Name: Obtenção de osteócitos primários através do fracionamento em calvária murina de osteócitos que expressam GFP (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Aprenda a isolar osteócitos primários expressando GFP de calvárias de camundongos transgênicos dmp1-topaz usando FACS. Este protocolo reduz o tempo de manipulação e aumenta o rendimento celular para estudos de biologia óssea.

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Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa JSPS KAKENHI da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (No. 19K10397 para H.K. e No. 18K09862 para I.M.).

Todos os procedimentos e cuidados com os animais foram realizados de acordo com as normas e regulamentos da Universidade de Tohoku.
1. Dissecção da calvária de camundongos dmp1-topázio recém-nascidos
<ol><li>Para este protocolo, use filhotes de 6\u20127 dias de idade de camundongos C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Eutanasiar camundongos com inalação de isoflurano a 5% e, em seguida, transferir os filhotes para etanol 70%.</li>
	<li>Transfira o filhote eutanasiado para uma placa de cultura não tratada.</li>
	<li>Usando tesoura e pinça, pegue a pele na base do crânio e faça uma incisão.</li>
	<li>Usando a primeira incisão como ponto de partida, corte em ambos os lados laterais do crânio na frente das orelhas, remova a pele e exponha a calvária.</li>
	<li>Segure a cabeça a partir da ponte nasal e corte a calvária ao longo da sutura lambdoide. Cortar ao longo das bordas laterais dos ossos parietais e estendê-lo para incluir a parte frontal.</li>
	<li>Separe a calvária do tecido cerebral subjacente. NOTA: Para garantir uma calvária óssea limpa com mínima fixação de tecidos moles, não corte profundamente no osso; Para referência, deve-se ser capaz de ver a sombra da tesoura sob o osso.</li>
	<li>Transferir a calvária para solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4 durante todo o protocolo). Certifique-se de que a parte côncava está voltada para cima.</li>
</ol>2. Fracionamento da calvária de camundongos recém-nascidos
<ol><li>Transferir até 5 calvárias para um tubo cônico de 50 mL contendo 5 mL de solução de colagenase 2 mg/mL. Use solução de colagenase fresca preparada imediatamente antes do uso.<ol><li>Para preparar uma solução fresca de colagenase, adicione colagenase em pó ao tampão de isolamento (NaCl 70 mM, NaHCO3 10 mM, sorbitol 60 mM, 3 mM K 2 HPO4, CaCl2 mM, 1 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA), 5 mg/mL de glicose e 25 mM HEPES) a2mg/mL. Dissolva o pó de colagenase em um agitador magnético.</li>
		<li>Passar a solução de colagenase através de uma unidade filtrante estéril de 0,22 μm para um tubo de 50 mL e mantê-la congelada durante todo o protocolo.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar a calvária a 37 °C durante 20 min num agitador a 300 rpm para obter a fracção 1.</li>
	<li>Descarte o digesto da fração 1, lave a calvária com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e descarte a lavagem.</li>
	<li>Incubar a calvária em 5 ml de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 5 mM contendo 1 mg/ml de BSA em PBS, PH 7,4 a 37 °C durante 15 minutos num agitador a 300 rpm.</li>
	<li>Coletar o digesto em um tubo cônico de 50 mL. Lave a calvária com 5 mL de PBS e adicione a solução de lavagem ao digerimento. NOTA: Em cada ponto de coleta do digesto e lavagem, pipetar os ossos em sua solução para desprender as células do osso e evitar duplicações e agregados celulares.</li>
	<li>Para obter a fração 2, centrifugar o digestor a 300 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 8 mL de Meio Essencial α-Mínimo (MEM) contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), 100 UI/mL de penicilina G e 100 μg/mL de estreptomicina. Semear em uma placa de cultura de 10 cm. Incubar a fracção 2 a 37 °C a 5% de CO2.</li>
	<li>Incubar a calvária em 5 ml de solução de colagenase a 37 °C durante 20 minutos num agitador a 300 rpm.</li>
	<li>Para coletar a fração 3, repita as etapas 2.5\u20122.6. Incubar a fracção 3 a 37 °C a 5% de CO2. NOTA: Neste ponto, os ossos se tornarão menores, e eles serão reduzidos a fragmentos. Para garantir que nenhum osso seja acidentalmente aspirado para os digestores, o que leva à perda de células no processo, use uma pipeta de ponta pequena para coletar os digestores (pontas de pipeta de 1000 a 2000 μL).</li>
	<li>Incubar a calvária em 5 ml de solução de colagenase a 37 °C durante 20 minutos num agitador a 300 rpm.</li>
	<li>Para coletar a fração 4, repita as etapas 2.5\u20122.6. Incubar a fracção 4 a 37 °C a 5% de CO2.</li>
	<li>Incubar a calvária em 5 mL de EDTA 5 mM contendo 1 mg/mL de BSA em PBS (pH 7,4) a 37 °C por 15 min em um agitador a 300 rpm.</li>
	<li>Para coletar a fração 5, repita as etapas 2.5\u20122.6. Incubar a fracção 5 a 37 °C a 5% de CO2. Os osteócitos podem ser preparados para triagem no mesmo dia ou cultivados até 24 h antes da triagem.</li>
</ol>3. Preparação de osteócitos para triagem de células ativadas por fluorescência
<ol><li>Aspirar o meio de cada fração celular e lavar suavemente com 10 mL de PBS duas vezes.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de tripsina-EDTA a 0,5% em PBS e incubar as células por 5 min a 37 °C. Adicionar 5 mL de FBS a 10% α-MEM e pipetar para separar as células suavemente. Combinar as células de cada fracção peneirando um filtro de células de 40 μm num tubo de centrífuga cónica de 50 ml.</li>
	<li>Lavar as células com 10 mL de PBS e coletar peneirando através de um filtro de células de 40 μm em um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e adicionar 10% de FBS α-MEM ao pellet. Ajustar a concentração celular para aproximadamente 1 x 107 células/mL.</li>
	<li>Filtrar as células num tubo tampado com malha de nylon de 35 μm. As células já estão prontas para o FACS.</li>
	<li>Para este protocolo, utilizar um bico de 100 μm. O fluido de coleta deve consistir de 10% de SFB α-MEM. Manter a amostra separada por agitação e a 4 °C durante toda a triagem, se possível.</li>
	<li>Antes da classificação, otimize o fechamento para remover artefatos e células ajustando a área de dispersão lateral (SSC) e a área de dispersão direta (FSC). Elimine duplicações ajustando a largura do SSC vs altura do SSC e a área do FSC vs largura do FSC. Os osteócitos GFP-negativos devem ser usados como controle para ajustar os parâmetros do instrumento de classificação.</li>
	<li>Após a conclusão da coleta celular, centrifugar as células a 300 x g a 4 °C por 10 min. Lave as células com PBS. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Suspenda novamente as células e ajuste o número conforme desejado usando 10% FBS α-MEM.</li>
</ol>

<ol><li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+and+death+of+bone+cells%3A+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+osteovision%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li>
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<li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li>
<li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li>
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<li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line%2C+MLO-Y4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li>
<li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li>
<li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li>
<li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+%28TSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation%2C+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li>
<li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li>
<li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalleux%2C+C+%22Bone+Research+Protocols%22">Bone Research Protocols</a>. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).</li>
<li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedizinische+Technik+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O primeiro osteócito isolado foi de uma galinhacalvária 7 isolada usando (OB7.3) ou a variante aviante de PHEX; no entanto, este método é limitado pela disponibilidade de anticorpos viáveis, uma vez que anticorpos osteocito-específicos que também são espécie-específicos têm de ser fabricados. Os pesquisadores usaram uma modificação diferente do processo enzimático sequencial para obter osteócitos de ossos longos de camundongos e ratos; A pureza relatada dessas culturas foi fixada em cerca de 70%<s...

Os osteócitos são células terminalmente diferenciadas dos progenitores osteoblásticos que se incorporaram em sua matrizsecretada1. São as células mais abundantes e de vida mais longa entre as populações de células ósseas. Residem em lacunas e apresentam morfologia estrelada característica, com dendritos que se estendem através de canais denominados canalículos, formando uma extensa rede de comunicação e trocas metabólicas com o meio circundante e a superfícieóssea2. Os osteócitos coreografam tanto os osteoblastos quanto os osteoclastos na remodelação óssea, são as principais células mecanossensoriais que conferem adaptação à cargamecânica3, estão envolvidos na homeostase dofosfato4 e namineralização da matriz óssea5 e, juntamente com o sistema lacunocanalicular, atuam como órgão endócrino sinalizando tecidosdistantes6.
Os osteócitos situam-se dentro de uma matriz mineralizada, o que limita a acessibilidade e torna seu isolamento desafiador, dificultando a investigação in vitro. Um dos primeiros métodos de isolamento descreveu osteócitos isolados da calvária de galinha usando um anticorpo monoclonal específico para osteócitos (OB7.3)7 que mais tarde foi conhecido por ser a variante aviária do PHEX (PHosphate-regulating gene with homology to Endopeptidases on the X chromosome)8. Outros pesquisadores usaram a digestão sequencial de ossos longos de ratos 9 oucamundongos 10 para obter frações ricas em osteócitos nas quais a pureza dos osteócitos foi relatada em torno de 70%9. As limitações desse procedimento incluem a pureza sub-ótima de culturas contaminadas com outros tipos celulares além dos osteócitos e que osteócitos poderiam ser potencialmente supercultivados por outras células em cultura, uma vez que os osteócitos perderam a capacidade de se dividir. Esses desafios restringem a usabilidade de culturas de longo prazo.
Para superar essas limitações, diferentes linhagens celulares de osteócitos foram desenvolvidas. A linhagem celular MLO-Y411 e a linhagem celular MLO-A512 são notavelmente as linhagens celulares mais estudadas que são úteis para o estudo dos osteócitos em estágio inicial; entretanto, são menos úteis para estudar a sinalização de osteócitos maduros, pois expressam baixos níveis de esclerostina e FGF2313, ambos marcadores de osteócitos maduros. Outras linhagens celulares, incluindo IDG-SW3 14 e Ocy45415, expressam altos níveis de esclerostina e FGF23 e são úteis no estudo do estágio tardio dos osteócitos. As linhagens celulares mostram-se ferramentas úteis de pesquisa; No entanto, eles não vêm sem limitações, pois não representam totalmente a biologia da célula primária. Diferentes linhagens celulares representam diferentes estágios de desenvolvimento do espectro de maturidade dos osteócitos, e as linhagens celulares não conseguem representar a heterogeneidade dos osteócitosprimários16,17.
Para obter culturas puras de osteócitos primários, os pesquisadores aproveitaram o modelo de camundongo cre, no qual o promotor dmp1 de 8 kb é usado para conduzir a expressão da proteína fluorescente verde (GFP) em osteócitos18,19. Camundongos transgênicos duplos (pOB-Col 2.3- GFP-ciano e DMP1-GFP-topázio) de Paic et al.19 e camundongos transgênicos dmp1-topázio de Nakashima et al.20 têm sido utilizados para obtenção de populações de osteócitos. Em que empregaram digestão sequencial e FACS de osteócitos expressando GFP para aquisição de culturas de osteócitos primários19,20. A direção do cre no camundongo repórter dmp1 Ai9 de 10 kb, que ativa a proteína tdTomato, mostrou-se presente em osteócitos, osteoblastos, músculos e células dentro da medula óssea. O promotor dmp1 de 8 kb apresentou o mesmo padrão de expressão, mas apenas uma proporção de osteoblastos e células da medula óssea expressou a proteína, o que indica que o promotor dmp1 de 8 kb é maisespecífico21. Apesar disso, os resultados obtidos com o promotor dmp1 de 8 kb devem ser interpretados com cautela, e os perfis de expressão gênica devem ser realizados rotineiramente usando marcadores específicos de osteócitos versus osteoblastos para garantir que a população obtida seja de pureza alta o suficiente.
Os marcadores osteoclastos OSCAR e Dcstamp foram encontrados em populações de osteócitos hematopoéticos não depletados vs. depletos, este achado levou os autores a concluir que os digestores obtidos a partir do fracionamento da calvária neonatal de 8 kb dmp1-topázio e da classificação da GFP estão contaminados com células hematopoéticas. A contaminação com células hematopoéticas poderia ter sido atenuada apertando a comporta de classificação da GFP, uma vez que as células hematopoéticas positivas para GFP apresentaram uma intensidade de GFP razoavelmente menor do que as células mesenquimais positivas para GFP (osteócitos)22.
Os métodos de estudo in vitro dos osteócitos têm contribuído para a riqueza recente de informações sobre a biologia dos osteócitos. No entanto, o isolamento de osteócitos continua sendo um procedimento trabalhoso e demorado, com baixo rendimento celular. O método descrito de digestão óssea utilizando colagenase e EDTA, muitas vezes até a fração 823, leva várias horas em que a viabilidade dos osteócitos é taxada. Pesquisadores relataram o uso de frações (2\u20125) para triagem celular20 e mostraram que o perfil de expressão de genes associados a osteócitos versus osteoblastos confirma o sucesso do isolamento de populações de osteócitos puros20. Neste artigo, descrevemos o processo de obtenção das frações (2\u20125) e comparamos o rendimento dos osteócitos de cada fração a partir da fração 1 a 8 para determinar o retorno dos osteócitos em cada fração. Descrevemos também a dissecção da calvária de camundongos dmp1-topázio e a digestão da calvária usando colagenase e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), bem como a preparação de células para FACS.

<table><tbody><tr><td>BD FACSSude de dique</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Aquisição e análise de dados</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>Tubo de 12 x 75 mm com tampa de filtro de células, 35 &mu; M malha de nylon.</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, MO, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Wako, Osaka, Japão</td><td>034-22363</td><td>0,2% (p/v), mistura bruta de colagenase proveniente de C. histolyticum.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japão</td><td></td><td>5mM EDTA preparado com 0,1% BSA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, França</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de isolamento <td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0,1% (p/v) BSA, 0,5% (p/v) glicose e 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Unidade de filtro estéril Millex</td><td>Merck Millipore, Irlanda</td><td>SLGV033RS</td><td>0,22&mu; m</td></tr><tr><td>Filtro de células de nylon</td><td>FALCON, NY, EUA</td><td></td><td>40&mu; m</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies, NY, EUA</td><td></td><td>0,5% x10. diluído a x1 em PBS</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako, Osaka, Japão</td><td></td><td>Contendo 10% de soro fetal bovino, 100 UI/ml de penicilina G e 100 &mu; g/ml de estreptomicina</td></tr></tbody></table>

obtenção de osteócitos primários através do fracionamento em calvária murina de osteócitos que expressam gfp

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

O osteócito, antes considerado um residente passivo do osso, dada a função de bastidores de detectar a carga mecânica, agora é trazido à tona e tem sido demonstrado que tem múltiplas funções principais, como modificar ativamente a matriz extracelular e formar um órgão endócrino com o sistema lacunocanalicular que o encerra enviando mensagens para locais distantes. Devido aos métodos que tornaram possível testar o osteócito in vitro a partir do isolamento de osteócitos primários para linhagens celulares semelhantes a osteócitos, os osteócitos estão agora experimentando um interesse retumbante e uma onda de conhecimento sobre estrutura e função. Muitos aspectos da biologia dos osteócitos e da interação com outros componentes moleculares ainda precisam ser descobertos. Neste protocolo, descrevemos em detalhes o eficiente isolamento de osteócitos primários da calvária neonatal dmp1-topázio, que expressam a proteína verde fluorescente nos osteócitos, através do fracionamento celular e posterior aquisição de culturas de osteócitos primários por FACS.

O objetivo deste protocolo é demonstrar o processo de obtenção de culturas de osteócitos primários da calvária neonatal de camundongos dmp1-topázio através de um processo de fracionamento usando colagenase para degradar a matriz de colágeno e EDTA para quelação de cálcio, após o qual as células são preparadas para FACS para separar osteócitos de outras populações celulares.
Métodos para obtenção de osteócitos primários da calvária neonatal de camundongos frequentemente descrevem o uso de fraçõ...

Este protocolo descreve a dissecção neonatal da calvária de camundongos dmp1-topázio e o isolamento de osteócitos expressando a proteína verde fluorescente através da digestão e fracionamento celular, além da preparação de osteócitos para triagem celular ativada por fluorescência (FACS).

Obtenção de osteócitos primários através do fracionamento em calvária murina de osteócitos que expressam GFP

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

O isolamento primário de osteócitos é um procedimento demorado que muitas vezes deixa de fora áreas de células baixas. Este protocolo fornece métodos eficientes para isolar um grande número de osteócitos primários que expressam GFP. Este protocolo reduz o tempo de manipulação e permite obter um maior número de osteócitos em um único procedimento com o mínimo de contaminação por células hematopoiéticas ou mesenquimais.Para o isolamento de osteócitos que expressam GFP, coloque filhotes de camundongos transgênicos sacrificados, do sexto ao sétimo dia pós-natal, em uma placa de cultura não tratada e use tesouras e pinças para agarrar a pele na base do crânio. Use a tesoura para fazer uma incisão inicial na pele levantada, seguida de cortes ao longo de ambos os lados do crânio na frente das orelhas. Remova a pele para expor a calvária e segurando a cabeça da ponte nasal, corte a calvária ao longo da sutura lamboidal e ao longo das bordas dos ossos parietais até a parte frontal do tecido.Separe a calvária do tecido cerebral subjacente e coloque os ossos com o lado côncavo para cima em PBS. Para obter a fração um, agrupe até cinco calvárias por tubo de 50 mililitros em cinco mililitros de dois miligramas por mililitro de colagenase recém-preparada e incube os tecidos a 37 graus Celsius e 300 rotações por minuto por 20 minutos. No final da incubação, descarte o digesto da fração um e lave a calvária com cinco mililitros de PBS.Substitua a lavagem por cinco mililitros de EDTA de cinco milimolares suplementado com um miligrama por mililitro de albumina de soro bovino em PBS por 15 minutos a 37 graus Celsius com agitação. No final da incubação, transfira o digesto para um tubo cônico de 50 mililitros e lave a calveria com cinco mililitros de PBS. Em seguida, transfira a solução de lavagem para o digerente.Para obter a fração dois, colocar o digesto para centrifugação e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em oito mililitros de meio essencial mínimo alfa contendo 10% de soro bovino fetal, ou FBS, e antibióticos, e semeie as células em uma placa de cultura de 10 centímetros. Em seguida, coloque a fração de duas células na incubadora de cultura de células.Depois de coletar e cultivar as frações três e quatro, como acabamos de demonstrar. Incubar a calveria em cinco mililitros de EDTA de cinco milimolares suplementado com um miligrama por mililitro de albumina de soro bovino em PBS por 15 minutos a 37 graus Celsius com agitação. No final da incubação, coletar e cultivar a fração cinco, conforme demonstrado para as frações dois, três e quatro.Imediatamente após o fracionamento, colete as células para classificação. Alternativamente, colete as células após 24 horas de cultura aspirando o meio e lave suavemente as células duas vezes com 10 mililitros de PBS por prato por lavagem. Após a segunda lavagem, trate as células com cinco mililitros de 0,5% de tripsin EDTA em PBS por placa.Após cinco minutos a 37 graus Celsius, adicione cinco mililitros de meio essencial alfa mínimo completo a cada placa e retire suavemente as células com pipetagem. Para combinar as células em cada fração, filtre as suspensões celulares através de um filtro de células de 40 mícrons em um único tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros. Depois de lavar as células com 10 mililitros de PBS, adicione-as ao tubo.Filtre as células através de um filtro e colete as células por centrifugação. Uma vez que as células são peletizadas, ressuspenda o pellet em meio essencial mínimo completo para uma vez 10 elevado à sétima célula por mililitro de concentração média e filtre as células através de um tubo com tampa de malha de náilon de 35 mícrons. Para testar a eficiência desse método, as frações foram selecionadas separadamente e cultivadas por 24 horas para determinar a porcentagem e o rendimento de osteócitos de cada fração.A densidade dos osteócitos nas frações dois a cinco foi maior do que a observada para a fração um e diminuiu notavelmente nas frações seis, sete e oito. Embora a porcentagem de osteócitos obtidos entre todas as frações não seja estatisticamente significativa, a densidade dos osteócitos difere drasticamente entre as frações. Aqui, a estratégia de gating para isolar osteócitos positivos para GFP de seus equivalentes negativos para GFP por classificação de células ativadas por fluorescência é mostrada.Após a classificação, os osteócitos podem ser analisados quanto à expressão de marcadores de interesse dos osteócitos. Nesta análise, os genes marcadores de osteócitos foram expressos em níveis mais altos nos osteócitos positivos para GFP isolados em comparação com a fração de pré-classificação dois, que é conhecida como fração de osteoblastos alta. Aqui, a morfologia de um osteócito positivo para GFP retendo uma forma estrelada com dendritos que se estendem do corpo celular após 24 horas de cultivo em uma placa de cultura de plástico, pós-classificação, pode ser observada.Preste atenção ao aspirar os digestos, pois a calveria será reduzida a minúsculos pellets. Lembre-se de usar um aspirador de ponta pequena para evitar a perda de células. Os osteócitos têm sido enigmáticos porque estão sepultados nos ossos.Essa técnica abriu caminho para o estudo das interações moleculares dos osteócitos e seu controle sobre osteoclastos e osteoblastos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A medida quantitativa da função progenitor óssea na consolidação da fratura requer alta resolução tecnologia de imagens em série. Aqui, os protocolos são fornecidos para o uso de microscopia intravital e rastreamento osteo-linhagem sequencialmente imagem e quantificar a migração, proliferação e diferenciação de células-tronco / progenitoras osteogênicas endógenos no processo de reparação de fratura óssea.

Seqüente<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de osteogênicas células-tronco / progenitoras durante o reparo de fratura

Tratamento de osteoblastos primários de rato com ácido retinóico produz uma população homogênea de células ramificadas que carregam características morfológicas e moleculares de osteócitos. O método supera a dificuldade de obtenção e manutenção de osteócitos primárias em cultura, e pode ser vantajosa para o estudo de células derivadas de modelos transgénicos.

A aplicação de ácido retinóico para obter culturas de osteócitos principal do mouse osteoblastos

A natureza das interações entre células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) e nichos de medula óssea é pouco compreendido. Modificações de hardware personalizado e um protocolo de aquisição multi-passo permite o uso de dois fótons e microscopia confocal a imagem ex vivo hspCs rotulados hospedados dentro de áreas da medula óssea, as interações de rastreamento e movimento.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.

Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

Os osteoclastos são polykaryons tecido-específicos do macrófago derivados da linhagem do monocyte-macrófago de pilhas de haste hematopoietic. Este protocolo descreve como isolar pilhas da medula de modo que as grandes quantidades de osteoclastos sejam obtidas ao reduzir o risco de acidentes encontrados em métodos tradicionais.

Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos

Este protocolo descreve a detecção da migração de células-tronco periósteis periósteis mediadas pelo CCL5 em tempo real usando microscopia intravital animal viva.

Imagem em tempo real da migração induzida por CCL5 de células-tronco esqueléticas periósteis em camundongos

Descrevemos aqui o método para imagem de megacaiócitos e proplatelets na medula do osso do crânio de ratos vivos usando microscopia de dois fótons.

In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato

O presente artigo descreve a realização de uma abordagem de imagem intravital para observar a sinalização de cálcio induzida mecanicamente de osteócitos embutidos in vivo em tempo real em resposta à carga mecânica em nível de tecido do terceiro metatarso do camundongo.

Uma abordagem de imagem intravital fluorescente para estudar a dinâmica de sinalização de cálcio induzida por carga em osteócitos de camundongos

Este estudo descreve o método para visualizar e desenvolver modelos tridimensionais (3D) de osteócitos dentro da rede lacunar-canalicular (LCN) para análise de dinâmica de fluidos computacional (CFD). Os modelos gerados usando este método ajudam a entender a mecanosensação dos osteócitos em ossos saudáveis ou doentes.

Análise e imagem de osteócitos

A microscopia intravital permite o estudo de processos biológicos dinâmicos, como regeneração tecidual e desenvolvimento tumoral. A medula óssea da calvária, um tecido altamente dinâmico, oferece informações sobre hematopoiese e função vascular. O uso de um implante de fixação de cabeça impresso em 3D biocompatível permite imagens longitudinais repetitivas, aprimorando nossa compreensão da dinâmica do tecido e do microambiente tumoral.

Imagem longitudinal intravital da dinâmica vascular na medula óssea da calvária

Aprenda a isolar osteócitos primários expressando GFP de calvárias de camundongos transgênicos dmp1-topaz usando FACS. Este protocolo reduz o tempo de manipulação e aumenta o rendimento celular para estudos de biologia óssea.

Obtenção de osteócitos primários através do fracionamento em calvária murina de osteócitos que expressam GFP

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