Técnicas de imuno-histoquímica para análise da proliferação celular e neurogênese em ratos utilizando o análogo da timidina BrdU

Este é um protocolo chave no campo da Neurogênese Adulta. Aqui apresentamos uma descrição detalhada das etapas necessárias para obter uma coloração bem-sucedida. Essa técnica permite identificar simultaneamente proteínas específicas co-expressas nas células em divisão, preservando a integridade do tecido.

Recomendamos testar os anticorpos e condições teciduais com antecedência. As etapas cruciais são a permeabilização da membrana, a desnaturação cuidadosa do DNA e o teste dos tempos de bloqueio e lavagem. Padronizar a técnica é um desafio para novos laboratórios.

A preparação do reagente e a administração do análogo da timidina em roedores são essenciais para resultados bem-sucedidos Para a administração do análogo da timidina BrdU, imobilize a cavidade abdominal inferior para conter o rato experimental e use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 23 para injetar intraperitonealmente uma solução de BrdU de 50 miligramas por quilograma recém-preparada no animal. No ponto final experimental apropriado, colete o cérebro e congele-o para permitir a aquisição de cortes coronais de 40 micrômetros de espessura usando um micrótomo de criostato e coloque os cortes em poços individuais de uma placa de cultura de células de 24 poços em solução de proteção criogênica na ordem de sua coleta. Quando todas as seções tiverem sido coletadas, armazene as amostras a menos 20 graus Celsius por até alguns meses.

Para avaliar a coloração de BrdU, usando uma reação de peroxidase, com o complexo avidina-biotina-peroxidase, transfira as fatias da solução de proteção criogênica para PBS 0,1 molar até que as amostras atinjam a temperatura ambiente e enxágue os tecidos três vezes por 10 minutos com PBS 0,1 molar fresco por lavagem. Após a última lavagem, incuba os cortes em solução de bloqueio da peroxidase endógena por 30 minutos, à temperatura ambiente, seguido de três lavagens de 10 minutos em PBS 0,1 molar. Após a última lavagem, incube as seções por 20 minutos a 37 graus Celsius em ácido clorídrico dois molares, seguido de um enxágue de 10 minutos em tampão borato 0,1 molar.

Após três lavagens em PBS 0,1 molar gelado, incubar as amostras por duas horas em temperatura ambiente em solução de bloqueio PBS+, seguida de uma incubação noturna com anticorpo primário anti-BrdU de camundongo em PBS+a quatro graus Celsius. Após três lavagens de PBS 0,1 molar, incube as amostras por duas a quatro horas com o anticorpo secundário biotinilado de camundongo apropriado em PBS+ à temperatura ambiente. Após a lavagem, trate as seções com solução ABC por uma hora em temperatura ambiente, seguida de três lavagens de PBS 0,1 molar.

Após a última lavagem, transfira as fatias para a solução de substrato DAB-peroxidase por uma incubação de dois a 10 minutos até que as fatias fiquem cinza escuro. Se células positivas puderem ser visualizadas, enxágue as amostras com três lavagens com água da torneira de 15 minutos, seguidas por três lavagens de PBS de 0,1 molar. Após a última lavagem Use uma escova macia para montar cuidadosamente as fatias em lâminas gelatinizadas, para secar ao ar durante a noite em temperatura ambiente.

Na manhã seguinte, use um meio de montagem permanente para colocar lamínulas sobre as amostras. Para quantificar as células BrdU positivas, primeiro, use a ampliação de 4x, em um microscópio, para identificar o giro dentado e pesquise cuidadosamente a camada de células granulares ao longo do eixo Z em busca de núcleos marcados com BrdU. Depois de selecionar uma seção de intervalo para pesquisa de células em todo o giro denteado, conte todas as células BrdU positivas.

A morfologia do núcleo marcado pode mudar dependendo da quantidade de BrdU que a célula incorporou. Mova-se lentamente sobre o eixo Z para quantificar todos os núcleos de pelo menos 10 seções por animal e pelo menos cinco animais por grupo que integram um cluster. Para deconvolução de imagem, abra o plug-in 3D da função de propagação do ponto de difração, preencha todos os dados necessários, clique em OK e salve o arquivo.

Em seguida, abra o plug-in DeconvolutionLab2 e arraste a imagem Z-stack correspondente e o arquivo PSF para o slot de janela correspondente. Selecione o algoritmo de deconvolução e o número de iterações e clique em executar. Para combinar as imagens complicadas em uma única imagem de pilha Z, selecione Imagem e pilhas e clique em Projeto Z.

No menu do tipo de projeção, selecione Intensidade máxima. Clique em OK e salve o arquivo. Para criar uma imagem RGB, selecione Imagem e cor e clique em Mesclar canais para definir a imagem correspondente para o canal de cor desejado no menu suspenso.

Em seguida, desmarque a caixa Criar composto. Clique em OK e salve o arquivo. Quando todas as imagens do canal tiverem sido criadas, abra pelo menos dois dos arquivos de imagem e selecione canais de cores diferentes para cada arquivo de imagem para criar uma imagem RBG.

Nessas imagens, podem ser observados cortes representativos do giro dentado com células marcadas com BrdU. Como observado nessas imagens ampliadas das seções, as células marcadas demonstram uma intensa coloração escura. Fora de nota, existem diferenças significativas no número de células positivas para BrdU entre ratos controlados que não realizaram atividade física e o grupo experimental que foi exposto à atividade física, consistente com outros resultados relatados que demonstraram que a atividade física aumenta a proliferação celular no giro dentado adulto.

Ao tentar este protocolo, empregue soluções recém-preparadas e manuseie o tecido com cuidado. O hipocampo é suscetível a se separar do resto das lâminas quando tratado por ele e pode ser perdido. Este procedimento pode ser adaptado para marcação de DNA e avaliação do índice de síntese de DNA e duplicação de estudos de proliferação celular de coloração.

Esperamos que esse esforço tenha sido útil para a comunidade científica e facilite o esclarecimento de novas questões no estudo da proliferação celular, quando técnica de imuno-histoquímica.