Name: Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprenda a quantificar fluxos de cálcio espontâneos em neurônios dopaminérgicos de mesencéfalo de rato usando GCaMP6f. Este método permite analisar apoptose mediada por cálcio e triagem de compostos neuroprotetores para doença de Parkinson.

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Apoiado por subsídios da American Parkinson Disease Association (APDA) e NIH R01NS115809-01 ao RS. Agradecemos ao Instituto texas a&M de medicina genômica (TIGM) por fornecer camundongos grávidas cronometrados para gerar culturas dopaminérgicas primárias.

<ol><li>Marras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+Parkinson%27s+disease+across+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Prevalence of Parkinson's disease across North America.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 21(2018).</li>
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<li>Lavaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noble+gas+xenon+provides+protection+and+trophic+stimulation+to+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).</li>
<li>Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines%3A+a+comparative%2Fcollective+analysis%2Fstudy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91(2015).</li>
<li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li>
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<li>Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+neurons+and+neuronal+networks%3A+an+integrative+view%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).</li>
<li>Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+pacemaking+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Descrevemos um sistema de cultura celular de longo prazo de mesencéfalia ventral (VM) para análise de alto teor de apoptose mediada por glutamato em neurônios. Estudos têm utilizado culturas dopaminérgicas primárias de cérebro médio para elucidar mecanismos excitotóxicos no contexto dos modelos de DP11,12. Neste estudo, utilizamos uma abordagem combinatória utilizando Indicadores de Cálcio Codificados Geneticamente (GECIs) para medir a atividade do Ca2+ e associar ainda mais essa atividade a alterações moleculares a jusante, como o início das cascatas de sinalização apoptótica4. O método tem múltiplas vantagens para outros sistemas de cultura celular semelhantes. Como temos um interesse particular na excitotoxicidade dentro do contexto da doença de Parkinson, usar culturas primárias de células VM é ideal. Usando diferentes técnicas de realocação de campo, como tampas gridded ou um estágio de microscópio XY motorizado combinado com imunostaining TH, podemos estudar diretamente os efeitos específicos do tipo celular da apoptose mediada por glutamato em neurônios de cérebro médio ventral. Além disso, o modelo de cultura celular de 3 semanas permite que os neurônios desenvolvam seu perfil molecular completo e maduro, refletindo os neurônios da DAadultos 9. Métodos anteriores se concentraram principalmente em mudanças moleculares após a excitotoxicidade mediada pelo glutamato13,14. O modelo é único em sua capacidade de correlacionar alterações agudas na fisiologia neuronal com eventos moleculares a jusante em tipos celulares identificados. Uma limitação do modelo de cultura primária é que a técnica de dissecção captura todo o cérebro médio ventral, incluindo neurônios DA e GABAérgic, bem como neurônios do SNc e VTA. Evidências sugerem agora que os neurônios da DA da SNc têm vulnerabilidade seletiva ao cálcio e eventual morte celular em comparação com os neurônios da DA do vizinho VTA15. Infelizmente, diferenciar os neurônios VTA dos neurônios VTA em culturas embrionárias tem se mostrado difícil com poucos marcos anatômicos para definir essas estruturas no cérebro embrionário.
Demonstramos que a técnica de cultura primária permite quantificação da atividade espontâneo heterogênio Ca2+ (Figura 1). Portanto, este é um modelo ideal do sistema de cultura celular para estudar células tonicamente ativas, como o pacemaking neurônios dopaminérgicos do cérebro médio, neurônios neocorticais e neurônios GABAérgicos do núcleo supraciasmático (SCN)16,17. Na maioria das aplicações, a imagem Ca2+ não atinge a mesma resolução temporal que a eletrofisiologia. Portanto, é provável que um único evento Ca2+ seja análogo a uma explosão de potenciais de ação neuronal. Isso pode ser interpretado para significar que a imagem Ca2+ permite medidas relativamente precisas de atividade anormal de estouro em células de marcação de passo e, portanto, é apropriada para uma tela de alto conteúdo de Ca2+-mediada morte celular excitotóxica.
Para alcançar e manter a atividade espontânea ca2+, é importante abordar dois pontos-chave no protocolo. A primeira é a densidade de revestimento das células após a dissecação. Para neurônios VM primários, estudos anteriores utilizaram cerca de 100.000 células/cm29,10. Adaptamos o protocolo para emplacar uma densidade de 200.000 células/cm2,o que cria uma faixa heterogedróia de atividade espontânea e aumenta o número de neurônios VM dopaminérgicos presentes em cada deslizamento de cobertura. Uma vez que diferentes neurônios de marcação de passo possuem propriedades distintas de disparo16,a densidade de revestimento precisa ser personalizada para o tipo celular que está sendo estudado e otimizado para alcançar níveis ideais de atividade espontânea. Em segundo lugar está o tempo de incubação após a infecção viral de AAVs. Como a densidade de revestimento, isso dependerá do contexto específico da questão da pesquisa e do tipo de AAV que está sendo utilizado. Para o AAV específico utilizado aqui, 5 dias de incubação após infecção viral é ideal para alcançar os níveis de expressão proteica desejados, o que permite mudanças dinâmicas na fluorescência GCaMP, a fim de registrar a atividade ca2+. Muitos fatores determinam a rapidez e eficiência que um AAV expressará sua carga, muito do que está fora do escopo deste método, mas brevemente, é importante considerar a atividade do promotor e a taxa em que a proteína de carga amadurece e dobra.
Outra vantagem do método é que ele permite uma flexibilidade considerável no formato, vetores de expressão, uso de equipamentos de imagem e a gama de questões científicas que podem ser abordadas. Além disso, o método permite a investigação de uma ampla gama de questões específicas que envolvem excitotoxicidade mediada por glutamato em DP, e outros modelos de disfunção do sistema nervoso. Por exemplo, a excitotoxicidade mediada pelo glutamato envolve múltiplos receptores e cascatas de sinalização5. Utilizando o método, e como demonstrado com o bloqueador AMPAR, NBQX na Figura 1,é possível dissecar componentes específicos da resposta de glutamato excitotóxico a um nível fisiológico e molecular. Possivelmente, uma abordagem semelhante usando inibidores de sistemas de segundo mensageiro poderia ser usada para determinar sua contribuição à excitoxicidade. Além disso, os AAVs usados aqui poderiam ser adaptados para expressar GECIs com promotores específicos de células ou sensores optogenéticos expressos por AAV que poderiam ser usados para medir outros parâmetros, como a liberação de neurotransmissores.
Além das dissecções embrionárias primárias e imagens confocal, grande parte do protocolo utiliza habilidades básicas de laboratório que não exigem treinamento especializado. Portanto, as limitações ao modelo incluem a dificuldade da técnica de dissecção embrionária, o tempo que as células devem ser cultivadas para atingir a maturidade, e acesso a um microscópio confocal, ou aparelho de imagem semelhante. Os muitos benefícios e flexibilidade do método superam essas limitações, tornando este um modelo ideal para estudar o papel da excitotoxicidade mediada pelo glutamato em distúrbios do sistema nervoso. Finalmente, este modelo pode ser uma ferramenta eficaz para tela de novos compostos para efeitos anti-apoptóticos e sua capacidade de preservar a saúde dos neurônios da DA.

A Doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum em todo o mundo, sem cura conhecida. Estimativas sugerem que a prevalência de DP continuará aumentando e deverá superar 1 milhão de diagnósticos até o ano de 2030 apenas nos Estados Unidos1. Com poucos tratamentos eficazes atualmente disponíveis para combater a DP, há uma necessidade premente de desenvolver terapias mais eficazes. PD é caracterizada por uma perda rápida e progressiva de neurônios de dopamina de cérebro médio (DA)2. Os mecanismos que fundamentam a neurodegeneração em DP são mal compreendidos. As evidências sugerem uma provável convergência de múltiplos mecanismos, como estresse oxidativo e disfunção mitocondrial, etc. que contribuem para o início de cascatas de sinalização apoptótica e eventual morte celular3.
Um desses mecanismos convergentes, a excitotoxicidade mediada pelo glutamato tem sido implicada em múltiplas doenças neurodegenerativas, incluindo a DP4. Embora a excitotoxicidade mediada pelo glutamato seja pensada para funcionar principalmente através da estimulação de receptores NMDA através de um aumento excessivo na concentração intracelular Ca2+ e eventual iniciação da apoptose, os receptores AMPA ca2+-permeáveis também foram implicados na resposta excitotóxica5,,6,7. Portanto, é de interesse determinar a contribuição dos receptores AMPA para a apoptose mediada por glutamato dentro de um modelo de DP. Isso pode ser conseguido usando nBQX, um bloqueador AMPA e kainate, que em concentrações de micromolar é seletivo para receptores AMPA8. Excitotoxicidade mediada por glutamato e cascatas de sinalização apoptótica são um alvo a jusante ideal para medir a extensão da morte celular, e um alvo potencial para intervenção terapêutica. Portanto, desenvolver um método de alto teor para avaliar a modulação mediada por glutamato da atividade de cálcio e a sinalização a jusante associada em neurônios messencéceicos ventral primários (VM) seria valioso para a triagem de novos métodos de tratamento sobre sua capacidade de preservar a saúde neuronal.
Aqui, desenvolvemos um protocolo no qual expressamos o indicador de cálcio geneticamente codificado (GECI), GCaMP6f, utilizando AAV2/5 com a sinapsina humana (hSyn) promotor para medir a atividade Ca2+ dos neurônios primários VM do rato em resposta à aplicação do glutamato que pode ser medido no nível fisiológico e molecular. Este rastreamento de alto teor pode ser adaptado para descobrir produtos farmacêuticos ou tratamentos que modulam a atividade ca2+ para preservar a saúde dos neurônios VM. Propomos que este modelo de cultura primária seja uma forma eficaz de triagem de novas intervenções em DP, baseadas em sua capacidade de preservar a saúde dos neurônios VM e mitigar a progressão da DP.

<table><tbody><tr><td>10% de formalina/PBS</td><td>VWR</td><td>100496-506</td><td></td></tr><tr><td>10X NA 0,3 objetiva de imersão em água</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>vidro de cobertura circular de 12 mm nº 1</td><td>Phenix Research Products</td><td>MS20-121</td><td></td></tr><tr><td>20X NA 0,85 objetiva de imersão em óleo</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO20XO</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultura de células plásticas não revestidas de 35 mm</td><td>VWR</td><td>25382-348</td><td></td></tr><tr><td>40X NA 0,3 objetiva de imersão em água</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>60X NA 1,35 objetiva de imersão em óleo</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XO</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina (sódio)</td> <td>Gold Bio</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplemento</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td>50x estoque</td></tr><tr><td>Microscópio Binolcular</td><td>Kent Scientific</td><td>KSCXTS-1121</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl 2 ), anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>frango policlonal anti-tirosina hidroxilase</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I (DNase)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose, andídro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX médio</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Soro equino</td><td>ThermoFisher</td><td>26050088</td> iluminador de fibra óptica <td>inativado por calor</td></tr><tr>, sistema <td>de filtro de KSC5410</td><td></td><td>Kent Scientific</td><td>de 100 V</td></tr><tr>, microscópio confocal<td>PES 22UM 250ML</td><td>VWR</td><td>28199-764</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 1000</td> Microscópio confocal <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 1200</td><td>Suplemento Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Cabra policlonal anti-frango Alexa Fluor 594</td><td>Abcam</td><td>ab150176</td><td></td></tr><tr><td>Cabra policlonal anti-coelho Alexa Fluor 594</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada Hanks (HBSS) 1x</td><td>ThermoFisher</td><td>14175095</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>101170-478</td><td></td></tr><tr><td>HeraCell 150 CO2 incubadora</td><td>Heraeus (ThermoFisher)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ v1.52e</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRIS-Tesoura Fina (Tipo Redondo)-S/S Str/31*8mm/13cm</td><td>RWD</td><td>S12014-13</td><td></td></tr><tr><td>Monossulfato de canamicina</td><td>Ouro Bio</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-glutâmico</td><td>VWR</td><td>97061-634</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio (MgCl2), andídromo</td> Bomba Mini-Peristáltica <td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MPII, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td><td>Aparelho Harvard</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>MULLER Micro Forceps-Str, pontas de 0,15 mm, 11 cm</td><td>RWD</td><td>F11014-11</td><td></td></tr><tr><td>NBQX</td><td>Hello Bio</td><td>HB0443</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal (NGS)</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Origem 2020</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Addgene</td><td>100837-AAV1</td><td>Título: 1.00E+13 gc/ml</td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Worthington Biomedical Corporation</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>10.000 U/mL</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl), peças de tubulação de</td> cabeça de bomba <td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td>anidra</tr><tr><td>para aparelho MPII</td><td>Harvard</td><td>55-4148</td><td></td></tr><tr><td>Coelho monoclonal anti-caspase-3</td><td>Abcam</td><td>ab32351</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl), anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td>BioXtra, &ge; 99,5% (GC)</td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/6 fêmeas grávidas</td><td>Texas A& M Institue for Genomic Medicine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta azuis de diâmetro largo P1000</td><td>VWR</td><td>83007-380</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

A doença de Parkinson (DP) é uma devastadora doença neurodegenerativa causada pela degeneração de neurônios dopaminérgicos (DA). O fluxo excessivo de Ca2+ devido à ativação anormal dos receptores de glutamato resulta em excitoxicidade da DA e foi identificado como um importante mecanismo para a perda de neurônios da DA. Neste estudo, isolamos, dissociamos e cultura neurônios de cérebro médio do messenencefalon ventral do camundongo (VM) de embriões de camundongos ED14. Em seguida, infectamos as culturas primárias do cérebro do camundongo de longo prazo com um vírus associado ao adeno (AAV) expressando um indicador de cálcio geneticamente codificado, GCaMP6f sob controle do promotor de sinápsia específico do neurônio humano, hSyn. Usando imagens confocal ao vivo, mostramos que neurônios de cérebro médio cultivados exibem fluxos ca2+ espontâneos detectados por AAV-hSyn-GCaMP6f. A aplicação do banho de glutamato às culturas do cérebro médio causa elevações anormais no Ca2+ intracelular dentro dos neurônios e isso é acompanhado pela ativação caspase-3 em neurônios da DA, como demonstrado pela imunostaining. As técnicas para identificar apoptose mediada por glutamato nos neurônios principais da DA do camundongo têm aplicações importantes para a triagem de alto conteúdo de drogas que preservam a saúde dos neurônios da DA.

Após a culminação inicial das células, tratamos pratos de cultura VM a 14 DIV com 1 μL de AAV hSyn-GCaMP6f e permitimos 5 dias de expressão viral. No dia da imagem, o buffer de gravação do HEPES foi preparado fresco. Usamos duas condições; em uma condição foi aplicado 20 μM de glutamato para 10 min, enquanto na outra condição 5 min de 10 μM NBQX aplicação precedeu uma co-aplicação de 10 min de 10 μM NBQX + 20 μM glutamato. Em ambas as condições, observamos alterações heterogênios e espontâneas na fluorescência GCaMP6f, que indicam fluxos ca2+ espontâneos, como mostrado nos traços representativos(Figura 1A,B, Filme Suplementar 1-2). A aplicação de 20 μM de glutamato gerou uma resposta Ca2+ robusta e sustentada em neurônios espontaneamente ativos e quiescentes(Figura 1A, Filme Suplementar 1). A aplicação de 10 μM NBQX reduziu a atividade espontânea e bloqueou parcialmente a resposta ao glutamato (Figura 1B, Filme Suplementar 2). A medida em que a aplicação do glutamato estimulou uma resposta ca2+ em cada condição foi quantificada usando área sob a curva, amplitude de pico e latência para responder. Ambas as áreas sob a curva e amplitude de pico foram semelhantes tanto para as condições tratadas com glutamato quanto para o glúteo NBQX + glutamato(Figura 1C),enquanto a latência à resposta foi significativamente aumentada na condição NBQX + glutamato(Figura 2A,B). Além de quantificar a resposta ca2+ ao tratamento de glutamato, fixamos e manchamos amostras com um anticorpo anti-caspase-3 como medida de apoptose mediada por glutamato. Observamos uma gama de ativação caspase-3 nas condições(Figura 3A,B). A ativação caspase-3 foi quantificada pela área de medição e intensidade média de caspase-3. Quando comparadas com células de controle não tratadas, a área média de células com ativação caspase-3 sob glutamato e NBQX + condições de glutamato tendência para significância(Figura 3B). A intensidade média de caspase-3 foi significativamente maior nas condições de glutamato e NBQX + glutamato em comparação com controles não tratados(Figura 3B). Juntos, esses resultados demonstram uma estrutura de alto teor em que apoptose dos neurônios pode ser medida quantificando respostas ca2+ aos agentes excitotóxicos e acompanhados com uma análise de eventos apoptóticos a jusante, como a ativação caspase-3 no mesmo conjunto de culturas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg"> Figura 1: Os neurônios mesencéces ventral cultivados apresentam atividade espontânea ca2+ e são robustamente estimulados pela aplicação do glutamato. (A) Traços representativos da atividade espontânea ca2+ em neurônios VM e sua resposta à aplicação de glutamato de 20 μM. (B) Traços representativos da atividade espontânea ca2+ em neurônios VM e sua resposta à aplicação de 10 μM NBQX + 20 μM glutamato. (C) Dados populacionais mostrando área sob a curva e amplitude de pico de traços ca2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg"> Figura 2: Bloqueio AMPAR com NBQX atrasa resposta à aplicação de glutamato em neurônios mesencéces ventral cultivados. (A) Os traços representativos Ca2+ de glutamato (cinza) e NBQX + glutamato (azul) evocaram respostas. Os traços médios de Ca2+ de glutamato (preto) e NBQX + glutamato (vermelho) são mostrados sobrepostos. (B) Dados populacionais que mostram latência à resposta para glutamato e NBQX + glutamato evocaram respostas. A variação percentual entre as condições de glutamato e NBQX + glutamato é exibida no painel direito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg"> Figura 3: A aplicação do glutamato aumenta a expressão caspase-3 em neurônios mesentados ventral positivos de tyrosina (TH). (A) Imagens confocal representativas das culturas VM imunos detidas para caspase-3 (verde) e TH (vermelho), barra de escala = 10 μm. (B) Dados populacionais mostrando área do neurônio DA e valor cinzento médio da expressão caspase-3 em cada condição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Filme suplementar 1: Atividade espontânea ca2+ e resposta à aplicação de glutamato. Fluxos espontâneos ca2+ na presença de tampão de gravação HEPES (0-300 s) seguidos pela aplicação de 20 μM glutamato (301-600 s). Barra de escala = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Filme suplementar 2: atividade espontânea ca2+ e resposta à aplicação NBQX + glutamato. Fluxos espontâneos ca2+ na presença de tampão de gravação HEPES (0-300 s) seguidos pela aplicação de 10 μM NBQX (301-600 s), e 10 μM NBQX + 20 μM glutamato (601-900 s). Barra de escala = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>

Aqui apresentamos um protocolo para medir fluxos in vitro ca2+ em neurônios de cérebro médio e seus efeitos a jusante no caspase-3 usando culturas primárias de cérebro médio do rato. Este modelo pode ser empregado para estudar alterações fisiosiopatológicas relacionadas à atividade anormal do Ca2+ em neurônios do cérebro médio, e para tela de novas terapêuticas para propriedades anti-apoptóticas.

Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Este protocolo quantifica os fluxos de cálcio em neurônios dopaminérgicos, que são perdidos na doença de Parkinson. Isso é útil para entender como o cálcio anormal causa a perda de neurônios dopaminérgicos na doença de Parkinson. Pela primeira vez, demonstramos fluxos espontâneos de cálcio em neurônios primários de cérebro médio cultivados.Este método pode ser usado para dissecar contribuições específicas de receptores envolvidos na apoptose mediada pelo cálcio. Nosso método fornece um caminho para telas de drogas de alto conteúdo para descobrir compostos neuroprotetores específicos e eficazes para a doença de Parkinson. Esses compostos neuroprotetores evitariam apoptose mediada por cálcio em neurônios dopaminérgicos.Comece preparando um mililitro de meio DMEM sem soro com um microliter de hSyn-GCaMP6f AAV por prato. Aspire o meio de cultura celular de cada prato e substitua-o por um mililitro do DMEM preparado com hSyn-GCaMP6f. Coloque os pratos de volta na incubadora Celsius de 37 graus por uma hora.Após a incubação, aspire o meio com AAVs e substitua-o por três mililitros de meio de cultura celular. Incubar os pratos a 37 graus Celsius por cinco a sete dias. Mudando o meio a cada dois ou três dias durante esse período de infecção viral.Prepare um litro do buffer de gravação hepes, 200 mililitros de 20 tampão de gravação de glutamato micromolar e 200 mililitros de 10 tampão de gravação micromolar NBQX de acordo com as instruções do manuscrito. Encha uma placa de Petri estéril de 35 milímetros com três mililitros do tampão de gravação. Pegue a placa de Petri com as culturas infectadas da incubadora, em seguida, pegue cuidadosamente a borda de um deslizamento de cobertura com fórceps finos de ponta e transfira-o para o prato com o tampão de gravação.Coloque o deslizamento de cobertura restante em médio de volta para a incubadora de 37 graus Celsius e transporte o prato com tampão de gravação para o microscópio confocal. Inicie o software de imagem. Enquanto estiver inicializando, inicie a bomba peristáltica e coloque a linha no buffer de gravação.Em seguida, calibrar o fluxo para dois mililitros por minuto. Transfira o deslizamento de cobertura infectado da placa de Petri para o banho de gravação com fórceps finos. Usando o objetivo de imersão de água 10X e luz de campo brilhante, encontre o plano de foco e procure uma região com alta densidade de corpos celulares neurônios, em seguida, mude para o objetivo 40X e refoque a amostra.Selecione e aplique AlexaFluor 488 na janela da lista Corantes. Para evitar a superexposição e o branqueamento fotográfico dos fluoroforos, comece com configurações de baixa HV e laser. Para o canal AlexaFluor 488, defina o HV para 500, o ganho para 1x e o deslocamento para zero.Defina a potência para 5% para a linha laser 488. Aumente o tamanho do pinhole para 300 micrômetros e use a opção de varredura focus x2 para ajustar os sinais de emissão de forma ideal aos níveis de subsaturação. As configurações podem então ser ajustadas para a melhor visibilidade de cada canal.Uma vez que as configurações do microscópio sejam otimizadas, mova o estágio para localizar uma região com múltiplas células exibindo alterações espontâneas na fluorescência GCaMP6f e foque no plano desejado para a imagem. Use a ferramenta Clip rect para prender o quadro de imagem a um tamanho que pode alcançar um intervalo de quadro de pouco menos de um segundo. Defina a janela de intervalo para um valor de 1.0 e a janela Num para 600.Para capturar um filme da série T, selecione a opção Tempo e use a opção de digitalização Xyt para iniciar a imagem. Observe a barra de progresso de imagem e mova a linha do buffer de gravação hepes para o buffer de gravação de 20 micromolar no ponto de partida apropriado. Quando a imagem estiver concluída, selecione o botão feito da série e salve o filme final da série T.Continue perfunde o glutamato por mais cinco minutos para que a cultura dos neurônios tenha sido exposta ao glutamato por um total de 10 minutos. Repita este processo para que cada deslizamento de cobertura seja imageado. É possível ver traços de cálcio e corpos de células neuronais imediatamente após o experimento.Use a ferramenta Elipse para desenhar o número desejado de ROIs em torno da soma neuronal. E use o botão Análise de séries para visualizar os traços. Após a exposição adicional de cinco minutos ao glutamato, remova o deslizamento da tampa do banho com fórceps finos e coloque-o de volta na placa de Petri com o tampão de gravação até que todas as imagens sejam concluídas.No dia da imagem, as culturas VM foram tratadas com glutamato ou uma combinação de glutamato e NBQX. Em ambas as condições, foram observadas alterações heterogêneas e espontâneas no GCaMP6f florescence indicando fluxos espontâneos de cálcio. A aplicação do glutamato gerou uma resposta robusta e sustentada de cálcio em neurônios espontaneamente ativos e quiescentes.A aplicação do NBQX reduziu a atividade espontânea e bloqueou parcialmente a resposta ao glutamato. A medida em que a aplicação do glutamato estimulou uma resposta de cálcio em cada condição foi quantificada usando a área sob a curva, amplitude de pico e latência para responder. A latência à resposta aumentou sob a condição de NBQX e glutamato.Para medir a apoptose mediada pelo glutamato, as células foram fixadas e manchadas com um anticorpo anti-Caspase-3. A intensidade média do caspase-3 foi significativamente maior em ambas as condições de tratamento em comparação com os controles não tratados. Uma análise mais minuciosa da morte celular tóxica excitada pode ser feita contando o número de neurônios dopaminérgicos de imunostain tyrosine positivos em controle e condição tratada com glutamato.Esta técnica abriu caminho para a compreensão das contribuições relativas de diferentes receptores e canais de ferro envolvidos na apoptose mediada pelo cálcio no neurônio dopaminérgico.

quantifying-spontaneous-ca2-fluxes-their-downstream-effects-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Este vídeo mostra a infecção de neurônios primários do mesencéfalo de camundongos com vírus adeno-associados carregando um indicador fluorescente de cálcio. A fluorescência do indicador confirma a infecção bem-sucedida e permite o monitoramento em tempo real da infecção neuronal.

Infectando neurônios primários do mesencéfalo de camundongos com vírus adeno-associados projetados

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/61481/quantifying-spontaneous-ca2-fluxes-and-their-downstream-effects-in-primary-mouse-midbrain-neurons'&gt;Bancroft, E. A., et al. Quantificando o estilo Ca = '-webkit-text-decoration-skip: none; font-family: Arial, sans-serif; font-size: 0.6em; font-style: normal; font-variant: normal; font-weight: 400; text-decoration-skip-ink: none; vertical-align: baseline; espaço em branco: pré-encapsulamento; '&gt; 2 + &lt; span...

Visualização do influxo de cálcio em neurônios do mesencéfalo ventral derivados de embriões de camundongos

Descrevemos um procedimento experimental para medir a atividade neuronal através de janelas ópticas duas acima bilateral corticies somatossensorial primária (S1) em Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos usando 2-fóton (2P) microscopia na vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

Aqui nós apresentamos um protocolo ao cálcio imagem sinalização em populações de tipos de células individuais na junção neuromuscular murino.

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

Apresentamos um protocolo de duas partes que combina imagens fluorescentes de cálcio com hibridização in situ, permitindo que o experimentador correlacione padrões de atividade de cálcio com perfis de expressão genética em um nível unicelular.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

As áreas sensoriais primárias no neocórtex exibem atividades espontâneas únicas durante o desenvolvimento. Este artigo descreve como visualizar atividades de neurônios individuais e áreas sensoriais primárias para analisar atividades síncronas específicas de área em camundongos neonatais in vivo.

Visualização in vivo da atividade espontânea no córtex sensorial de camundongos neonatais com resolução de neurônio único

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Aprenda a quantificar fluxos de cálcio espontâneos em neurônios dopaminérgicos de mesencéfalo de rato usando GCaMP6f. Este método permite analisar apoptose mediada por cálcio e triagem de compostos neuroprotetores para doença de Parkinson.

Quantificando fluxos espontâneos ca²⁺ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

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