia (D) 13 para remodelar a implantação humana8,,9. Ao utilizar abordagens de omics unicelulares recém-desenvolvidas, o acesso a esses tecidos embriões humanos em estágio de implantação tem oferecido oportunidades únicas para descrever os mecanismos moleculares que regulam esse processo de diferenciação celular altamente dinâmico, que antes eram impossíveis de explorar10,,11,,12,13.
Aqui, descrevemos os métodos utilizados em nossa recente publicação caracterizando a dinâmica da diferenciação do trophoblasto durante a implantação humana12. Este protocolo inclui o aquecimento de blastocistos vitrificados, cultura de embriões estendida até D12 pós FIV, digestão enzimática do embrião em células únicas e coleta de células para ensaios a jusante(Figura 1). Este sistema de cultura estendida apoia o desenvolvimento de embriões humanos em estágio de peri-implantação sem insumo materno e recapitula a diferenciação do trophoblasto que parece consistente com as observações feitas a partir de espécimes histológicos há muitos anos14,,15,,16,17. Durante a implantação, a população de trophoblasto é composta por pelo menos dois tipos de células: o citotrofoblasto progenitor mononucleado (CTB) e o sintiotrofost (STB) internucleado, diferenciado terminalmente diferenciado. Após a digestão da trippsina, o CTB são células pequenas e redondas que são morfologicamente indistinguíveis de outras linhagens celulares(Figura 2A, painel esquerdo). A separação do CTB de outras linhagens celulares, como epiblasto e endoderme primitivo, pode ser alcançada por seus distintos perfis transcriômicos revelados pelo sequenciamento de RNA de célula única. As células sincitotrofoblastos podem ser facilmente identificadas como estruturas de forma irregular que são significativamente maiores que os outros tipos de células e localizadas principalmente na periferia do embrião (Figura 2A, painel médio; Figura 2B, painel esquerdo). As células de trophoblasto migratório (MTB) são outra sublineagem trophoblasto encontrada durante a cultura estendida do embrião e podem ser reconhecidas como aparentemente se afastando do corpo principal do embrião (Figura 2A, painel direito, Figura 2B, painel direito). O trophoblasto migratório, embora expresse muitos dos mesmos marcadores do trophoblasto extra villous (EVT), não deve ser referido como EVT, uma vez que as estruturas villous na placenta não surgiram neste estágio inicial de desenvolvimento.
Experimentalmente, conseguimos coletar pequenos CTB e STB grandes que são facilmente distinguíveis depois que embriões são digeridos em células únicas em D8, D10 e D12 (Figura 2A,B). Os trophoblastos migratórios surgem nos estágios posteriores da cultura de embriões estendidos e podem ser coletados em D12 antes da digestão enzimática de todo o embrião (Figura 2A,B). Ao separar fenotipicamente essas três sublineagens trophoblastos antes da análise de células únicas, podemos identificar marcadores transcriômicos específicos e definir o papel biológico de cada tipo de célula. O citotrofoblasto é altamente proliferativo e atua como células progenitoras no fornecimento das linhagens diferenciadas STB e MTB10,,11,,12,,13. O sinintismotrofã está envolvido na produção de hormônios placentários para manter a gravidez e também pode ser responsável pelos embriões que penetram no endométrio10,,11,12,13. O trophoblasto migratório tem características ainda mais fortes de um fenótipo migratório invasivo e migratório e são provavelmente responsáveis pela colonização mais profunda e extensa do endométrio uterino10,,11,,12,13. Após a definição da assinatura transcriômica de cada tipo de célula, as análises de agrupamento também revelaram dois subconjuntos adicionais de células que eram morfologicamente indistinguíveis da CTB e tinham transcriptomes com características de STB e MTB,respectivamente 12. Essas células de estágio intermediário provavelmente estão no processo de diferenciação do CTB para as sublineagens MTB ou STB e teriam sido negligenciadas se os embriões fossem digeridos cegamente e as células fossem separadas apenas por transcriptome.
O protocolo descrito aqui utiliza um sistema de cultura bidimensional (2D) e pode não ser ideal para suportar o desenvolvimento estrutural tridimensional (3D), como sugerido por uma publicação recente descrevendo um recém-desenvolvido sistema de cultura 3D13. No entanto, neste sistema 2D a diferenciação do trophoblast precoce parece ser consistente com observações feitas a partir de espécimes in vivo14,,15,,16,17. Este protocolo também pode ser facilmente adaptado para o uso no recém-descrito sistema de cultura 3D13 com mudanças mínimas. Todas as etapas são realizadas com uma pipeta de micromanipulação portátil com pontas descartáveis comercialmente disponíveis ou uma pipeta bucal de uma pipeta de vidro finamente puxada presa a tubos de borracha, um filtro e um porta-voz.

<table><tbody><tr><td>Seringa estéril NORM JECT Luer Lock</td><td>VWR</td><td>53548-019</td><td>Pacote de 100</td></tr><tr><td>incubadoras de CO2 com camisa de água 3130 ou 3110 Forma Série II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos Corning Primaria de 35 mm</td><td>VWR</td><td>62406-038</td><td>Caixa de 500 Tubo de</td></tr><tr><td>tampa de pressão de 5 mL</td><td>VWR</td><td>60819-295</td><td>Pacote de 25</td></tr><tr><td>tecidos Corning Primaria de 60 mm prato de cultura</td><td>VWR</td><td>25382-687</td><td>Caixa de 200</td></tr><tr><td>pratos de 6 poços</td><td>Agtech Inc.</td><td>D18</td><td>Pacote de 1, 10, ou 50</td></tr><tr><td>Solução Ácida de Tyrode</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1788</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Biotix 1250 &micro; L ponteiras de pipeta</td><td>VWR</td><td>76322-156</td><td>Pacote de 960</td></tr><tr><td>Blast, meios de cultura de blastocisto</td><td>Origio</td><td>83060010</td> Solução de diluição <td>de 10 mL</td></tr><tr><td></td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de Vidro Borossilicato Descartáveis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td>5.75 in. (146 mm); 720/Cs</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de parafina para cultura de embriões OvOil</td><td>Vitrolife</td><td>10029</td> Tubos de PCR Eppendorf <td>de 100</td></tr><tr><td>mL 0,2 mL</td><td>VWR</td><td>47730-598</td><td>Pacote de 1.000</td></tr><tr><td>tubos de PCR Eppendorf 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>89130-980</td><td>Caixa de 500</td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma humano. Solução líquida de .1%</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0895</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Gilson 1 mL Pipeman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 200-1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Gilson 20 &micro; L Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 2-20 &micro; L</td></tr><tr><td>Gilson 200 &micro; L Pipetteman</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td>1 Pipetteman 50-200 &micro; L</td></tr><tr><td>Meios de manuseio G-MOPS</td><td>Vitrolife</td><td>10129</td><td>125 mL</td></tr><tr><td>Meios de manuseio</td><td>Origio</td><td>83100060</td><td>60 mL</td></tr><tr><td>Ibidi 8 lamínulas bem compartimentadas</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>15 lâminas por caixa</td></tr><tr><td>IVC1/IVC2</td><td>Sistemas de Orientação de Células</td><td>M11-25/ M12-25</td><td>5-5mL alíquotas</td></tr><tr><td>K System T47 Placa de Aquecimento</td><td>Cooper Surgical</td><td>23054</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Seringa Estéreis MilliporeSigma Millex com Membrana Durapore PVFD</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGVR33RS</td><td>Pacote de 50</td></tr><tr><td>peças de boca</td><td>Loja de fertilização in vitro</td><td>MP-001-Y</td><td>100 peças</td></tr><tr><td>Prato de centro de poço</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-CW05-1</td><td>Caixa de 500</td></tr><tr><td>Quinn's Advantage SPS</td><td>Origio</td><td>ART-3010</td><td>12x 12 mL</td></tr><tr><td>Tubo de borracha de látex para bocais</td><td>Loja de fertilização in vitro</td><td>IVFS-NRL-B-5</td><td>5 pés.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Stripper</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-275</td><td>20/pk 275 &micro; m</td></tr><tr><td>Solução de Descongelamento</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>2 x 4 mL</td></tr><tr><td>The Stripper Micropipetter</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), sem vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td>1 x 100 mL</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-25ML</td><td>25 mL frasco</td></tr><tr><td>VWR 1-20 &micro; Ponteiras de pipeta L</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td>Pacote de 960</td></tr><tr><td>VWR 1-200 &micro; Ponteiras de pipeta L</td><td>VWR</td><td>89174-526</td><td>Pacote de 960</td></tr><tr><td>Solução de lavagem</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>1 x 4 mL</td></tr></tbody></table>

coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

A implantação humana, a apposição e a adesão à epitélia da superfície uterina e a subsequente invasão do blastocisto na decidua materna, é um evento biológico crítico, mas enigmático, historicamente difícil de estudar devido a limitações técnicas e éticas. A implantação é iniciada pelo desenvolvimento do trophectoderm ao trophoblasto e posterior diferenciação em sublineagens trophoblastos distintas. A diferenciação do trophoblasto precoce aberrante pode levar à falha de implantação, patologias placentárias, anormalidades fetais e aborto. Recentemente, foram desenvolvidos métodos para permitir que embriões humanos cresçam até o dia 13 pós-fertilização in vitro na ausência de tecidos maternos, período de tempo que abrange o período de implantação em humanos. Isso deu aos pesquisadores a oportunidade de investigar a implantação humana e recapitular a dinâmica da diferenciação do trophoblasto durante esse período crítico sem confundir influências maternas e evitar obstáculos inerentes ao estudo de eventos de diferenciação de embriões precoces in vivo. Para caracterizar diferentes sublinemas trophoblastos durante a implantação, adotamos métodos de cultura estendidos bidimensionais (2D) existentes e desenvolvemos um procedimento para digerir esnzimaticamente e isolar diferentes tipos de células trophoblastos para ensaios a jusante. Embriões cultivados em condições 2D têm uma morfologia relativamente achatada e podem ser subótimos na modelagem in vivo tridimensionais (3D) arquiteturas embrionárias. No entanto, a diferenciação do trophoblasto parece ser menos afetada, como demonstrado pela morfologia antecipada e mudanças na expressão genética ao longo da cultura estendida. Diferentes sublineagens trophoblastos, incluindo citotrofoblasto, sinintólogo e trophoblasto migratório podem ser separadas por tamanho, localização e emergência temporal, e usadas para caracterização ou experimentação. A investigação dessas células trophoblastos precoces pode ser fundamental na compreensão da implantação humana, no tratamento de patologias placentárias comuns e na mitigação da incidência de perda de gravidez.

Embriões saudáveis apresentaram proliferação contínua ao longo da cultura estendida(Figura 2B). Embriões anormais começaram a se retrair de suas bordas externas e se desintegrarem(Figura 2C). Pela nossa experiência, aproximadamente 75% dos embriões foram anexados ao fundo do prato revestido de fibronectina a 48 h e o acessório aumentou para aproximadamente 90% em 72 h na cultura. O sucesso do apego ao embrião pode ser em grande parte impactado pela qualidade ini...

Aqui, descrevemos um método para aquecer blastocistos humanos vitrificados, culminando-os através do período de implantação in vitro, digerindo-os em células únicas e coletando células trophoblastas precoces para uma investigação mais aprofundada.

Coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Muitas gestações falham no desenvolvimento de embriões humanos em torno dos sete ou oito pós-fertilização. Este protocolo oferece oportunidades aos investigadores para cultivar conceitos humanos in vitro durante esta misteriosa janela de implantação. Isso nos permite compreender os mecanismos que sustentam o sucesso da implantação humana e da formação placentária precoce.Usar um sistema de cultura estendido para cultivar embriões humanos em estágio de peri-implantação in vitro é provavelmente a única maneira de obter materiais autênticos para estudar a implantação e a diferenciação do trophoblasto precoce. Esta técnica simples é uma ferramenta poderosa que nos permite responder muitas perguntas fundamentais sobre o desenvolvimento precoce humano. Pesquisas realizadas com o uso deste protocolo contribuirão em grande parte para a compreensão da perda precoce da gravidez, da falha recorrente da implantação e das patologias da placenta.Demonstrando o procedimento estará Deirdre Logsdon, a doutoranda de um laboratório. Um dia antes do aquecimento do embrião, preparem a mídia e as placas de recuperação em um capô de fluxo laminar estéril. Encha dois pratos de lavagem de cultura de órgãos do centro com 500 microliters de BM com 10% SPS, depois cubra o BM com 500 microliters de óleo de grau de cultura de embriões.Em um prato de cultura de tecido de 16 milímetros, a camada oito mililitros de óleo de cultura de embriões e ancora 20 gotas de microliter de BM com 10% SPS para o fundo. Equilibre os pratos de lavagem e a placa de recuperação em uma incubadora a 37 graus Celsius, 6% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio por pelo menos quatro horas. Aliquot aproximadamente quatro mililitros de IVC 1 em um tubo de tampa de snap de cinco mililitros e prepare um prato de lavagem com 500 microliters de IVC 1 sem sobreposição de óleo.Equilibre o prato e o tubo na incubadora por pelo menos quatro horas. Fibronectina diluída do soro humano em PBS para 30 microgramas por mililitro. Abra o pacote de tampas bem câmara, tomando cuidado para não tocar nos poços, em seguida, delicadamente pipeta 250 microliters da fibronectina em cada poço.Substitua a tampa da tampa e incuba-a a quatro graus Celsius por 20 a 24 horas. Prepare a placa de cultura estendida na manhã do aquecimento do embrião. Recupere o deslizamento de cobertura com fibronectina e coloque-o na capa de fluxo laminar.Em seguida, remova a mistura de fibronectina com uma pipeta de um mililitro e descarte-a. Pipeta 300 microliters do IVC equilibrado 1 em cada poço e coloque o deslizamento na incubadora até a remoção da zona pellucida. Após o aquecimento e recuperação dos embriões humanos D5, avalie-os para a reesqueso e tire fotos de cada embrião.Mova cada embrião para 500 microliters de um meio de manuseio tamponado MOPS com 5% de FCS. Em seguida, trate-o com a solução ácida de Tyrode, conforme descrito no manuscrito do texto. Mova imediatamente o embrião com a zona dissolução em 300 microliters de meio tamponado MOPS aquecido para saciar a solução do Tyrode.Em seguida, mova o embrião para um prato de tecido de órgão de poço central contendo o BM equilibrado com 10% sps sob o óleo de grau de cultura embrião. Em seguida, devolva o embrião para a queda de recuperação de 20 microliter. Mova individualmente os embriões para o prato de lavagem com a mídia de IVC 1 equilibrada, em seguida, mova cuidadosamente cada embrião para um poço do deslizamento de cobertura câmara, certificando-se de acompanhar a identificação do embrião.Devolva a tampa de câmara para uma incubadora fixada a 37 graus Celsius, 6% de dióxido de carbono e oxigênio atmosférico por dois dias. No segundo dia de crescimento, examine cuidadosamente a fixação dos embriões sob o microscópio e troque a mídia. Saiba qual embrião está preso ao prato batendo suavemente na placa.Para alterar a mídia, remova a tampa e aspire cuidadosamente 150 microliters de IVC 1, tomando cuidado para não perturbar o embrião anexado. Se um embrião ainda não tiver ligado à placa, não troque a mídia porque o soro no IVC 1 ajudará na fixação. Pipeta lentamente 150 microliters de mídia de cultura estendida equilibrada, IVC 2 em cada poço e Substitua a tampa na tampa.Devolveu cuidadosamente o deslizamento de cobertura câmara para a incubadora. Repita a troca de mídia e verifique o anexo todos os dias até que os embriões estejam prontos para fixação ou digestão celular única. Se a coleta de mídia gasta for necessária para análise suplementar, congele os 150 microliters do IVC removido 1 em um tubo estéril de baixa ligação de 0,5 mililitro.Lave cada embrião uma vez com 200 microliters de PBS, depois adicione 200 microliters de solução de trippsina a cada poço. Devolva a tampa de câmara para a incubadora por cinco minutos. Use uma pipeta pequena ou uma pipeta bucal finamente puxada para pegar um MTB individual e, em seguida, use uma pipeta maior para dissociar suavemente o embrião aspirando para cima e para baixo.Continue aspirando o embrião suavemente e repetidamente usando uma ponta de pipeta de diâmetro menor até que o embrião tenha sido incubado por um total de 10 minutos em trippsina. Para realizar a seleção celular única, mova as células dissociadas através de 320 gotas de lavagem de microliter de PBS e 0,1% PVP sob óleo de cultura de embriões, tomando cuidado para não perder nenhuma célula. Depois de lavar as células use uma pipeta de vidro finamente puxada para selecionar uma célula.Pipete cuidadosamente a célula única em um tubo de ligação baixa de 0,2 mililitro estéril com um volume mínimo de PBS e PVP. Encaixe células únicas livres em nitrogênio líquido e armazene-as a 80 graus Celsius negativos para uso posterior. Embriões saudáveis apresentaram proliferação contínua ao longo da cultura estendida, enquanto embriões anormais começaram a se retrair de suas bordas externas e se desintegrar.No oitavo dia de fertilização pós-fertilização, a maioria das células nos embriões eram citotrofoblastos ou CTBs, que foram positivos para o marcador gata-3. Na periferia do embrião, os CTBs já estavam se diferenciando em sincitotrofoblastos multinucleados, que tinham uma folha como aparência e manchada positiva para humanos CGB. No dia 10, a formação de células trophoblastos migratórios positivos CGB estava no máximo, o que foi confirmado pelo aumento da produção de HCG na época.Os trophoblastos migratórios que mancharam positivo para o HLA-G, também começaram a emergir e migrar para longe do corpo embrionário. No dia 12, a diferenciação do STB estava em declínio e a produção de MTB tornou-se mais proeminente, sugerindo uma mudança de ênfase da produção hormonal no dia 10 para a migração celular no dia 12. Essas alterações podem ser observadas em um vídeo de lapso de tempo do período de peri-implantação.O vídeo demonstra o colapso da blastocele, a formação do STB e a eventual diferenciação e migração do MTB. A coisa mais importante a ter em mente ao completar este procedimento é que você está trabalhando com embriões vivos que são sensíveis a mudanças de temperatura, osmolalidade e pH. Minimizar o tempo que os pratos estão fora da incubadora é fundamental para manter a saúde dos embriões.Após a conclusão deste procedimento, os pesquisadores podem usar células únicas isoladas para ensaios de omics de células únicas a jusante, como sequenciamento de RNA de células únicas e sequenciamento de bisulfato de genoma inteiro para entender melhor as alterações epigenéticas e transcriômicas durante a implantação humana e a formação precoce da placenta.

single-cell-collection-trophoblast-cells-peri-implantation-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de blastocistos mouse ea derivação de células-tronco de blastocistos trofoblasto. Descrevemos também condições para a manutenção da propriedade de célula-tronco, bem como a indução de diferenciação em cultura.

Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

Neste protocolo, descreve-se a dissecção de placenta de rato sobre a gravidez d10.5, seguido de isolamento das células trofoblásticas, utilizando um gradiente de Percoll. Em seguida, demonstrar o uso de células isoladas, num ensaio de invasão de Matrigel.

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

Este protocolo descreve um método para eficazmente transfectar siARN em citotrofoblastos vilosidades humanos isolados de fresco utilizando formação de microporos e identificação de complexos de ADN-proteína nestas células. As células transfectadas pode ser monitorado por análises Western blot e EMSA durante o tempo de cultura de 4 dias.

As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos

Aqui apresentamos um protocolo para a conversão direta de fibroblastos embrionários murinos em células-tronco trofoblásticas totalmente funcionais e estáveis por meio da superexpressão de dez dias de Tfap2c, Gata3, Eomes e Ets2.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

As células gigantes trofoblásticas (TGCs) desempenham um papel fundamental na placenta para garantir uma gravidez saudável. Apresentamos um protocolo para avaliar o estado transcricional de genes em TGCs por hibridização in situ fluorescente nascente em cortes de criostato de embriões pós-implantação ou culturas de curto prazo de cones ectoplacentários embrionários do dia 7.

Análise transcricional por RNA Nascente PEIXES de<em&gt; In Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes ou<em&gt; In Vitro</em&gt; Culturas de curto prazo de Ectoplacental Cone explantes

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando proteína morfogênica óssea 4 e inibidores das vias Activina/Nodal. Este método é adequado para a diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas e pode gerar grandes quantidades de células para manipulação genética.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

Apresentado aqui é um protocolo para amostragem de tecido placentário humano das vilosidades seguido pelo isolamento de cytotrophoblasts para cultura de células primárias. Tratamento de trophoblasts com TNFa recapitula a inflamação no ambiente intra-uterino obeso e facilita a descoberta de alvos moleculares regulada pela inflamação na placenta com obesidade materna.

Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta

Este protocolo demonstra um método para o isolamento de células de decidual humanas primários coletados de membranas fetais de placentas de termo que podem ser usadas para uma variedade de aplicações (ou seja, imunocitoquímica, citometria de fluxo, etc.) com o objetivo para estudar o papel das populações de células diferentes em complicações na gravidez.

Isolamento de células humanas primárias do Decidual de membranas fetais de termo placentas

Aqui, apresentamos um protocolo altamente acessível para avaliar o movimento de célula em células do trofoblasto humana usando três ensaios in vitro: ensaio de zero, o ensaio de invasão transwell e o ensaio de proliferação celular.

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

O presente protocolo permite a recuperação de estruturas semelhantes a tubos formadas no ensaio clássico de formação de tubos de angiogênese in vitro , onde células, como células trofoblásticas, se organizam em estruturas semelhantes a capilares sobre uma camada de matriz de membrana basal extracelular. As estruturas recuperadas são usadas para isolamento de RNA e proteínas para várias análises bioquímicas.

Recuperação de células trofoblásticas do ensaio de formação de tubos de angiogênese para análise de expressão de marcadores de diferenciação

Esse protocolo permite a purificação, caracterização e cultivo de trofoblastos extravilosos primários HLA-G+ (EVT) a partir da decídua basal e da membrana coriônica das placentas humanas a termo. Culturas primárias de EVT mantêm a viabilidade por 96 horas, permitindo co-cultura com células imunes maternas comparadas por amostra e subsequente análise citométrica e molecular de fluxo de suas interações.

Purificação de Trofoblastos Extravillosos HLA-G+ de Tecidos Placentários Humanos para Fenotipagem e Análise Funcional

Aprenda a cultivar blastocistos humanos vitrificados até o estágio de peri-implantação e coletar células trophoblastos únicas para análise. Este método permite estudar mecanismos de implantação e formação placentária precoce.

Coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação

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