Modelo de Retinopatia Induzida por Oxigênio para Doenças Isquêmicas da Retina em Roedores

Após seu desenvolvimento, o modelo de retinopatia induzida por oxigênio tornou-se amplamente utilizado em estudos pré-clínicos de doenças neovasculares da retina. Tem sido usado como modelo para estudar a angiogênese patológica em resposta à hipóxia. A principal vantagem deste modelo é que ele induz uma resposta neurovascular robusta que é reprodutível e facilmente quantificável.

Este modelo pode ser usado como um modelo pré-clínico para estudar os efeitos de possíveis candidatos terapêuticos. É considerado um modelo relevante para várias doenças humanas, como retinopatia da prematuridade, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade úmida. Registre o peso dos animais antes e depois da indução da hipóxia e no momento do sacrifício.

Certifique-se de que haja comida suficiente no fundo da gaiola e adicione cal sodada com indicador de cor no fundo da câmara para absorver o excesso de dióxido de carbono quando um sistema de filtragem não for usado. Monitore a umidade e a temperatura dentro da câmara, mantendo a umidade entre 40 e 65%Se necessário, aumente a umidade da câmara colocando pratos com água no fundo. Calibre o sensor de oxigênio com ar ambiente normal e 100% de oxigênio.

Em seguida, coloque os camundongos P7 em uma câmara e ajuste o nível de oxigênio para 75%Mantenha os camundongos na câmara por cinco dias até P12, monitorando os animais durante a indução. Quando terminar, remova os mouses da câmara. Pese os animais e faça marcas de identificação na cauda ou na orelha.

Depois que o animal estiver anestesiado, faça uma pitada no dedo do pé. Um pequeno reflexo é aceitável. Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento durante o tratamento.

Use uma seringa de vidro com uma agulha de calibre 33 a 34 para a injeção de IVT. Aplique uma gota de iodo, pressione a pálpebra para baixo e agarre o globo ocular com uma pinça. Faça a injeção posterior ao limbo, aproximadamente em um ângulo de 45 graus apontando para o nervo óptico.

Mantenha a agulha no lugar por 30 segundos após a injeção do medicamento para evitar o refluxo da solução injetada. Examine o olho em busca de complicações, como hemorragias ou danos na retina, após remover a agulha. Aplique pomada antibiótica na parte superior do olho após a injeção.

Se desejar, realize imagens in vivo em animais vivos durante o período de acompanhamento para registrar as alterações que se desenvolvem na retina durante as respostas angiogênicas. Use a tomografia de coerência óptica de domínio espectral para visualizar as camadas da retina in vivo. Colete os olhos dos animais cortando o tecido ao redor do olho, agarrando atrás do globo ocular com uma pinça curva e levantando o olho para fora da órbita.

Incube os globos oculares em paraformaldeído a 4% filtrado recém-feito por uma a quatro horas. Remova o fixador e lave os globos oculares três vezes com PBS por 10 minutos por lavagem. Disseque as retinas imediatamente ou armazene-as em PBS a quatro graus Celsius.

Prepare montagens planas de retina para quantificar a quantidade de neovascularização e o tamanho das áreas avasculares ou AVAs. Disseque a retina sob um microscópio estéreo usando microtesouras e pinças. Coloque o globo ocular em PBS para mantê-lo úmido e perfure-o no limbo com uma agulha de calibre 23 e, em seguida, corte ao redor do limbo com uma microtesoura curva para remover a íris e a córnea.

Coloque cuidadosamente a ponta da tesoura entre o EPR e a retina neural e corte o complexo da esclera coróide do EPR em direção ao nervo óptico. Faça o mesmo com o outro lado do globo ocular. Em seguida, corte ou rasgue suavemente o tecido até que o copo da retina fique exposto.

Puxe a lente para fora do copo de retina e adicione PBS ao copo. Remova todos os vasos hialóides, vítreos e detritos sem danificar a retina. Faça quatro incisões na retina com uma microtesoura reta para criar uma estrutura semelhante a uma flor.

Use um pincel macio ou uma pipeta de transferência para transferi-lo para uma placa de poço para coloração. Rotule a vasculatura retiniana com isolectina B4, que mancha a superfície das células endoteliais. Incube as retinas em tampão de bloqueio por uma hora e lave-as com 1% de NGS e 0,1% de Triton em TBS por 10 minutos.

Incube as retinas com 5 a 10 microgramas por mililitro de isolectina B4 conjugada com corante fluorescente durante a noite a quatro graus Celsius, protegida da luz. No dia seguinte, lave as retinas três vezes com 1% de NGS e 0,1% de Triton em TBS por 10 minutos por lavagem. Coloque as retinas em uma lâmina de microscópio retina interna voltada para cima.

Em seguida, espalhe cuidadosamente a retina usando um pincel macio e remova quaisquer vasos hialóides ou detritos restantes. Adicione o meio de montagem em cima da amostra e coloque uma lamínula em cima da lâmina. Armazene as retinas a quatro graus Celsius protegidas da luz.

Faça a imagem das montagens planas da retina usando um microscópio de fluorescência com uma objetiva de 10X. Concentre-se no plexo vascular superficial e na neovascularização pré-retiniana. Faça uma imagem de digitalização de bloco para capturar toda a retina e mesclar as digitalizações de bloco.

Quantifique as imagens medindo os AVAs, a área de neovascularização e a área total da retina usando um programa de processamento de imagem. Desenhe os AVAs e a área total da retina usando uma ferramenta de desenho à mão livre e selecione as áreas neovasculares usando uma ferramenta de seleção. No modelo de retinopatia induzida por oxigênio em camundongos, a vaso-obliteração ocorre na retina central.

Enquanto no modelo de rato, ele se desenvolve na periferia semelhante ao ROP humano. A neovascularização pré-retiniana se desenvolve perto das áreas avasculares, especificamente a retina central no camundongo e a periferia em ratos. A análise histológica usando cortes transversais ou montagens planas pode ser feita para avaliar alterações morfológicas nas retinas OIR ou a presença de tipos de células de interesse, por exemplo, células inflamatórias.

Opcionalmente, imagens in vivo não invasivas podem ser realizadas durante o período de acompanhamento do OIR. A vasculatura retiniana e hialoide pode ser visualizada com angiografia fluoresceínica e a tomografia de coerência óptica de domínio espectral pode ser usada para avaliar alterações estruturais na retina. As alterações funcionais podem ser medidas por eletrorretinografia.

O aflibercepte, um VEGF-Trap solúvel, inibe a revascularização neovascular e fisiológica na OIR. Os olhos OIR injetados em P14 com uma alta dose de aflibercept tinham AVAs retinianas ainda maiores do que os olhos não tratados, sugerindo que o aflibercept também bloqueia a revascularização fisiológica da retina impulsionada pela hipóxia. Ao tentar este protocolo, lembre-se de considerar o tamanho adequado da ninhada para o seu experimento com antecedência e monitorar o bem-estar das mães e dos filhotes na câmara de oxigênio.

Leve em consideração que o ganho de peso pós-natal afeta o resultado do modelo. As amostras de retina obtidas a partir deste modelo podem ser usadas para métodos analíticos, como imuno-histoquímica, análise de expressão gênica ou proteica, e para medir os efeitos de potenciais candidatos terapêuticos na retina em nível molecular.