Eletroretinograma acoplado direto (DC-ERG) para gravar as respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento de retina do rato

A técnica DC-ERG pode ser utilizada para a avaliação não evasiva da função de epitélio do pigmento da retina para monitorar alterações relacionadas à idade ou progressão da doença e para avaliar os efeitos da intervenção farmacológica. Esta técnica melhora a capacidade de reprodução dc-ERG e a facilidade de uso simplificando a preparação do eletrodo capilar. Ele também pode ser complementado com um aplicativo de software ohm padrão para facilitar a análise.

Comece deslizando cuidadosamente uma agulha de seringa de calibre 25 através da junta de borracha de silicone para a parede traseira do suporte do eletrodo. Encha a base do suporte do eletrodo com HBSS desgaseado enquanto retraia lentamente a agulha, tomando cuidado para não introduzir bolhas e substitua a tampa roscada sem apertar. Reinsera a agulha de seringa para preencher o espaço vazio dentro da lacuna com HBSS e segure o capilar horizontalmente enquanto encha para evitar que a solução escape da outra extremidade.

Agarrando o capilar preenchido na extremidade dobrada, insira lentamente a outra extremidade através da tampa solta e aperte a tampa do parafuso no lugar. Incline os suportes de eletrodos com os eletrodos capilares voltados para cima para permitir que quaisquer bolhas fluam e desgas os capilares em uma câmara de vácuo por cinco a 10 minutos. Em seguida, solte lentamente o vácuo e recarregue os porta-eletrodos e capilares de vidro, como demonstrado.

Para fazer uma posição personalizada para o suporte de microeletrodos, remova os clipes poliacetais pretos de um lado de um t-clip número oito e use uma base de cilindro com juntas de esfera magnética usinadas ao meio para ajustar a altura. Fixar os clipes T modificados nos parafusos de montagem da esfera magnética com porcas do tamanho M3 e um slide em uma alça de madeira afilada de aproximadamente uma polegada, modificada a partir de uma vara de limpeza de ponta de algodão, no suporte em um ângulo para fixar o suporte de microeletrodes no suporte de esfera magnética de clipe T personalizado. Em seguida, use a base do cilindro de ímãs de terras raras para posicionar com segurança o suporte de eletrodo personalizado sobre a placa metálica do palco, permitindo uma rotação de 360 graus em um eixo de 180 graus.

Para realizar um teste de eletrodo, primeiro, abaixe suavemente os microeletrodos capilares totalmente montados do HBSS em um pequeno recipiente de HBSS. Coloque o eletrodo moído da agulha e o eletrodo de referência de pelotas centrada em cloreto prateado no mesmo HBSS para completar o circuito e selecione ou crie um identificador apropriado para descrever o mouse a ser testado. Para selecionar o protocolo de eletroretinograma acoplado direto a ser executado, clique em protocolos e selecione DC-ERG.

Clique em executar. Uma caixa de diálogo aparecerá com as informações do paciente. Se a informação estiver correta, clique em sim e proceda para a etapa um dos seis.

Feche as portas da gaiola de Faraday e clique em impedância para exibir o modo de impedância. Verifique se os valores para a referência da boca, o solo da cauda e os eletrodos de gravação são aceitáveis e clique na etapa para prosseguir para a etapa quatro de seis para testar a estabilidade da linha de base. Para começar a visualizar os traços, clique em visualização.

Os traços devem ser de baixo ruído com uma amplitude de pico a pico de menos de 200 microvolts. Para posicionar o camundongo e os eletrodos para um experimento, anestesiar a córnea de um rato sedado com uma gota de ácido clorídrico de 5% de proparacaina antes de dilatar a córnea com uma queda de 2,5% de fenilefrina HCL e 5% de tropamida. No software do sistema ERG, verifique se o paciente correto está selecionado.

Clique nos protocolos. Na descrição do protocolo, selecione DC-ERG e clique em executar. Clique em sim para verificar se o teste correto está sendo realizado.

Use o passo um de seis para acender uma luz vermelha fraca dentro da cúpula e coloque o mouse em uma mesa de gravação aquecida. Use fórceps para cuidadosamente tenda a pele da perna traseira. E usando uma mão para segurar firmemente o eletrodo da agulha, use a outra mão para inserir o eletrodo subcutâneamente na perna traseira para fixar o eletrodo no lugar.

Coloque o eletrodo de prata e cloreto de prata na boca do animal para que a pelota centrada repouse ao longo da bochecha traseira e fique no lugar atrás dos dentes. Antes de colocar os eletrodos capilares no olho, posicione o suporte do eletrodo com os capilares de vidro orientados verticalmente e aperte o suporte do eletrodo com um dedo indicador para remover quaisquer bolhas que possam ter sido introduzidas. Use uma agulha de calibre 25 para encher as pontas capilares com HBSS e inspecione os capilares para garantir que não haja bolhas de ar presas nas pontas.

Posicione o suporte do porta-eletrodos para que as pontas abertas dos capilares cheios de HBSS estejam em contato suave com a córnea. E tomando o cuidado de evitar a introdução de bolhas, inverta o distribuidor de gel de olho lubrificante para descartar as gotas iniciais. Em seguida, coloque uma gota de gel lubrificante em cada olho para manter a condutividade e evitar a dessecação durante a gravação.

Para gravar os DC-ERGs, clique em passo para selecionar o passo cinco de seis e clique em impedância para usar a tela de verificação de impedância para examinar as resistências dos olhos esquerdo e direito. Os valores de impedância para os eletrodos de gravação em cada olho devem ser semelhantes. E os valores de impedância tanto para os eletrodos de terra quanto para referência devem ser inferiores a 10 kilohms.

Clique na visualização para ver os traços dos olhos esquerdo e direito e espere até 10 minutos para que uma linha de base estável seja alcançada. Em seguida, clique em parar para sair da visualização do rastreamento e clique em executar para iniciar a gravação. Aqui, um conjunto de dados de amostra de nocaute condicional e ratos do tipo selvagem é mostrado.

Nesta análise, o traço sofria de bolhas minúsculas no eletrodo. Aumentou o ruído de pico ao pico no rastreamento. Em uma análise separada, as bolhas foram eliminadas utilizando-se a câmara de vácuo antes da montagem dos microeletrodos dentro das arquibancadas do porta-eletrodos.

As linhas mais adequadas para os 25 segundos iniciais podem ser calculadas, permitindo que as respostas corrigidas à deriva sejam replotadas e as amplitudes dos componentes DC-ERG sejam identificadas. Como esperado, a expressão reduzida de cura 7,1 canais de potássio no RPE atenua muito a onda c e a oscilação rápida, indicando um prejuízo significativo das propriedades elétricas do pigmento da retina. Aqui, as amplitudes relativas dos componentes DC-ERG, normalizadas para tipo selvagem e plotadas contra as duas maiores amplitudes de onda evocadas por luz, são mostradas.

Esta forma de análise pode determinar se as respostas elétricas reduzidas do RPE podem ser contabilizadas apenas pela redução da atividade fotorreceptora. Ou se há um defeito subjacente que se origina no RPE. Lembre-se de alcançar uma linha de base estável antes de passar para a gravação do mouse e para reinspecionar os eletrodos periodicamente para bolhas que podem ter sido introduzidas.

ERGs adaptados à escuridão podem ser registrados antes do DC-ERG para medir a função de retina orientada pelo cone. ERGs adaptados à luz também podem ser realizados após o DC-ERG para avaliar as respostas de retina orientadas por cone.