Name: Um ensaio ex vivo para estudar candida albicans Hórgênese Háfal no Trato Gastrointestinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda um ensaio ex vivo para estudar a morfogênese de hifas de Candida albicans no trato gastrointestinal usando extratos de homogeneizado intestinal e imunofluorescência. Este método revela como os metabólitos intestinais regulam as transições morfogenéticas fúngicas.

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Os autores reconhecem recursos e apoio da instalação de pesquisa de núcleos celulares e moleculares da Universidade do Centro-Oeste.

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Centro-Oeste (IACUC), conforme descrito antesde 57. O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Centro-Oeste aprovou este estudo sob o Protocolo MWU IACUC #2894. As políticas de atenção animal da MWU seguem a Política de Atenção e Uso de Animais de Laboratório do Serviço Público de Saúde (PHS) e as políticas previstas na Lei de Bem-Estar Animal (AWA).
1. Os ratos estudam o protocolo padrão
<ol><li>Use camundongos C57BL/6J machos e femininos com pelo menos seis semanas de idade. Suplementá-los com água estéril com ou sem cefoperazone (0,5 mg/mL).<ol>
<li>Co-house ratos em grupos de 5, com cada gaiola contendo todos os machos ou todos os ratos fêmeas. Forneça aos ratos comida e água padrão do mouse (através de uma garrafa de 400 mL) o tempo todo.</li>
		<li>Verifique as gaiolas diariamente para garantir que os níveis de comida e água sejam suficientes, e para examinar os ratos em busca de sinais de angústia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Substitua a água por cefoperazone a cada 48 horas para garantir que antibióticos frescos sejam fornecidos independentemente da água restante nas garrafas de alimentação da gaiola.</li>
	<li>Após 5\u20127 dias de tratamento cefoperazone, eutanize camundongos via asfixia de CO2 observando o protocolo IACUC estabelecido. Confirme a morte por luxação cervical.</li>
	<li>Disseco camundongos usando tesouras afiadas esterilizadas autoclave e fórceps esterilizados por autoclave.<ol>
<li>Após a eutanásia, proteja o animal a uma superfície de dissecção fixando todos os membros de tal forma que o abdômen seja exposto.</li>
		<li>Pulverize a região abdominal com 70% de etanol para evitar que os peles grudem em fórceps, tesouras ou seções intestinais durante a dissecção.</li>
		<li>Use fórceps para beliscar e levantar uma seção da pele na base do abdômen e criar uma pequena incisão através da pele e fáscia subjacente usando uma tesoura. Tome muito cuidado ao fazer esta incisão para evitar perfurar o ceco ou parede intestinal.</li>
		<li>Este corte até a caixa torácica, expondo parcialmente a cavidade peritoneal. Faça um corte a partir do ponto da incisão inicial de ambos os lados estendendo-se para cima e lateralmente.</li>
		<li>Puxe estes retalhos lateralmente e fixe na superfície dissecando para expor totalmente a cavidade peritoneal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extrair o trato GI usando fórceps, ao mesmo tempo em que usar a tesoura para fazer cortes superiores ao estômago e na região distal do intestino grosso para garantir a coleta da maior quantidade de conteúdo intestinal de cada seção.</li>
	<li>Ao remover o trato GI, tome cuidado para evitar a ruptura dos componentes individuais. Separe o estômago, o intestino delgado, o ceco e o intestino grosso individualmente usando uma tesoura em suas extremidades proximal e distal.</li>
	<li>Para a coleta de cada conteúdo intestinal de cada seção, faça uma única incisão na extremidade distal de cada seção usando uma tesoura, seguida de expulsão manual do conteúdo intestinal em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL usando fórceps.</li>
	<li>Armazene o conteúdo intestinal a -80 °C para ensaios ex vivo.</li>
</ol>2. Preparação de placas de ágar extrato de levedura-peptone-dextrose (YPD)
<ol><li>A uma garrafa de vidro de 1 L adicione 25 g de fermento extrato peptone-dextrose em pó, 10 g de ágar e água ultrauso a um volume final de 500 mL.</li>
	<li>Autoclave a 121 °C por 30 min em um ciclo líquido para esterilizar a mídia.</li>
	<li>Sob um capô de fluxo laminar, despeje aproximadamente 20 mL de mídia de ágar em uma placa de Petri estéril. 500 mL de mídia ágar deve render aproximadamente 25 placas.</li>
	<li>Armazene as placas a 4 °C até ficar pronta para uso.</li>
</ol>3. Preparação ex vivo para ensaio de morfogênese hifal
<ol><li>Traço uma nova cultura de C. albicans SC5314 em uma placa de ágar YPD e incubar durante a noite a 30 °C.</li>
	<li>Escolha duas a três colônias individuais de médio porte da cultura C. albicans sc5314 cultivadas durante a noite e suspenda-se em 1 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS).</li>
	<li>Recupere o conteúdo do intestino congelado do congelador -80 °C e descongele a 25 °C.</li>
	<li>Pesar cerca de 150 mg de conteúdo intestinal em um novo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Suspenda o conteúdo intestinal com 150 μL de PBS (conteúdo intestinal e PBS a uma razão peso/volume de 1:1).</li>
	<li>Vórtice em alta velocidade por 30 s para homogeneizar o conteúdo intestinal e permitir sentar-se à temperatura ambiente por cerca de um minuto.</li>
	<li>Centrifugar os homogeneiza em 1000 x g por 3 min.</li>
	<li>Transfira o supernatante para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Repita as etapas 3.7 e 3.8 para remover todos os detritos do supernaspe.</li>
	<li>Adicione 10 μL do C. albicans SC5314 inóculo preparado acima para este supernatante</li>
	<li>Misture bem e incubar a 37 °C por 4 a 5 h.</li>
</ol>4. Adição exógena de metabólitos aos extratos homogeneizantes do intestino para o ensaio de morfogênese hifál
<ol><li>Recuperar o conteúdo do intestino congelado do congelador -80 °C e reinsu suspensão na PBS na proporção 1:1 (peso: volume).</li>
	<li>Adicione a concentração desejada de metabólitos intestinais ao conteúdo intestinal e à mistura de PBS.</li>
	<li>Vórtice em alta velocidade por 30 s para homogeneizar o conteúdo intestinal contendo metabólitos e permitir sentar-se à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos.</li>
	<li>Centrifugar os homogeneiza em 1000 x g por 3 min.</li>
	<li>Transfira o supernatante para um novo tubo de 1,5 mL. Repita as etapas 4.4 e 4.5 para remover todos os detritos do supernaspe.</li>
	<li>Adicione 10 μL do C. albicans SC5314 inóculo preparado acima a este supernatante. Misture bem e incubar a 37 °C por 4 a 5 h.</li>
</ol>5. Ensaio de morfogênese de albicanos (imunostaining e imagem)
<ol><li>Centrifugar as amostras a 1000 x g por 2 min e descartar o supernatante através de pipetagem.</li>
	<li>Fixar as amostras em 100 μL de 2% de paraformaldeído (PFA) por 15 min.</li>
	<li>Centrifugar a 1000 x g por 2 min e descartar supernaspeuta via pipetação.</li>
	<li>Lave as amostras duas vezes com 1 mL de PBS. Para lavar amostras, suspenda a pelota em PBS, encanar suavemente. Não vórtice a amostra, pois isso pode danificar estruturas hifais. Após a suspensão, centrífuga a 1000 x g por 2 min e descarte o supernaspeuta através de pipetagem.</li>
	<li>Incubar as amostras à temperatura ambiente em 100 μL de PBS contendo anticorpo policlonal C. albicans (diluição 1:100) por 30 min.</li>
	<li>Lave as amostras três vezes com 1 mL de PBS. NOTA: Ao usar um anticorpo fluorescente, recomenda-se que todas as etapas de diluição e lavagem sejam realizadas em luz fraca para evitar branqueamento de fotos e melhorar a longevidade da amostra.</li>
	<li>Incubar as amostras à temperatura ambiente por 15 minutos em 100 μL de PBS contendo anticorpo anti-Rabbit IgG Alexafluor 488 a 1:500 diluição. Realize a incubação em uma gaveta ou sala escura para evitar branqueamento de fotos.</li>
	<li>Lave as amostras três vezes com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Suspenda as amostras em 100 μL de PBS e transfira para uma placa de 96 poços para imagem. NOTA: Quando não for imageada, recomenda-se que a placa de 96 poços seja enrolada em papel alumínio para evitar branqueamento fotográfico.</li>
	<li>Células fúngicas de imagem usando lentes objetivas de 20x e 40x usando um microscópio de imagem de fluorescência. Use um filtro de proteína fluorescente verde (GFP) (comprimento de onda de excitação 470/40 e comprimento de onda de emissão 525/50) para detectar fluorescência.</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

O método descrito aqui apresenta uma nova maneira de investigar o efeito de antibióticos, impactos dietéticos, xenobióticos e terapêuticos na morfogênese hífa de C. albicans no trato GI. Uma vez que a maioria das infecções sistêmicas se origina do trato GI21,22,23,24,25,26,27,<...

Candida albicans é um patógeno fúngico oportunista e polimórfico que normalmente é commensal, mas pode sofrer uma alteração morfológica em uma forma virulenta capaz de causar infecções fatais em indivíduos imunocomprometidos1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans é uma das principais causas de infecções nosocomiais sistêmicas, com uma taxa de mortalidade de 40\u201260% mesmo com tratamento antifúngico2,14,15. Embora os albicanos residam em diferentes nichos hospedeiros, incluindo o sistema reprodutivo feminino16,17, a cavidade oral de indivíduos saudáveis18 e o trato gastrointestinal (GI)19,20, a maioria das infecções sistêmicas originárias do trato GI e, além disso, a fonte de infecção sistêmica é frequentemente confirmada como o trato GI21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. a patogenicidade dos albicanos no trato GI é influenciada por uma ampla gama de fatores; no entanto, uma característica importante necessária para a virulência é a transição de uma morfologia celular levedura para uma morfologia de células hífas virulenta35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. o apego e disseminação do trato de GI durante a infecção está altamente associado à sua capacidade de transição de uma levedura commensal para hifa virulenta, permitindo que os fungos causem doença invasiva44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
Uma variedade de fatores no intestino, incluindo n-acetilglucosamina, regulam a formação hifáfal por C. albicans. Portanto, é crucial diminuir a lacuna de conhecimento sobre a morfogênese hifal deste patógeno fúngico no trato GI54,55,56. Evidências recentes indicam que vários metabólitos intestinais controlam diferencialmente a morfogênese háfa de C. albicans in vitro57,58,59,60. No entanto, as restrições técnicas apresentam problemas ao tentar estudar a formação de c. albicans hyphae em amostras in vivo, especialmente a coloração de leveduras e células de higia e análise quantitativa do desenvolvimento de higificos. Para entender a morfogênese hábica de C. albicans no trato GI, um método ex vivo foi desenvolvido utilizando extratos solúveis de conteúdo intestinal homogeneizado de camundongos para estudar o efeito de metabólitos na morfogênese húfa fúngica. Utilizando amostras intestinais de camundongos resistentes e suscetíveis à infecção por C. albicans GI, este método ajudará a identificar e estudar o efeito de metabólitos, antibióticos e xenobióticos na morfogênese húfa fúngica no trato GI.

<table><tbody><tr><td>1 - 10 &micro; L Pontas de Pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-454</td><td>Diversos</td></tr><tr><td>100 - 1000 &micro; L Pontas de Pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-400</td><td>Diversos</td></tr><tr><td>20 - 200 &micro; L Pontas de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-451</td><td>Misc</td></tr><tr><td>ácido 2-metilbutírico</td><td>Sigma</td><td>193070-25G</td><td>composto inibidor de hifal</td></tr><tr><td>488 cabra anti-coelho IgG</td><td>Invitrogen (Fisher)</td> <td>A11008</td><td>IF Coloração secundária ab</td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>YPD componente de ágar</td></tr><tr><td>Microscópio de imagem automatizada</td><td>Keyence</td><td>BZX700</td><td></td></tr><tr><td>Candida Albicans Anticorpo</td><td>Invitrogen (Fisher)</td> <td>PA1-27158</td><td>IF Coloração primária ab</td></tr><tr><td>cefoperazona</td><td>Cayman</td><td>16113</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>ácido desoxicólico</td><td>Sigma</td><td>30960</td><td>composto inibidor de hifal</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td></td><td>Fisher D16-500</td><td>pinça composta promotora de hifal</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>08-885</td><td></td></tr><tr><td>ácido láctico</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAAL13242-06</td><td>composto inibidor de hifais</td></tr><tr><td>ácido litocólico</td><td>Sigma</td><td>L6250-10G</td><td>composto inibidor de hifal</td></tr><tr><td>ácido palmítico</td><td>Sigma</td><td>P5585-10G</td><td>composto inibidor de hifal</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td>IF Fixador de coloração</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 10x</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62692</td><td>PBS componente</td></tr><tr><td>ácido p-tolilacético</td><td>SCBT</td><td>sc-257959</td><td>composto inibidor de hifa</td></tr><tr><td>, ácido sebácico</td><td>Sigma</td><td>283258-250G</td><td>composto inibidor de hifa</td></tr>, <tr><td>tesoura de ponta afiada</td><td>Fisher</td><td>28301</td><td></td></tr><tr><td>água estéril Milli-Q</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Misc</td></tr><tr><td>YPD Caldo</td><td>BD Biosciences</td><td>242810</td><td>Componente de ágar YPD</td></tr></tbody></table>

um ensaio ex vivo para estudar candida albicans hórgênese háfal no trato gastrointestinal

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

A morfogênese húfala candida albicans no trato gastrointestinal (GI) é fortemente controlada por vários sinais ambientais, e desempenha um papel importante na disseminação e patogênese deste patógeno fúngico oportunista. No entanto, os métodos para visualizar a hifa fúngica no trato GI in vivo são desafiadores, o que limita a compreensão dos sinais ambientais no controle desse processo de morfogênese. O protocolo aqui descrito demonstra um novo método ex vivo para visualização da morfogênese hifal em extratos homogeneizados intestinais. Usando um ensaio ex vivo, este estudo demonstra que o conteúdo cecal de camundongos tratados com antibióticos, mas não de camundongos de controle não tratados, promovem a morfogênese háfagênese C. albicans no conteúdo intestinal. Além disso, adicionar de volta grupos específicos de metabólitos intestinais ao conteúdo cecal de camundongos tratados com antibióticos regula diferencialmente a morfogênese hifalina ex vivo. Em conjunto, este protocolo representa um novo método para identificar e investigar os sinais ambientais que controlam a morfogênese húfa cofálica no trato GI.

Esses resultados, juntamente com os achados anteriores do laboratório Thangamani60, indicam que quando os albicanos são cultivados ex vivo em extratos homogeneizados intestinais retirados do estômago, intestinos delgados e intestinos grandes de controle não tratado e camundongos tratados com antibióticos, C. albicans geralmente se desenvolve com uma morfologia de levedura(Figura 1B). No entanto, quando cultivados no extrato cecal de camundongos t...

O ensaio ex vivo descrito neste estudo utilizando extratos de homogeneização intestinal e coloração de imunofluorescência representa um novo método para examinar a morfogênese húfa de Candida albicans no trato GI. Este método pode ser utilizado para investigar os sinais ambientais que regulam a transição morfogenética no intestino.

Um ensaio ex vivo para estudar candida albicans Hórgênese Háfal no Trato Gastrointestinal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

O protocolo demonstrado neste vídeo nos permite entender o papel dos metabólitos intestinais na morfogênese húfa fúngica. Esta técnica ex vivo mais ou menos a aproximação mais próxima do intestino para estudar morfogênese hifagal fúngica de uma forma que nenhum estudo in vitro pode replicar. Este método pode ser aplicado para estudar o papel dos metabólitos intestinais em outros pat pato patógenos entéricos.Disseque camundongos usando tesouras e fórceps esterilizados autoclavados. Após a eutanásia, segure o animal em uma superfície de dissecção, fixando todos os membros para expor o abdômen. Pulverize a região abdominal com 70% de etanol para evitar que os peles grudem em fórceps, tesouras ou seções intestinais.Use fórceps para beliscar e levantar uma seção da pele na base do abdômen e criar uma pequena incisão através da pele e fáscia subjacente tomando cuidado para evitar perfurar o ceco ou parede intestinal. Este corte até a caixa torácica expondo parcialmente a cavidade peritoneal, em seguida, faça um corte começando no ponto da incisão inicial de ambos os lados e estendendo-se para cima e lateralmente. Puxe estes retalhos lateralmente e fixe-os à superfície dissecando para expor totalmente a cavidade peritoneal.Extrair o trato GI com fórceps enquanto usa a tesoura para fazer cortes superiores ao estômago e na região distal do intestino grosso para garantir a coleta da maior quantidade de conteúdo intestinal. Ao remover o trato GI, tome cuidado para evitar a ruptura dos componentes individuais. Separe o estômago, intestino delgado, ceco e intestino grosso em suas extremidades proximais e distais.Para a coleta de conteúdo intestinal de cada seção, faça uma única incisão na extremidade distal e, em seguida, expela manualmente o conteúdo intestinal em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com fórceps. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius para ensaios ex vivo. Traço uma nova cultura de C.albicans SC5314 em uma placa de ágar YPD e incuba-lo durante a noite a 30 graus Celsius.No dia seguinte, escolha duas ou três colônias individuais de médio porte e resuspensá-las em um mililitro de PBS. Recupere o conteúdo do intestino congelado do congelador e descongele-os a 25 graus Celsius. Transfira aproximadamente 150 miligramas de conteúdo intestinal em um novo tubo de 1,5 mililitro e resuspensá-los com 150 microliters de PBS.Vórtice a amostra em alta velocidade por 30 segundos para homogeneizar o conteúdo intestinal e permitir que ele fique em temperatura ambiente por cerca de um minuto. Centrifugar os homogeneiza a 1.000 vezes G por três minutos, depois transfira o supernasce para um novo tubo de 1,5 mililitro, tomando o cuidado de não transferir nenhum detrito. Depois de repetir a centrifugação, adicione 10 microlitadores do inóculo c.albicans ao supernacante, misture bem e incubar a amostra a 37 graus Celsius por quatro a cinco horas.Para testar o efeito de metabólitos exógenos em C.albicans, adicione a concentração desejada de metabólitos ao conteúdo intestinal e mistura de PBS, em seguida, vórtice da amostra em alta velocidade por 30 segundos, deixe-a sentar-se à temperatura ambiente por 10 minutos, e realizar centrifugação e inoculação como descrito anteriormente. Centrifugar a cultura das células fúngicas a 1.000 vezes G por dois minutos e descartar o supernante. Fixar as amostras em 100 microliters de 2%PFA por 15 minutos, depois repita a centrifugação e descarte o supernatante.Lave as amostras duas vezes com um mililitro de PBS de acordo com as instruções do manuscrito, em seguida, incubar as amostras à temperatura ambiente em 100 microliters de PBS com anticorpo policclonal C.albicans por 30 minutos. Após a incubação, lave a amostra mais três vezes com PBS, trabalhando em luz fraca para evitar fotobleaching. Em uma sala escura, incubar as amostras em temperatura ambiente por 15 minutos em 100 microliters de PBS contendo anticorpos IgG Alexa Fluor 488 anti-coelho em uma diluição de um a 500.Depois de lavar a amostra três vezes com um mililitro de PBS, resuspensá-la em 100 microliters de PBS e transferi-la para uma placa de 96 poços para imagem. Imagem das células fúngicas com um microscópio de imagem de fluorescência usando lentes objetivas 20X e 40X e um filtro de proteína fluorescente verde. Quando os c.albicans são cultivados ex vivo em extratos homogeneados intestinais retirados do estômago, intestinos delgados e intestinos grandes de controle não tratado e camundongos tratados com antibióticos, ele geralmente se desenvolve com uma morfologia de levedura.No entanto, quando cultivados no extrato cecal de camundongos tratados com antibióticos, os c.albicans prontamente sofrem morfogênese resultando em formas de levedura e hifa. Isso indica que o tratamento com antibióticos causa alterações no ambiente cecal, que induzem morfogênese hifalina de C.Albicans. A adição exógena de glicose ao homogeneado cecal de camundongos tratados com antibióticos mostrou um desenvolvimento hisfálico maciço ex vivo.Esses resultados sugerem que a adição de metabólitos intestinais de volta ao cecal homogenate dos camundongos tratados com antibióticos regula diferencialmente a morfogênese dos c.albicanos. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que a otimização da diluição do conteúdo intestinal garante coleta suficiente de metabólitos intestinais sem coleta de detritos. Não exceda uma diluição de conteúdo de mídia para intestino de dois para um e almejar uma diluição menor, se possível.Esta técnica está sendo usada agora para explorar como metabólitos específicos no desenvolvimento do hyphal de impacto intestinal, permitindo que os pesquisadores compreendam melhor o papel dos metabólitos intestinais na patogênese fúngica.

an-ex-vivo-assay-to-study-candida-albicans-hyphal-morphogenesis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Candida albicans Formação de biofilme em um modelo de camundongo in vivo

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Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

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Estabelecimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudar o comportamento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Em humanos THP-1 macrófagos

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