Name: Um modelo de xenoenxerto derivado do paciente para malformação venosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprenda a criar um modelo de xenoenxerto murino de malformação venosa usando células endoteliais derivadas de pacientes. Este método permite monitoramento diário do crescimento celular e testes terapêuticos pré-clínicos.

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Os autores gostariam de agradecer a Nora Lakes pela revisão. A pesquisa relatada neste manuscrito foi apoiada pelo National Heart, Lung, and Blood Institute, sob o Prêmio Número R01 HL117952 (E.B.), parte dos Institutos Nacionais de Saúde. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesses para divulgar.

Aqui, descrevemos um método para gerar um modelo de xenoenxerto derivado do paciente de VM. Este modelo murino apresenta um excelente sistema que permite aos pesquisadores obter uma compreensão mais profunda do alargamento patológico do lúmen e será fundamental no desenvolvimento de terapias mais eficazes e direcionadas para o tratamento de VM. Isso pode ser facilmente adaptado para investigar outros tipos de anomalias vasculares, como a malformação venosa linfática capilar16. Existem várias etapa...

Defeitos no desenvolvimento da vasculatura são a causa básica de muitas doenças, incluindo a malformação venosa (VM). VM é uma doença congênita caracterizada por morfogênese anormal e expansão das veias1. Estudos importantes sobre tecido VM e células endoteliais (CE) identificaram mutações de ganho de função em dois genes: TEK, que codifica o receptor de quinase tiesina TIE2, e PIK3CA, que codifica o isóforme p110α (subunidade catalítica) de PI3-kinase (PI3K)2,3,,4,5. Essas mutações somáticas resultam em hiperativação independente de ligante das principais vias de sinalização angiogênica/de crescimento, incluindo PI3K/AKT, resultando assim em veias ectáticas dilatadas3. Apesar dessas importantes descobertas genéticas, os mecanismos celulares e moleculares subsequentes que desencadeiam angiogênese anormal e a formação de canais vasculares ampliados ainda não são totalmente compreendidos.
Durante a angiogênese normal e patológica, novos vasos brotam de uma rede vascular pré-existente e a CE passa por uma sequência de processos celulares importantes, incluindo proliferação, migração, remodelação de matriz extracelular (ECM) e formação de lúmen6. Culturas in vitro in vitro de duas e tridimensionais (2D/3D) da CE são ferramentas importantes para investigar cada uma dessas propriedades celulares individualmente. No entanto, há uma clara demanda por um modelo de mouse recapitulando o alargamento de vasos patológicos dentro do microambiente hospedeiro, ao mesmo tempo em que fornece uma plataforma eficiente para avaliação pré-clínica de medicamentos direcionados para pesquisa translacional.
Até o momento, não foi relatado um modelo de murina transgênica de VM associado às mutações de ganho de função TIE2. Os modelos atuais de camundongos VM transgênicos dependem da expressão onipresente ou restrita ao tecido da mutação ativante PIK3CA p.H1047R3,5. Esses animais transgênicos fornecem uma visão significativa sobre efeitos específicos do corpo inteiro ou tecido desta mutação PIK3CA hotspot. A limitação desses modelos é a formação de uma rede vascular altamente patológica resultando em letalidade precoce. Assim, esses modelos de camundongos não refletem totalmente a ocorrência esporádica de eventos mutacionais e a natureza localizada da patologia VM.
Pelo contrário, os modelos de xenoenxerto derivados do paciente baseiam-se no transplante ou injeção de tecido patológico ou células derivadas de pacientes em camundongos imunodeficientes7. Os modelos de xenoenxerto são uma poderosa ferramenta para ampliar o conhecimento sobre o desenvolvimento de doenças e a descoberta de novos agentes terapêuticos8. Além disso, o uso de células derivadas do paciente permite que os cientistas recapitulem a heterogeneidade da mutação para estudar o espectro de fenótipos do paciente.
Aqui, descrevemos um protocolo onde vm ec derivados do paciente que expressam uma forma mutante constitutivamente ativa de TIE2 e/ou PIK3CA são injetados subcutâneamente na parte de trás de ratos nus atímicos. As células vasculares injetadas estão suspensas em uma estrutura de ECM, a fim de promover a angiogênese, conforme descrito nos modelos anteriores de xenoenxerto vascular9,,10,,11. Estes VM EC sofrem morfogênese significativa e geram vasos patológicos ampliados e perfundidos na ausência de células de suporte. O modelo de xenoenxerto descrito de VM fornece uma plataforma eficiente para avaliação pré-clínica de medicamentos direcionados para sua capacidade de inibir a expansão de lúmen descontrolada.

<table><tbody><tr><td>Camundongos nus atímicos, (Foxn1-nu); 5-6 semanas, machos</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td>Injeção subcutânea</td></tr><tr><td>Biotinilada Ulex europeaus Aglutinina-I (UEA-I)</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1065</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>Filtro superior do frasco (500 ml; 0,2 &micro; M)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>974106</td><td>Cultura</td></tr> de células <tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>BSA</td><td>A7906-50MG</td><td>Cultura de células; Análise histológica</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2.2H2O)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>Paquímetro de cultura de células</td></tr><tr><td></td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>50996491</td><td>Medição do plugue de lesão</td></tr><tr><td>Grânulos magnéticos conjugados com CD31 (Dynabeads)</td><td>Life Technologies</td><td>11155D</td><td>Separação EC</td></tr><tr><td>Filtro de células (100 &mu; M)</td> <td>Greiner</td><td>542000</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Colagenase A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td> Tubo cônico <td>de cultura de células</td></tr><tr><td>; polipropileno (15 mL)</td> <td>Greiner</td><td>07 000 241</td> Tubo cônico <td>de cultura de células</td></tr><tr><td>; polipropileno (50 mL)</td> <td>Greiner</td><td>07 000 239</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de coloração de Coplin</td> de cultura de células <td>Ted Pella</td><td>21029</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>Lamínula (50 X 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545E</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>DAB: 3,3'Reagente de diaminobenzidina (ImmPACT DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>Modificação de Dulbecco do Meio de Eagle (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-027-CV</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Separação EC</td></tr><tr><td>Punção de orelha</td><td>VWR</td><td>10806-286</td><td>Injeção subcutânea</td></tr><tr><td>EDTA (0,5M, pH 8,0)</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>Meio de crescimento de células endoteliais-2 (EGM2) Bulletkit (meio basal e suplementos)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Eosina Y (à base de álcool)</td><td>Thermo Scientific</td><td>71211</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30910.03</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Filter tip 1,250 &mu; L</td><td>MidSci</td><td>AV1250-H</td><td>Múltiplas etapas</td></tr><tr><td>Ponta do filtro 20 &mu; L</td><td>VWR</td><td>10017-064</td><td>Múltiplos passos</td></tr><tr><td>Ponta do filtro 200 &mu; L</td><td>VWR</td><td>10017-068</td><td>Etapas múltiplas</td></tr><tr><td>Solução tamponada com formalina (10%)</td><td>Sigma</td><td>F04586</td><td>Dissecção do tampão da lesão</td></tr><tr><td>Hemacitômetro (INCYTO; Descartável)</td><td>SKC FILMS</td><td>DHCN015</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Vetor de hematoxilina</td><td>Hematoxilina</td><td>H-3401</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>Proteína purificada de fibronectina plasmática humana (1mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio para cultura celular (30% p/p)</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> <td>ImageJAnálise</td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Akorn Saúde Animal</td><td>59399-106-01</td><td>Injeção subcutânea</td></tr><tr><td>sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td>Matriz</td></tr> de <tr><td>membrana basal de cultura celular (sem fenol vermelho; Tubo</td> de microcentrífuga de injeção <td>subcutânea</td><td>de 356237</td> <td>Corning</td></tr><tr><td>(1,5 mL)</td><td>VWR</td><td>87003-294</td> Lâmina de microscópio <td>de separação EC</td></tr><tr><td>Superfrost (75mm X 25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1255015-CS</td><td>Agulhas de análise histológica</td></tr><tr><td>, 26G x 5/8 polegadas Agulhas estéreis Sub-Q</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD305115</td><td>Injeção subcutânea</td></tr><tr><td>Normal soro de cavalo</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-2000</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-L-Glutamina (100X)</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Meio de montagem permanente (VectaMount)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>Pilão Tamanho C, Simples</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431F55</td><td>EC isolamento</td></tr><tr><td>Tamponado com fosfato Solução salina (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>Escala de cultura de células</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>Injeção subcutânea</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (10 ml)</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>Pipetas</td></tr><tr><td>serológicas de cultura celular (5ml)</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Carbonato de sódio (Na2CO3)</td><td>Sigma</td><td>223530</td><td>Cultura</td></tr> <tr><td>de célulasEstreptavidin, Peroxidase de Rábano, Concentrado, para IHC</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-5004</td><td>Seringa de Cultura de Células</td></tr><tr><td>(60ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td>Filtro</td></tr> de <tr><td>Seringa de Cultura de Células (0.2 &micro; M)</td><td>Corning</td><td>431219</td><td>Seringas de cultura de células</td></tr><tr><td>(1 mL com Luer Lock)</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD-309628</td><td>Injeção subcutânea</td></tr><tr><td>Placa tratada com cultura de tecidos (100 X 20 mm)</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>Placa</td></tr><tr><td>tratada com cultura de tecidos (145X20 mm)</td><td>Greiner</td><td>639160</td><td>Placas</td></tr><tr><td>tratadas com cultura de tecidos (60 X 15) mm</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Tris-base (base Trizma)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA, 1X (0,05% Tripsina/0,53mM EDTA)</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Biorad</td><td>170-6531</td><td>Análise histológica</td></tr><tr><td>Frasco Wheaton</td><td>VWR</td><td>16159-798</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>Análise histológica</td></tr></tbody></table>

um modelo de xenoenxerto derivado do paciente para malformação venosa

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

A malformação venosa (VM) é uma anomalia vascular que surge do desenvolvimento prejudicado da rede venosa resultando em veias dilatadas e muitas vezes disfuncionais. O objetivo deste artigo é descrever cuidadosamente o estabelecimento de um modelo de xenoenxerto murina que imita vm humano e é capaz de refletir a heterogeneidade do paciente. Mutações não herdadas (somáticas) TEK (TIE2) e PIK3CA hiperativas em células endoteliais (CE) foram identificadas como os principais condutores do alargamento de vasos patológicos em VM. O protocolo a seguir descreve o isolamento, purificação e expansão da CE derivada do paciente expressando tie2 mutante e/ou PIK3CA. Estes CE são injetados subcutâneamente na parte de trás de camundongos atímicos imunodeficientes para gerar canais vasculares ectáticos. As lesões geradas com TIE2 ou PIK3CA-mutante EC são visivelmente vascularizadas dentro de 7\u20129 dias após a injeção e recapitulam características histopatológicas do tecido do paciente VM. Este modelo de xenergrafto VM fornece uma plataforma confiável para investigar os mecanismos celulares e moleculares que impulsionam a formação e expansão de VM. Além disso, este modelo será fundamental para estudos translacionais que testam a eficácia de novos candidatos a medicamentos na prevenção do alargamento anormal de vasos vistos em VM humano.

Este protocolo descreve o processo de geração de um modelo de xenoenxerto de murina de VM baseado na injeção subcutânea de CE derivada do paciente na parte de trás de camundongos nus imunodeficientes. Colônias de células endoteliais podem ser colhidas dentro de 4 semanas após o isolamento celular inicial do tecido VM ou sangue lesão(Figura 1A,B). No dia seguinte à injeção, o plugue da lesão de xenoenxerto cobre uma área de superfície de aproximadamente 80\u2012100 mm2. Em nossas mãos, os plugu...

Apresentamos um protocolo detalhado para gerar um modelo de xenoenxerto murine de malformação venosa. Este modelo é baseado na injeção subcutânea de células endoteliais derivadas do paciente contendo mutações genéticas TIE2 e/ou PIK3CA hiperativantes. As lesões de xenoenxerto recapitulam de perto as características histopatológicas do tecido do paciente VM.

Um modelo de xenoenxerto derivado do paciente para malformação venosa

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Este protocolo pode ser usado para criar xenoenxertos derivados do paciente que recapitulam a histopatologia de malformações venosas. Isso foi ainda permitido para realizar nossos testes terapêuticos pré-clínicos. Esta técnica fornece um sistema NVivo rápido e confiável que permite o monitoramento diário do crescimento das células endoteliais diretas do paciente e a resposta à terapia experimental.Este método poderia ser facilmente adaptado para investigar outros tipos de anomalias vasculares ou linfáticas. Comece preparando a suspensão celular para injeção. Trypsinize as células endoteliais com cinco mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA a 37 graus Celsius por dois minutos.Neutralize a tripsina e adicionando cinco mililitros de EGM e colete as células em tubo cônico de 150 mililitros. Centrifuá-lo a 400 vezes G por cinco minutos, em seguida, aspirar o supernaspe e resuspensar as células em três mililitros de EGM. Conte as células com um hemócito.Aventure o volume com o número celular desejado em um novo tubo cônico de 50 mililitros e pelota as células novamente por centrifugação. Aspire o supernasce deixando um pequeno volume para soltar a pelota celular. Resuspend a pelota celular com 220 microliters de BMEM por injeção.Misture bem a suspensão celular no gelo, certificando-se de evitar a criação de bolhas. Aspire a cultura celular BMEM em uma abertura de seringa de um mililitro puxando o êmbolo. Você vai travar uma agulha estéril calibre 26 na seringa e manter as seringas preparadas planas no gelo antes da injeção.Depois de garantir que o rato tenha anestesiado corretamente coloque-o em seu estômago e desinfete a região de injeção com 70% de etanol. Role suavemente a seringa preparada para resususpensar quaisquer células assentadas. Bolhas de flocos até o fim da seringa e expulsam um pequeno volume da suspensão celular.Aperte a pele no local da injeção para criar uma tenda como estrutura. Em seguida, insira a agulha bem debaixo da pele e certifique-se de que a agulha é apenas profunda da pele liberando a pele de beliscão para evitar a injeção no tecido muscular. Segurando a agulha injete cuidadosamente 200 microliters da suspensão celular para criar uma pequena massa esférica.Tome cuidado para evitar injetar a suspensão celular no músculo. Meça o comprimento e a largura de cada plugue com uma pinça. Alinhe os plugues de xenoenxerto dissecados em uma placa de corte ao lado de uma régua e tire uma imagem para registrar a vascularização bruta das lesões.Em seguida, fixar os plugues submergindo-os em 10% de formalina durante a noite à temperatura ambiente. Após a dissecção, os plugues da lesão são processados para análise histológica e manchados para a UEA-1 detectar células endoteliais derivadas humanas dentro do plugue. Pegue cinco imagens de HPF por seção de lesão com um microscópio de campo brilhante a 20 X de ampliação em um padrão de plano X dentro da seção de lesão para evitar sobreposição.Certifique-se de incluir uma barra de escala nas imagens tiradas. Abra as imagens do HPF na imagem J.To calibrar os pixels da barra de escala, usar a ferramenta em linha reta e passar por cima da barra de escala. Em seguida, converta os pixels medidos em milímetros clicando em Analisar e Definir escala.Clique em Analisar medidas de conjunto e selecione área e adicione à sobreposição. Meça a área total de campo do HPF utilizando analisar e medir a economia desta medição para quantificação. Utilizando a ferramenta de seleções manuais gratuitas delineia manualmente o canal vascular positivo UEA-1.Clique em Analisar e Medir para quantificar a área delineada. Meça todos os canais vasculares dentro do HPF. Repita o processo para os cinco HPF tomados dentro de cada seção e transfira os valores para o Excel para análise posterior.Em seguida, calcule a porcentagem de área vascular e densidade vascular de acordo com as instruções do manuscrito. Usando este protocolo, os plugues de lesão com células endoteliais hiperativas TIE2 ou PIK3CA são visivelmente vascularizadas e perfundidas dentro de sete a nove dias após a injeção. Os plugues de lesão se assemelham muito às características histopatológicas do tecido VM humano e grandes canais vasculares alinhados por uma fina camada de células endoteliais são visíveis.Essas estruturas vasculares normalmente contêm eritrócitos confirmando anastomose funcional com a vasculatura do rato hospedeiro. A coloração imunohistoquímica usando a lectina específica humana UEA-1 confirma que as células que revestem regiões vasculares são derivadas de células implantadas humanas em vez da vasculatura do rato. Após este procedimento, pode ser realizada uma coloração adicional de seções de lesões para marcadores de proliferação ou apoptose para analisar efeitos específicos de tratamentos experimentais.Este modelo cenográfico tem sido usado para estudos pré-clínicos de novas terapias para malformação venosa, como o inibidor mTOR rapamicina, que tem mostrado eficácia em vários ensaios clínicos para pacientes com VM.

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A vascularização é essencial para abordagens de engenharia de tecidos bem sucedida. Portanto, tecnologias confiáveis ​​são necessários para avaliar o desenvolvimento de redes vasculares em tecido construções. Aqui apresentamos um método simples e de baixo custo para visualizar e quantificar a vascularização in vivo.

A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais<em&gt; In Vivo</em

Para melhorar o nosso conhecimento da formação neotissue celular e molecular, um modelo murino da TEVG foi recentemente desenvolvida. Os enxertos foram implantados como infra-enxertos na veia cava de interposição em camundongos C57BL / 6. Este modelo consegue resultados semelhantes aos obtidos em nossa investigação clínica, mas ao longo de um curso de tempo muito reduzido.

Implantação de Veia Cava Inferior interposição de enxerto no Rato Modelo

Descrevemos uma abordagem microcirúrgico para a geração de um circuito arteriovenoso (AV) como um modelo para analisar a vascularização in vivo num ambiente isolado e bem caracterizado. Este modelo não só é útil para a investigação de angiogênese, mas também é perfeitamente adaptado para a engenharia axial vascularizado e tecidos transplantáveis.

The Loop arteriovenosa (AV) em um modelo animal pequeno para estudar angiogénese e Engenharia de tecido vascularizado

Este vídeo demonstra um modelo para estudar o desenvolvimento de hiperplasia miointimal após cirurgia de interposição venosa em ratos.

Veia Interposição Modelo: Um modelo adequado para estudar Bypass Graft Perviedade

Os modelos paciente-derivados do xenograft (PDX) mais robustamente recapitular características moleculares e biológicas da melanoma e são mais preditivos da resposta da terapia comparada aos ensaios cultura-baseados tradicionais do tecido plástico. Aqui nós descrevemos nosso protocolo de funcionamento padrão para o estabelecimento de modelos novos de PDX e a caracterização/experimentação de modelos existentes de PDX.

Um modelo de Xenoenxerto derivado do paciente com melanoma

Uma fístula aortocaval foi criada puncionando a aorta infra-renal murino através de ambas as paredes na veia inferior oca e foi seguida pela criação de um stenosis em seu saída através da ligadura parcial da veia inferior oca. Este modelo reprodutível pode ser usado para estudar a estenose venosa central.

Modelo murino de estenose venosa central usando fístula Aortocaval com estenose de saída

O presente protocolo visa criar experimentalmente hiperplasia intimal venosa submetendo veias à pressão arterial arterial para o desenvolvimento de estratégias para atenuar a hiperplasia intimal venosa após cirurgia de revascularização usando enxertos venosos.

Um modelo de interposição venosa de coelho imitando cirurgia de revascularização usando enxertos de veia para avaliar hiperplasia intimal sob pressão arterial

Descrevemos um modelo de metástase cerebral de câncer de mama em camundongos xenoenxerto gerada por injeção na veia caudal de uma linhagem de células inflamatórias de câncer de mama amplificadas endogenamente por HER2.

Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

Neste protocolo, a nova cirurgia de revascularização do miocárdio foi realizada através de uma pequena incisão na parede torácica esquerda, sem circulação extracorpórea. Foi realizado um estudo anatomopatológico pós-operatório, que mostrou espessamento intimal.

Estabelecimento e Avaliação de um Modelo de Enxerto de Veia Suína

Aprenda a criar um modelo de xenoenxerto murino de malformação venosa usando células endoteliais derivadas de pacientes. Este método permite monitoramento diário do crescimento celular e testes terapêuticos pré-clínicos.

Um modelo de xenoenxerto derivado do paciente para malformação venosa

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