Imagem Animal inteira de Drosophila melanogaster usando tomografia microcomputada

Este protocolo permite a imagem não destrutiva de resolução de mícrons de laboratório intacta ou mole. Ele pode ser usado para entender os mecanismos de fisiologia, anatomia e desenvolvimento animal. Como as moscas são fotografadas em um estado intacto sem a necessidade de dissecção de tecido, a arquitetura espacial de tecidos e órgãos é mantida em seu estado nativo e é facilmente observada.

A micro CT é uma ferramenta ideal para estudos que visam modelar doenças humanas em moscas ou para entender defeitos de desenvolvimento que afetam a qualidade de vida. Também provou ser útil em outras disciplinas, como engenharia, física, ciência dos materiais, geologia e antropologia. Depois de selecionar o ponto de tempo de desenvolvimento de interesse para a imagem, transfira de 5 a 20 animais para um mililitro de PBST em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e incube o tubo por cinco minutos em temperatura ambiente com batidas periódicas para auxiliar na remoção do revestimento hidrofóbico e permitir que os animais fiquem totalmente submersos.

No final da incubação, substitua o PBST por um mililitro de solução de Bouin e bata no tubo para submergir totalmente as moscas. Para amostras de larvas e pupas, após duas horas de incubação à temperatura ambiente, lavar os animais três vezes por cinco minutos e um mililitro de PBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, transfira as amostras para um prato de dissecação de vários poços contendo PBS fresco por poço sob um microscópio de dissecação e use um pequeno pino minuciano preso a um suporte para fazer um orifício na cutícula anterior e posterior de cada amostra, tomando cuidado para não romper o tecido mole subjacente.

Depois de penetrar nas cutículas, incube as amostras em um mililitro de solução fresca de Bouin em um novo tubo de 1,5 mililitro por 24 horas em temperatura ambiente antes de lavar a amostra três vezes por 30 minutos e um mililitro de um tampão de lavagem micro CT por lavagem. Após a última lavagem, adicione um mililitro da solução de coloração apropriada ao tubo e incube as amostras em temperatura ambiente por dois a sete dias. Se for necessária uma preservação de imagem mais longa, desidratar as amostras dentro da série ascendente de etanol em um mililitro de etanol por uma hora por concentração, conforme indicado, para preparar as amostras para secagem em ponto crítico.

Para montar amostras secas de ponto crítico, coloque as amostras em tubos capilares de plástico ou vidro antes de montar os tubos no suporte do estágio rotativo. Para montagem de amostra hidratada, encha uma ponta de pipeta P10 com água e prenda a extremidade estreita com filme de parafina. Use uma pinça para transferir uma única amostra para a ponta da pipeta e use um objeto longo e fino para empurrar cuidadosamente a amostra para dentro da ponta até que ela entre em contato com a parede da ponta para manter a amostra no lugar.

Depois de cobrir a extremidade aberta da pipeta, monte a pipeta P10 em um suporte projetado para caber no calço do estágio rotativo. Para digitalizar, clique no ícone Abrir porta no software do scanner para obter acesso ao calço de platina giratório e aperte o colar ao redor da base do porta-amostras para prender a amostra. Defina os parâmetros de varredura no software para resolução e contraste ideais e clique em Opções e fonte de raios-X para abrir o controle de energia da fonte de raios-x.

Use as barras deslizantes para definir a tensão de raios-x para 30 a 40 quilovolts e a corrente para 100 a 110 micro amperes para produzir um feixe de raios-x com três a quatro Watts de potência e um tamanho de ponto pequeno. Para definir o número de imagens de projeção a serem adquiridas durante as varreduras, selecione Opções e Modos de Aquisição para definir o tempo de exposição da câmera para 500 a 800 milissegundos e use a barra deslizante para definir o tamanho de pixel da imagem desejado de acordo com as configurações e a posição da câmera. Clique e arraste a barra deslizante para mover a amostra ao longo de seu caminho de rotação de 360 graus, mantendo a amostra dentro do campo de visão.

Clique no ícone iniciar aquisição. Uma caixa de diálogo aparecerá permitindo que parâmetros de digitalização adicionais sejam definidos. Nomeie o arquivo e a pasta de saída na qual a verificação será salva.

Defina o movimento aleatório para 10 e a média para quatro a seis quadros. A etapa de rotação será calculada automaticamente dependendo das configurações da câmera usadas e, em seguida, clique em OK para iniciar a aquisição. Uma caixa de diálogo da barra de progresso mostrando o tempo de varredura aparecerá e o scanner começará a adquirir uma série de imagens de projeção da amostra ao longo do caminho de rotação.

Para gerar os tomogramas, abra as imagens de projeção no software de reconstrução e selecione o algoritmo de correção de deslocamento para realizar um alinhamento inicial da imagem. Selecione o melhor valor que alinha corretamente as imagens de projeção e clique em Ajuste fino para ajustar cada parâmetro de reconstrução. Será gerada uma série de visualizações que podem ser usadas para selecionar os valores corretos.

Confirme se os valores de parâmetro ideais são exibidos na guia Configurações e, na guia Saída, ajuste os parâmetros do arquivo, como profundidade de bits, nome do arquivo e pasta onde os dados serão salvos. Uma região de interesse pode ser usada para reconstruir apenas as estruturas de interesse. Se várias reconstruções forem necessárias, clique em Iniciar e Adicionar ao lote para adicionar a imagem atual ao gerenciador de lotes e repita a reconstrução para as imagens restantes.

Para análise morfométrica das imagens reconstruídas, na guia Segmento, em um programa de software de análise morfométrica apropriado, clique em Básico e Novo, dê um novo nome à imagem e selecione uma cor apropriada. Marque a caixa Definir intervalo e ajuste o controle deslizante para ajustar o intervalo de limite que abrange a estrutura de interesse. Para pintar uma área definida pelo limite, pressione e segure a tecla Control enquanto mantém pressionada a tecla esquerda do mouse.

Para remover uma área, pressione e segure a tecla Shift enquanto mantém pressionada a tecla esquerda do mouse. Certifique-se de que as medidas da região de malha de interesse sejam exibidas no painel de informações para análise morfométrica básica. Renderize o objeto de malha e toda a imagem do tomograma e visualize a imagem resultante em 3D e clique com o botão direito do mouse para selecionar Mostrar Movie Maker para gerar um vídeo do objeto usando quadros individuais do visualizador.

Nessas imagens, um embrião, uma larva de terceiro ínstar, pupa no estágio adulto ferrado e uma mosca fêmea adulta corada com iodo e fotografada na água usando um scanner de bancada comercial podem ser observados. A excelente preservação e até mesmo a coloração do tecido delicado são aparentes, permitindo que todos os principais órgãos sejam prontamente identificados. Aqui, é mostrada uma comparação da mesma capa de mosca adulta, adquirida no modo de varredura de projeção lenta e rápida.

É importante ressaltar que, embora a resolução nas imagens lentas seja maior, a análise morfométrica não difere entre as varreduras lentas e rápidas. Usando o software de renderização, qualquer sistema de tecido ou órgão de interesse pode ser segmentado e usado para análise morfométrica e visualização 3D. Nessas imagens, um abdômen de mosca corado com ácido fosfotúngstico e fotografado enquanto hidratado com água ou após secagem de ponto crítico em um microscópio de raios-x pode ser observado.

Usando ácido fosfotúngstico, células epiteliais individuais do intestino médio e feixes de esperma dentro dos testículos são facilmente resolvidas. Embora as imagens de secagem do ponto crítico mostrem uma resolução marginalmente aumentada em comparação com a amostra hidratada, uma melhor preservação da ultraestrutura dos tecidos delicados é alcançada com amostras hidratadas, como as células de gordura próximas à cutícula. Para obter a melhor resolução, limite o movimento da amostra e o excesso de vibrações.

Garantir a amostra ao palco é fundamental para isso, embora criatividade e desenvoltura possam ser necessárias para conseguir isso. Métodos de imagem adicionais, como microscopia de luz e eletrônica, podem ser usados como parte de um fluxo de trabalho de imagem para entender uma determinada mutação genética da nanoescala para todo o organismo.