Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

O objetivo geral deste estudo é mostrar como implementar procedimentos automatizados para a cultura e diferenciação de células IPS humanas em linhagens neuronais, bem como suas imagens automatizadas. Procedimentos automatizados padronizados permitem baixa variação experimental, garantindo alta reprodutibilidade fenotípica. Além disso, o sistema pode ser adaptado para o desenvolvimento de novos protocolos.

Os procedimentos serão Joachim Tager e Elisangela Bressan, pós-doutores do nosso laboratório. Na interface gráfica do usuário do sistema automatizado, clique na visualização do processo de instrumento de recurso e selecione o processo de instrumento de recurso. Clique no processo de instrumento de execução e execute os processos hepa e recarga executados.

Selecione os recursos a serem carregados, abra a porta e carregue as placas de cultura celular e as pontas descartáveis nas posições apropriadas, conforme indicado pelas imagens popup. Em seguida, descontaminar a porta com 70% de etanol antes de fechar e executar o processo de descontaminação. O sistema será esterilizado por radiação UV por 30 minutos.

Para carregar as placas com meio de cultura ou reagente de dissociação, execute a etapa do capô hepa e abra a porta da estação de manuseio líquido. Após a descontaminação com 70% de etanol, coloque os reservatórios no convés para a posição atribuída e descobrilá-los. Feche a porta da estação de manuseio de líquidos e execute o processo de instrumento de recurso InitHepaHood para desligar o capô HEPA.

Para executar um método de cultura automatizado, na visualização do calendário da interface gráfica do usuário, clique em adicionar etapa de processo e selecione a linha celular a ser usada no experimento. Use o assistente para selecionar o projeto e marque o lote a ser usado. Clique na seta direita e navegue até a próxima página do assistente para selecionar a etapa do processo a ser executada.

Na última página do assistente, agende o experimento e defina os parâmetros apropriados para detalhar as variáveis necessárias para a execução do método. Em seguida, clique em OK. Depois de carregar um tubo de 50 mililitros com a suspensão celular IPS humana, carregue placas de cultura revestidas para receber as células na prateleira e execute a semeadura de placas a partir do método de tubos. Para contar as células do cítmetro de imagem Brightfield, prepare automaticamente uma placa de contagem de 384 poços com suspensão celular no convés e use o braço robótico para transferir a placa de contagem de 384 poços do convés para o citómetro de imagem Brightfield.

Após a contagem, o sistema devolverá a placa à sua posição original e transferirá uma cultura revestida ou placa de ensaio da prateleira para o deck de tubulação. Em seguida, o sistema semeará as células no número definido pelo usuário e volumes adequados para a placa e misturará por pipetação. Após a semeadura, a placa será movida para o agitador no convés por 10 segundos a 500 rotações por minuto para distribuição celular antes de ser transferida para a incubadora de dióxido de carbono.

Para avaliar a confluência automatizada, execute o método de confluência de verificação e selecione um lote que contenha pelo menos uma placa de cultura e nenhuma placa de ensaio. Na seção de detalhes dos parâmetros, digite iPSCf_2020 para aquisição de imagens nas configurações de análise de imagem. Em seguida, o sistema transferirá a primeira placa da incubadora para o cítmetro de imagem Brightfield e a imagem da confluência celular.

Para alterar a cultura celular ou a mídia de placas de ensaio, execute a mudança de mídia do método de placas de cultura e selecione um lote contendo apenas placas de cultura. O sistema transferirá as placas para o convés e inclinará as placas para permitir a aspiração do supernatante. O supernasário será descartado no módulo de coleta de resíduos e descartará as pontas e 12 mililitros de meio fresco serão adicionados a cada placa.

Em seguida, o sistema recobrirá as placas e devolverá as placas à incubadora de cultura celular. Alternativamente, para alterar o meio das placas de ensaio, execute a mudança de mídia do método de placas de ensaio. Para subcultivar as células, execute a subcultivação do método de células aderentes e selecione o lote contendo as placas de cultura que precisam de subcultivação.

Depois de descartar o meio, o sistema lavará as células uma vez com oito mililitros de PBS por placa antes de adicionar oito mililitros de 0,5 mililitros EDTA às células. Após oito minutos no convés com opção de inclinação, o EDTA será substituído por 12 mililitros de meio fresco por placa. O sistema vai agitar as placas a 2.000 revoluções por minuto durante um minuto para desalojar as colônias antes de triturar as células com cinco ciclos de tubulação para quebrar as colônias em 50 a 80 mícrons.

As células serão então transferidas para um tubo de 50 mililitros no convés antes de semeá-las em uma proporção de uma a sete divisões. Para conteúdo automatizado de alto conteúdo, imagens de células de alto rendimento, execute o método de imagem e selecione um lote que contenha pelo menos uma placa de ensaio e nenhuma placa de cultura. Em seguida, o sistema transferirá uma placa de ensaio para o microscópio confocal automatizado para imagens.

Certifique-se de selecionar os IDs de lote e placa corretos enquanto executa as etapas de processo necessárias. As culturas hiPSC devem ser monitoradas diariamente para o crescimento e analisadas por sua porcentagem de confluência no citômetro de imagem Brightfield. Após a passagem e a cultura manual ou automatizada do sistema, as células exibem uma expressão típica de marcador de células-tronco e pluripotência.

Neurônios diferenciados no sistema de cultura automatizada demonstram uma organização de morfologia e rede neuronal semelhante aos neurônios cultivados manualmente. Após seis dias de diferenciação, os neurônios cortical automaticamente diferenciados são positivos para a beta-tubulina de classe III específica do neurônio e a expressão do marcador de camada cortical superior. Após oito dias, as células também expressaram proteína associada a microtúbulos 2, a molécula de adesão de células neurais e a sinapssina I, bem como marcadores de neurônio cortical.

Muito baixo ou nenhuma expressão desses marcadores é observada em hiPSC. Este sistema também pode ser usado para estabelecer um ensaio de extensão de neurite automatizado de células vivas que permite que os comprimentos de neurite sejam medidos ao longo de 11 dias de diferenciação sem intervenção manual. O uso do sistema de cultura automatizado para realizar mudanças médias durante um período de cultura de 65 dias facilita a diferenciação hiPSC em neurônios dopaminérgicos de cérebro médio com a organização celular e morfologia esperadas.

Além do crescimento do neurite, outros ensaios fenotípicos automatizados relevantes para estudar neurodegeneração, por exemplo, focos de RNA de translocação TDP-43 e captação fibril alfa-sinucleína, podem ser explorados usando este alto rendimento, alto formato de conteúdo.