Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário
9 de setembro de 2020
Aqui apresentamos um protocolo para medir fluxos in vitro ca2+ em neurônios de cérebro médio e seus efeitos a jusante no caspase-3 usando culturas primárias de cérebro médio do rato. Este modelo pode ser empregado para estudar alterações fisiosiopatológicas relacionadas à atividade anormal do Ca2+ em neurônios do cérebro médio, e para tela de novas terapêuticas para propriedades anti-apoptóticas.
Este protocolo quantifica os fluxos de cálcio em neurônios dopaminérgicos, que são perdidos na doença de Parkinson. Isso é útil para entender como o cálcio anormal causa a perda de neurônios dopaminérgicos na doença de Parkinson. Pela primeira vez, demonstramos fluxos espontâneos de cálcio em neurônios primários de cérebro médio cultivados.
Este método pode ser usado para dissecar contribuições específicas de receptores envolvidos na apoptose mediada pelo cálcio. Nosso método fornece um caminho para telas de drogas de alto conteúdo para descobrir compostos neuroprotetores específicos e eficazes para a doença de Parkinson. Esses compostos neuroprotetores evitariam apoptose mediada por cálcio em neurônios dopaminérgicos.
Comece preparando um mililitro de meio DMEM sem soro com um microliter de hSyn-GCaMP6f AAV por prato. Aspire o meio de cultura celular de cada prato e substitua-o por um mililitro do DMEM preparado com hSyn-GCaMP6f. Coloque os pratos de volta na incubadora Celsius de 37 graus por uma hora.
Após a incubação, aspire o meio com AAVs e substitua-o por três mililitros de meio de cultura celular. Incubar os pratos a 37 graus Celsius por cinco a sete dias. Mudando o meio a cada dois ou três dias durante esse período de infecção viral.
Prepare um litro do buffer de gravação hepes, 200 mililitros de 20 tampão de gravação de glutamato micromolar e 200 mililitros de 10 tampão de gravação micromolar NBQX de acordo com as instruções do manuscrito. Encha uma placa de Petri estéril de 35 milímetros com três mililitros do tampão de gravação. Pegue a placa de Petri com as culturas infectadas da incubadora, em seguida, pegue cuidadosamente a borda de um deslizamento de cobertura com fórceps finos de ponta e transfira-o para o prato com o tampão de gravação.
Coloque o deslizamento de cobertura restante em médio de volta para a incubadora de 37 graus Celsius e transporte o prato com tampão de gravação para o microscópio confocal. Inicie o software de imagem. Enquanto estiver inicializando, inicie a bomba peristáltica e coloque a linha no buffer de gravação.
Em seguida, calibrar o fluxo para dois mililitros por minuto. Transfira o deslizamento de cobertura infectado da placa de Petri para o banho de gravação com fórceps finos. Usando o objetivo de imersão de água 10X e luz de campo brilhante, encontre o plano de foco e procure uma região com alta densidade de corpos celulares neurônios, em seguida, mude para o objetivo 40X e refoque a amostra.
Selecione e aplique AlexaFluor 488 na janela da lista Corantes. Para evitar a superexposição e o branqueamento fotográfico dos fluoroforos, comece com configurações de baixa HV e laser. Para o canal AlexaFluor 488, defina o HV para 500, o ganho para 1x e o deslocamento para zero.
Defina a potência para 5% para a linha laser 488. Aumente o tamanho do pinhole para 300 micrômetros e use a opção de varredura focus x2 para ajustar os sinais de emissão de forma ideal aos níveis de subsaturação. As configurações podem então ser ajustadas para a melhor visibilidade de cada canal.
Uma vez que as configurações do microscópio sejam otimizadas, mova o estágio para localizar uma região com múltiplas células exibindo alterações espontâneas na fluorescência GCaMP6f e foque no plano desejado para a imagem. Use a ferramenta Clip rect para prender o quadro de imagem a um tamanho que pode alcançar um intervalo de quadro de pouco menos de um segundo. Defina a janela de intervalo para um valor de 1.0 e a janela Num para 600.
Para capturar um filme da série T, selecione a opção Tempo e use a opção de digitalização Xyt para iniciar a imagem. Observe a barra de progresso de imagem e mova a linha do buffer de gravação hepes para o buffer de gravação de 20 micromolar no ponto de partida apropriado. Quando a imagem estiver concluída, selecione o botão feito da série e salve o filme final da série T.
Continue perfunde o glutamato por mais cinco minutos para que a cultura dos neurônios tenha sido exposta ao glutamato por um total de 10 minutos. Repita este processo para que cada deslizamento de cobertura seja imageado. É possível ver traços de cálcio e corpos de células neuronais imediatamente após o experimento.
Use a ferramenta Elipse para desenhar o número desejado de ROIs em torno da soma neuronal. E use o botão Análise de séries para visualizar os traços. Após a exposição adicional de cinco minutos ao glutamato, remova o deslizamento da tampa do banho com fórceps finos e coloque-o de volta na placa de Petri com o tampão de gravação até que todas as imagens sejam concluídas.
No dia da imagem, as culturas VM foram tratadas com glutamato ou uma combinação de glutamato e NBQX. Em ambas as condições, foram observadas alterações heterogêneas e espontâneas no GCaMP6f florescence indicando fluxos espontâneos de cálcio. A aplicação do glutamato gerou uma resposta robusta e sustentada de cálcio em neurônios espontaneamente ativos e quiescentes.
A aplicação do NBQX reduziu a atividade espontânea e bloqueou parcialmente a resposta ao glutamato. A medida em que a aplicação do glutamato estimulou uma resposta de cálcio em cada condição foi quantificada usando a área sob a curva, amplitude de pico e latência para responder. A latência à resposta aumentou sob a condição de NBQX e glutamato.
Para medir a apoptose mediada pelo glutamato, as células foram fixadas e manchadas com um anticorpo anti-Caspase-3. A intensidade média do caspase-3 foi significativamente maior em ambas as condições de tratamento em comparação com os controles não tratados. Uma análise mais minuciosa da morte celular tóxica excitada pode ser feita contando o número de neurônios dopaminérgicos de imunostain tyrosine positivos em controle e condição tratada com glutamato.
Esta técnica abriu caminho para a compreensão das contribuições relativas de diferentes receptores e canais de ferro envolvidos na apoptose mediada pelo cálcio no neurônio dopaminérgico.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para medir fluxos de cálcio (Ca2+) in vitro em neurônios do mesencéfalo utilizando culturas primárias de mesencéfalo de camundongo. O modelo investiga alterações patológicas relacionadas à atividade anormal de cálcio, particularmente no contexto da doença de Parkinson, e fornece uma plataforma para triagem de potenciais terapêuticas neuroprotetoras.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Neurofarmacologia
Antecedentes
- O fluxo de cálcio em neurônios desempenha um papel crucial em diversos processos celulares.
- A perda de neurônios dopaminérgicos é uma característica marcante da doença de Parkinson.
- O estudo explora como níveis anormais de cálcio induzem apoptose em neurônios dopaminérgicos.
- A aplicação de glutamato e NBQX ajuda a avaliar respostas mediadas por cálcio e efeitos neuroprotetores.
Objetivo do Estudo
- Medir fluxos espontâneos de cálcio em culturas primárias de neurônios do mesencéfalo.
- Compreender as contribuições dos receptores para a morte celular mediada por cálcio.
- Facilitar a triagem de alto conteúdo para compostos neuroprotetores.
Métodos Utilizados
- Foram utilizadas culturas celulares derivadas de neurônios primários do mesencéfalo de camundongo.
- A imagem de cálcio envolveu o uso de GCaMP6f para monitorar alterações na fluorescência.
- Os procedimentos principais incluíram a preparação do meio de cultura e a aplicação de glutamato.
- Imagens sensíveis ao tempo foram realizadas por microscopia com configurações cuidadosas de parâmetros.
- As células foram tratadas com glutamato ou com uma combinação de glutamato e NBQX.
Resultados Principais
- As respostas de cálcio variaram conforme as condições de tratamento, mostrando alterações espontâneas e induzidas por glutamato.
- A atividade da caspase-3 foi significativamente aumentada em neurônios tratados, indicando processos apoptóticos.
- A aplicação de NBQX reduziu a atividade espontânea e modificou as respostas ao glutamato.
- O método demonstrou potencial para dissecar contribuições específicas de receptores na morte neuronal.
Conclusões
- Este estudo permite uma exploração detalhada da apoptose mediada por cálcio em neurônios dopaminérgicos.
- O protocolo atua como uma ferramenta valiosa para triagem de agentes neuroprotetores relevantes para a doença de Parkinson.
- Os achados fornecem insights sobre mecanismos patológicos e alvos terapêuticos para neurodegeneração.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a quantificação de fluxos de cálcio espontâneos e evocados por glutamato em neurônios primários do mesencéfalo de camundongo, fornecendo um sistema relevante para a doença ao modelar a excitotoxicidade de neurônios dopaminérgicos na doença de Parkinson. Ao associar a dinâmica do cálcio à ativação da caspase-3, ele auxilia na redução mecanicista de riscos de compostos neuroprotetores por meio de leituras funcionais da sobrevivência neuronal. A abordagem oferece continuidade translacional, desde a validação do alvo até a triagem pré-clínica, permitindo avaliação de alto conteúdo dos efeitos de fármacos sobre a apoptose mediada por cálcio.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas relacionadas à entrada de cálcio mediada por receptores de glutamato na perda de neurônios dopaminérgicos.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional do alvo ao medir o fluxo de cálcio como uma leitura imediata da atividade do receptor.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança preditiva ao associar a modulação do receptor a desfechos apoptóticos downstream por meio da ativação da caspase-3.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece medidas quantitativas e em tempo real das alterações intracelulares de cálcio como saída funcional do ensaio.
- Valor Operacional: Permite a padronização do ensaio por meio de condições definidas de tratamento com glutamato e NBQX e parâmetros de imagem.
- Escalabilidade: Suporta formato de triagem de alto conteúdo por meio de imagem em tempo real e análise automatizada de regiões de interesse (ROI) do corpo neuronal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Biomarcador Translacional: Utiliza a ativação da caspase-3 como um ponto final mensurável da apoptose induzida por glutamato em neurônios positivos para tirosina hidroxilase.
- Modelo Pré-clínico: Estabelece um sistema relevante para a doença, utilizando neurônios primários do mesencéfalo ventral para modelar a excitotoxicidade relacionada à doença de Parkinson.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a priorização de compostos com base em sua capacidade de suprimir o fluxo de cálcio e a ativação subsequente da caspase-3.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líder e os testes de eficácia pré-clínicos, ao fornecer uma leitura funcional da saúde neuronal em um modelo relevante para a doença de Parkinson.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a contribuição dos receptores de glutamato na apoptose mediada por cálcio em neurônios dopaminérgicos.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de medições padronizadas de fluxo de cálcio e detecção de apoptose por imunomarcação.
- Análises: Gera saídas quantitativas, incluindo área sob a curva, amplitude de pico e latência de resposta para traçados de cálcio, permitindo análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a desregulação do cálcio com a morte celular apoptótica em neurônios dopaminérgicos, apoiando o alinhamento de biomarcadores com vias neurodegenerativas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação de compostos neuroprotetores em múltiplas campanhas de triagem direcionadas à homeostase do cálcio.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao isolar o fluxo de cálcio como fator determinante na apoptose de neurônios dopaminérgicos.
- Valor Operacional: Promove a reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de transdução viral, preparação do meio de imagem e configurações de parâmetros confocais.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avanço ou interrupção ao fornecer evidências funcionais precoces do engajamento do alvo e da neuroproteção.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos que atenuam a apoptose mediada por cálcio em neurônios relevantes para a doença.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura primária de neurônios, transdução viral e microscopia confocal em tempo real.
- Depende de instrumentação, incluindo microscópio confocal com sistema de perfusão e software de análise de região de interesse (ROI).
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de exposição ao glutamato, aplicação concomitante de NBQX e coloração para caspase-3.
- Envolve considerações de adaptação ao traduzir o modelo de neurônios de camundongo para humanos ou para outros contextos de doenças.
- Limitado pela variabilidade na eficiência de transfeção de neurônios primários e na atividade espontânea basal entre diferentes preparações.
