Name: Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda a diferenciação automatizada de neurônios corticais e dopaminérgicos a partir de hiPSCs humanos com monitoramento de células vivas. Este método padronizado garante alta reprodutibilidade fenotípica para pesquisas em neurociência.

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Os autores reconhecem com gratidão os pacientes e seus familiares que contribuíram com o biomamaterial para este estudo. As linhas de células utilizadas no estudo foram da coleção NINDS com Rutgers (ND41865 como iPS#1) e do laboratório do Dr. Tilo Kunath (iPS#2). Este trabalho é apoiado em parte pela NoMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, um Programa Conjunto da UE - Pesquisa de Doenças Neurodegenerativas (JPND) (PH); A iniciativa DZNE I2A (AD); PD-Strat, um projeto financiado pela ERA-Net ERACoSysMed (PH) e a Foundational Data Initiative for Parkinson's Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). Foundin-PD faz parte do programa PATH to PD da Fundação Michael J. Fox. Os autores agradecem a Steven Finkbeiner e Melanie Cobb (Gladstone Institutes) por contribuírem para o estabelecimento do protocolo manual de diferenciação de neurônios mDA e Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) pela assistência na configuração de análise de crescimento de neurite.

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</ol>

Não temos nada para revelar.

Introduzimos um sistema automatizado de cultura celular com recursos integrados de imagem para a padronização da cultura hiPSC e diferenciação neuronal. Devido à mínima intervenção do usuário, a variação experimental é baixa garantindo a reprodutibilidade dos fenótipos celulares durante a diferenciação. O agendador baseado em calendário apoia a organização e a paraleloização dos experimentos e permite um alto grau de flexibilidade no momento em que os experimentos são realizados. Os métodos existentes podem ser facilmente adaptados e o espectro dos métodos disponíveis pode ser aumentado. Além disso, um grande número de formatos de placas de ensaio pode ser usado adicionando à flexibilidade deste sistema. O sistema mínimo composto por uma incubadora de CO2, um braço robótico, um citômetro celular de campo brilhante e uma estação de manuseio líquido forma a unidade básica necessária para a cultura e diferenciação hiPSC, com custos acessíveis para laboratórios de pesquisa acadêmica. A combinação do sistema automatizado de cultura celular com um sistema automatizado de armazenamento de -20 °C para armazenamento de compostos, bibliotecas RNAi ou bibliotecas CRISPR/Cas9, e a integração de um microscópio de alto teor/alto rendimento permitem a execução de triagens fenotípicas.
No presente estudo, o sistema automatizado de cultura celular utilizou pontas descartáveis e a mídia cultural foi reabastecida manualmente no reservatório, limitando assim o uso da estação de manuseio líquido para mudanças de mídia e outros processos culturais especialmente da noite para o dia. Para contornar essa limitação, os métodos podem ser ajustados ao uso de agulhas em vez de pontas descartáveis e, após a instalação de conexões de tubo entre linhas de mídia e sacos de mídia armazenados em uma geladeira, os reservatórios de mídia podem ser automaticamente recarregados com mídia fresca pré-aquecida por elementos aquecedores. Isso reduziria as interferências dos usuários causadas pelo reabastetamento manual de dicas, mídia de cultura e trocas de reservatórios.
Nosso sistema automatizado de cultura celular oferece várias vantagens. Um deles é o sistema de rastreamento de código de barras. As placas carregadas no sistema são identificadas por um código de barras único que é lido e salvo pelo sistema que permite o rastreamento de amostras durante e após a execução do método. Outra vantagem é a possibilidade de criar projetos específicos para usuários. Aqui, placas de cultura carregadas no sistema podem ser atribuídas a um projeto específico e agrupadas em lotes. A estruturação em lotes simplifica a execução do mesmo procedimento em todas as placas de um determinado lote, uma vez que nenhuma placa individual precisa ser selecionada. Além disso, um editor de classe líquida permite ajustar a velocidade e altura da tubulação, bem como a aspiração e os parâmetros de distribuição para cada etapa de transferência líquida. Cada processo é documentado em arquivos de log permitindo refazer quais tarefas foram executadas para uma determinada cultura ou placa de ensaio.
Neurônios e outros tipos de células derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) são ferramentas in vitro úteis para estudar os mecanismos de doenças neurodegenerativas em populações específicas de pacientes (por exemplo, neurônios dopaminérgicos para doença de Parkinson) oferecendo a possibilidade de exames medicamentosos personalizados. A culturing hiPSC é muito intensiva e exige pessoas treinadas para executar protocolos complexos de diferenciação, geralmente limitados à produção em baixa escala. Adaptamos a cultura livre de alimentadores do hiPSC a uma cultura automatizada e implementamos dois protocolos de diferenciação neuronal, um protocolo rápido de diferenciação de neurônios corticais baseado na superexpressão NGN2 sob um promotor tet-on10,11, e um protocolo de longo prazo baseado em pequenas moléculas para geração de neurônios dopaminérgicos de cérebro médio (mDA)13. A transferência direta e a reprodutibilidade dos protocolos manuais de cultura e diferenciação torna o sistema de cultura automatizado muito útil. O iPSC humano cultivado no sistema de cultura celular automatizada mostrou morfologia consistente de células-tronco e expressou importantes marcadores de pluripotência, reprodutíveis entre experimentos independentes. Além disso, a automação do protocolo de cultura hiPSC favoreceu a cultura e a expansão de um número maior de linhas celulares em paralelo. Verificações automatizadas de confluência programadas para serem realizadas durante a noite economizam tempo deixando o sistema livre durante o dia para etapas de processo a jusante realizadas quando o usuário estava em laboratório (por exemplo, colheita de células ou replação manual para diferenciações). Ao atingir o limiar de confluência definido pelo usuário, as células são passaged e replated em placas extracelulares revestidas de matriz disponíveis no empilhador do sistema automatizado de cultura celular. Cada rodada de passagem leva cerca de 70 minutos e gera quatro placas de 1 poço a partir de uma placa-mãe, o que se traduz em uma capacidade de 20 passagens em um dia.
A automação do protocolo de diferenciação NGN2 foi feita com sucesso e permitiu a geração de uma população homogênea de células neuronais em diferentes passagens e comparável a diferenciações manuais. Além disso, os custos experimentais para estudos de triagem em larga escala envolvendo múltiplas linhas celulares ou experimentos de triagem com milhares de condições/compostos de teste seriam reduzidos devido a rápidas diferenciações. Leituras econômicas e de alto rendimento, incluindo medidas de crescimento de neurite de células vivas, podem ser facilmente desenvolvidas, implementadas e usadas como leituras fenotípicas para modelagem de doenças, como mostrado anteriormente14,15,16. Assim, adaptamos ainda mais o protocolo NGN2 usando células precursoras neurais derivadas de pequenas moléculas (smNPC) que constitutivamente super-expressam GFP. As células smNPC oferecem outras vantagens, incluindo custos reduzidos com mídia de cultura (um terço do custo com cultura iPSC) e tempo necessário para ampliar os experimentos. Os rendimentos celulares do smNPC são 7 a 10 vezes maiores do que os obtidos com iPSC. Os neurônios diferenciados foram monitorados e imagens com sucesso por vários dias usando um processo de imagem totalmente automatizado sem a necessidade de manchas manuais de anticorpos ou rotulagem química, economizando custos e tempo necessários para procedimentos manuais, incluindo a imagem por si só. A imagem atual de 60 poços internos de uma placa de 96 poços leva cerca de 16 minutos por placa quando 25 campos por poço são imagens, o que significa que os dados para uma triagem baseada em imagem para 1000 compostos, poderiam ser adquiridos e analisados em um dia. No futuro, essa leitura poderia ser usada em estudos de triagem composta para o resgate de defeitos de crescimento de neurite.
Além disso, demonstramos também a transferência de um protocolo de diferenciação manual para geração de neurônios dopaminérgicos de cérebro médio (mDA) a partir do iPSC. Este pequeno protocolo de diferenciação baseado em moléculas leva 65 dias e é intensivo em mão-de-obra por causa das múltiplas etapas de replação e mudanças frequentes na mídia, principalmente a cada 2 dias, o que limita a produção de neurônios mDA a poucas linhas iPSC ao mesmo tempo. O protocolo automatizado de diferenciação mDA tem a grande vantagem de aumentar a diferenciação para dezenas de linhas iPSC. Até 30 linhas celulares poderiam ser diferenciadas em paralelo. Como a diferenciação é baseada principalmente em mudanças de mídia, quase todo o processo de diferenciação pode ser conduzido sem interferência humana. Usando o programador baseado em calendário do sistema automatizado, poderíamos planejar as mudanças de mídia de acordo com as etapas de diferenciação. Uma limitação de trabalhar com um número tão grande de linhas celulares e placas de cultura foi a impossibilidade de realizar alterações na mídia durante a noite. A principal razão é o fato de que nosso sistema está configurado para usar dicas descartáveis e recarga manual de mídias culturais que exigem que um usuário em laboratório execute esta etapa manual. Para facilitar o processo de troca de mídia, as placas carregadas no sistema foram atribuídas a um projeto e agrupadas em lotes. O tamanho do lote foi então adaptado ao número de dicas descartáveis e volume de mídia de cultura disponível. Como discutido acima, essa limitação pode ser facilmente superada pela implementação de agulhas reutilizáveis/laváveis e recarga automatizada de mídia. A troca/replação automatizada de células, como mostrado para iPSC, é uma das conveniências oferecidas pelo nosso sistema automatizado de cultura celular. Testamos a replação automatizada de neurônios mDA no dia 25 de diferenciação. No entanto, a dissociação dos neurônios mDA requer uma incubação mais longa (40 minutos) com a enzima dissociação do que o iPSC (8 min) estendendo o processo automatizado de replação para mais de 1 h por linhas celulares. Como consequência, a replação automatizada de 30 linhas celulares no mesmo dia tornou-se impossível. Acelerar outras etapas durante a replação automatizada (transporte de placas, pipetting) e adaptar o sistema ao uso de agulhas e linha de mídia que torna possível um trabalho noturno resolveria essa limitação. Apesar das desvantagens, poderíamos transferir com sucesso o protocolo manual para uma diferenciação automatizada de neurônios mDA produzindo culturas com quantidades substanciais de células positivas MAP2 (neurônio) e TH (neurônios mDA).
Diferenciar dezenas de linhas celulares iPSC em paralelo é de grande interesse em projetos que investiguem os mecanismos moleculares de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson. No entanto, concluir tarefas mais rapidamente com menos erros e a custos reduzidos é um grande desafio. Devido à automação dos protocolos aqui apresentados (iPSC, smNPC e neurônio mDA), poderíamos acelerar, reduzir os custos e aumentar a reprodutibilidade em nossos projetos. O desenvolvimento de projetos como o FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) envolvendo centenas de linhas celulares de pacientes mostra necessidade de protocolos automatizados de cultura e diferenciação. Nossas perspectivas futuras incluem a transferência de modelos manuais de cultura celular 3D (3D) para o sistema automatizado. Pequenas adaptações nas configurações de definição da placa e o uso de adaptadores permitirão o uso de placas comerciais ou personalizadas e câmaras microfluídicas necessárias para as culturas 3D. Além disso, a implementação de um modelo automatizado de imagem sem rótulos nos permitirá acompanhar o crescimento neuronal em tempo real e traduzir mudanças no crescimento do neurite, organização dos neurônios e morte celular em uma melhor compreensão dos mecanismos da doença.

As células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) são auto-renovadas e podem se diferenciar em quase qualquer tipo de célula adulta. Essas características fazem do hiPSC uma ferramenta útil para modelagem de doenças em pesquisa básica e descoberta de medicamentos1. O iPSC humano mantém o fundo genético do doador que permite a deriva de tipos celulares relevantes para doenças que são mais afetados/envolvidos no curso da doença, por exemplo, diferentes subtipos neuronais para doenças neurodegenerativas2,3. Além disso, o hiPSC supera algumas das limitações dos modelos de superexpressão animal e celular, modelando doenças em um contexto humano e níveis de expressão fisiológica de proteína, e provou ser um ativo valioso na modelagem de doenças que vão desde distúrbios monogênicos, complexos e epigenéticos, bem como doenças de início tardio4.
Apesar desses benefícios e oportunidades, várias limitações do hiPSC ainda precisam ser abordadas. Os atuais protocolos de cultura e diferenciação hiPSC não são econômicos, difíceis de padronizar e são intensivos em mão-de-obra. As etapas manuais de cultura podem resultar em alta variabilidade nos rendimentos e fenótipos devido a diferenças de crescimento e diferenciação espontânea do hiPSC. Portanto, a variação dependente de experimentadores precisa ser reduzida através da implementação de técnicas de manuseio mais padronizadas e da simplificação de protocolos que podem ser alcançados usando a automação5. O estabelecimento de protocolos automatizados de cultura e diferenciação hiPSC estabelecerá padrões comuns para projetos de pesquisa acadêmica e industrial, além de permitir a geração de modelos de doenças biologicamente relevantes e resultados mais reprodutíveis.
Trabalhos anteriores tentaram automação das culturas hiPSC6,7,8, mas seus protocolos foram restritos a formatos específicos de placas de cultura celular dependentes do sistema e sem adaptabilidade a diferentes formatos de ensaio. Tais sistemas são úteis na maior parte das células, mas podem não ser adequados para diferenciação automatizada em tipos de células desejadas, fenotipagem de doenças e fins de triagem. Além disso, uma plataforma automatizada em larga escala para derivação de fibroblasto, geração de hiPSC e diferenciação foi descrita9, mas em uma escala que só pode ser alcançada por laboratórios de alto rendimento dedicados à produção de linhas que parecem atraentes, mas podem ser inacessíveis para muitos laboratórios acadêmicos.
Desenvolvemos um sistema de cultura celular totalmente automatizado baseado em uma estação de manuseio líquido em um ambiente filtrado de Particulado de Alta Eficiência (HEPA) em conjunto com uma incubadora co2 de grande capacidade, um citómetro de imagem de campo brilhante e um braço robótico para transporte de placas. Esses componentes fornecem a base para a cultura e diferenciação hiPSC estáveis e reprodutíveis. Complementamos o sistema com um sistema automatizado de armazenamento de -20 °C para armazenamento composto ou vírus e um imager de células ao vivo confocal de disco de alta velocidade. Protocolos personalizados foram gerados permitindo semeadura automatizada de células, alterações de mídia, verificações de confluência, expansão celular e geração de placas de ensaio com tratamento amostral e imagem de placa, tornando o sistema compatível com triagens de alto conteúdo/alto rendimento. O sistema automatizado de cultura celular e imagem é operado usando o software de controle e a interface gráfica de usuário (GUI) feita sob medida. A GUI permite que os usuários importem arquivos CSV contendo parâmetros específicos da linha celular necessários para a execução do método. Além disso, a GUI permite agendar inúmeros experimentos em qualquer sequência usando a visão de calendário incorporado, permitindo assim o controle total do tempo quando cada método é iniciado.
Nosso sistema automatizado de cultura celular utiliza velocidades padronizadas de pipetação, tempos de passagem, limiares de confluência, densidades de semeadura e volumes médios com a flexibilidade para cultivar células em uma variedade de formatos de placas (formato de placa de 96, 48, 24, 12, 6 ou 1-bem). Adaptamos um protocolo de diferenciação de curto prazo recentemente publicado para converter hiPSC em neurônios que podem produzir neurônios positivos TUBB3 em 6 dias10,11. Também estabelecemos a diferenciação automatizada e a imagem de células precursoras neurais de pequenas moléculas (smNPC) em neurônios que expressam constitutivamente o GFP sob o EF1a promoter12 e o iPSC em neurônios dopaminérgicos de cérebro médio (mDA), adaptando um protocolo de inibição dual-SMAD publicado anteriormenteque produz neurônios mDA dentro de 65 dias.

<table><tbody><tr><td>Anticorpos</td><td>Distribuidor</td><td>Número de catálogo</td><td>Diluição</td></tr><tr><td>marcador de pluripotência iPSC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-SSEA4</td><td>Abcam</td><td>ab16287</td><td>1 a 33</td></tr><tr><td>Coelho anti-Oct3/4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>1 a 200</td></tr><tr><td>NGN2 marcadores de neurônios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti- TUBB3</td><td>R & D</td><td>MAB1195</td><td>1 a 500</td></tr><tr><td>Coelho anti-BRN2</td><td>NEB</td><td>12137</td><td>1 a 1.000</td></tr><tr><td><forte> marcadores de neurônio mDA</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frango anti-TH</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>12137</td><td>1 a 750</td></tr><tr><td>Camundongo anti-MAP2</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74421</td><td>1 a 750</td></tr><tr><td><forte>Anticorpos secundários</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgY anti-frango de cabra, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td>1 a 2.000</td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1 a 2.000</td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11032</td><td>1 a 2.000</td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1 a 2.000</td></tr><tr><td>anti-coelho de cabra IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1 a 2.000</td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>1 a 2.000</td></tr><tr><td><forte>Contracoloração de núcleos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1 a 8.000</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Instrumentos</forte> </td><td>Distribuidor</td><td>Número de catálogo</td><td>Descrição/Aplicação</td></tr><tr><td>Agilent Sistema TapeStation</td><td>Tecnologias Agilent</td><td>4200</td><td>Eletroforese automatizada para amostras de DNA e RNA</td></tr><tr><td>Automatizado -20 &deg; Sistema de armazenamento C</td><td>Hamilton Storage Technologies</td><td>Sample Access Manager (SAM -20C, série 3200)</td><td>Armazenamento de reagentes</td></tr><tr><td>Leitor de código de barras</td><td>Leitor</td><td>de código de barras Honeywell Orbit</td><td>Leitor de código de barras</td></tr><tr><td>Brightfield cell cytomat</td><td>Nexcelom</td><td>Celigo Verificação</td><td>de confluência e contagem de células</td></tr><tr><td>CellVoyager 7000</td><td>Yokogawa</td><td>CellVoyager 7000</td><td>Microscópio confocal automatizado </td></tr><tr><td>Cytomat para culturas de células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cytomat 24 C,</td><td>12 empilhadores passo 28 mm, 12 empilhadores passo 23 mm (total de 456 placas)</td></tr><tr><td>Cytomat para descongelamento de amostras</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cytomat 2-LIN, 60 DU (Unidade de Secagem)</td><td>2 empilhadores passo 28 mm (total de 42 placas)</td></tr><tr><td>Filtros HEPA</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Hood Flow Star</td><td>UV Modificado por Hamilton Robotics</td></tr><tr><td>Estação de manuseio de líquidos</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Microlab</td><td>Star Canais: 8x 1-ml, 4x 5 ml e 96 Canais MPH</td></tr><tr><td>Reservatório de mídia</td><td>Hamilton Robotics</td><td>188211APE</td><td>Reservatório de mídia/reagentes</td></tr><tr><td>Sistema de água pura</td><td>Veolia Water</td><td>ELGA PURELAB Classic</td><td>Fornece água pura para estação de lavagem de agulhas</td></tr><tr><td>Sistema de PCR em Tempo Real QuantStudio 12K Flex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSTUDIO12KOA</td><td>Máquina de PCR em Tempo Real</td></tr><tr><td>Braço robótico</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Rackrunner</td><td>Transporte de placas</td></tr><tr><td>Mesa giratória</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Mesa giratória</td><td>Ajustar a orientação</td></tr><tr><td>da placa Fonte de alimentação ininterrupta</td><td>APC</td><td>Smart UPS RT Unit, 10000 VA Power fonte</td><td>de alimentação de backup</td></tr><tr><td>VIAFLO-pipetas</td><td>Integra</td><td>4500</td><td>Pipeta eletrônica</td></tr><tr><td>ViiA 7 Sistema de PCR em tempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>4453545</td><td>Máquina</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de PCR em tempo real<tr><td>Materials</td><td>Distribuidor</td><td>Número de catálogo</td><td>< forte>Notas</forte></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 1 poço (84 cm2)</td>Placas de cultura de 6 poços <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>165218</td><td>Nunc OmniTray</td></tr><tr><td>(9,6 cm2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td>TC tratado com tampa</td></tr><tr><td>Placa de cultura de 12 poços (3,9 cm2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665180</td><td>TC tratado com tampa</td></tr><tr><td>Placa de cultura de 96 poços (0,32 cm2)</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005558</td><td>CellCarrier-96 Pontas de placa preta</td></tr><tr><td>, 50-&micro; L</td><td>Hamilton Robotics</td><td>235987</td><td>pontas de 50 uL</td></tr><tr><td>Dicas, 300-&micro; L</td><td>Hamilton Robótica</td><td>235985</td><td>300-&micro; L dicas</td></tr><tr><td>Dicas, 1000-&micro; L</td><td>Hamilton Robótica</td><td>235939</td><td>1000-&micro; Pontas L</td></tr><tr>, <td>Hamilton Robotics</td><td>de 5 mL</td><td>184022</td><td>pontas de 5 mL</td></tr><tr><td>Tubos,</td><td>Tubos Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>15 mL Tubos de 15 mL</td></tr><tr><td>, Tubos de 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Frascos criogênicos de 2,0 mL Nalgene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V5007</td><td>Cryovials</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td>Distribuidor</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Notas</td></tr><tr><td>pLV_hEF1a_rtTA3</td><td>Addgene</td><td>61472</td><td>Gentil presente de Ron Weiss</td></tr><tr><td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td><td>Addgene</td><td>61474</td><td>Gentil presente de Ron Weiss</td></tr><tr><td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivírus</td><td>Takara Bio</td><td>631983</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Sequence (forward)</td><td>Sequence (reverse)</td><td>Source</td></tr><tr><td>iPSC pluripotency</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4 (ID 4505967a1)</td><td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td><td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NANOG (ID 153945815c3)</td><td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td><td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>REX1 (ID 89179322c1)</td><td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td><td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NGN2 neurônios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 (ID 87578393c1)</td><td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td><td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>BRN2 (ID 380254475c1)</td><td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td><td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>CUX2 (ID 291045458c2)</td><td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td><td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td><td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td><td>CTCACAGCGATAAAGTGCCCTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td><td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td><td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>mDA neurônios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH</td><td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTGTA</td><td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td><td>TCAGGACTGCTACAGCCA</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><<tr><td>strong>Genes de limpeza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td><td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td>OAZ1</td><td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td><td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td>RPLPO</td><td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td><td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td>RPL13A</td><td>GCCTACAAGAAAAGTTTGCCTATC</td><td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTCTCTCC</td><td>NCBI primer-BLAST</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Media e Reagentes</td><td>Distribuidor</td><td>Número de Catálogo<</td><td>strong>Concentração de uso</td></tr><tr><td>Matriz de revestimento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matriz extracelular (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>10 &mu; g / mL</td></tr><tr><td>de fibronectina</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>5 - 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>de poli-L-ornitina (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>0,1 mg/mL</td></tr><tr><td><forte>Meio de cultura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>meio de cultura iPSC (meio Essential 8 Flex)</td><td>Neurônios Gibco</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>NGN2 - meio NGN2</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>0,909 mL (50 &micro; M)</td></tr> <tr><td>Suplemento B27</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL (1%)</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31331093</td><td>484,75 mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL (2 mM)</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>0,25 mL (2,5 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>5 mL (0,5%)</td></tr><tr><td>Suplemento de N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>5 mL (0,5%)</td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>485 mL</td></tr><tr><td><forte>mDA neurônios - <SRM médio/forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>0,5 mL (55 &micro; M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL (2 mM)</td></tr><tr><td>Knockout DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>409,5 mL</td></tr><tr><td>Reposição de soro knockout (reposição de soro)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>75 mL (15%)</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais MEM</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>5 mL (1%)</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL (1%)</td></tr><tr><td><forte>mDA neurônios - N2 médio</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL (2%)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL (2 mM)</td></tr><tr><td>Suplemento de N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>5 mL (1%)</td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>475 mL</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL(1%)</td></tr><tr><td><forte>mDA neurônios - Meio de diferenciação</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL (2%)</td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>485 mL</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL (1%)</td></tr><tr><td><forte>NGN2 neurônios - Suplementos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>CHIR99021 (CHIR)</td><td>R& D</td><td>4423/10</td><td>2 &mu; M</td></tr><tr><td>Doxicilina (dox)</td> <td>Sigma</td><td>D9891</td><td>2.5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>de Fator Neurotrófico Derivado da Glial (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/mL</td></tr> de <tr><td>ácido L-ascórbico 2-fosfato magnésio (AA2)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>64 mg/L</td></tr><tr><td>Fator neurotrófico-3 (NT-3)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Purmorlamina (PMA)</td><td>Cayman</td><td>10009634</td><td>0,5 &mu; M</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma</td><td>P8833-10MG</td><td>0.5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>de Tiazovivin</td><td>Merk Millipore</td><td>420220-10MG</td><td>2 &mu; </td></tr><tr><td>Neurônios MmDA - Suplementos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>CHIR99021 (CHIR)</td><td>R& D</td><td>4423/10</td><td>3 &mu; M</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Cayman</td><td>13197</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>Dibutiril-cAMP (db-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento de Fibroblastos 8B (FGF-8b)</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Fator Neurotrófico Derivado de Glial (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico (AA1)</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>0,2 mM</td></tr><tr><td>LDN193189 (LDN)</td><td>Cayman</td><td>11802</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Purmorlamina (Purm)</td><td>Cayman</td><td>10009634</td><td>2 &mu; M</td></tr><tr><td>Sonic Hedgehog/SHH (C24II) N-Terminus (SHH)</td><td>R& D</td><td>1845-SH</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>SB431542 (SB)</td><td>Cayman</td><td>13031</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Transformador tipo &szlig; 3 (TGF&szlig; 3)</td> <td>R & D</td><td>243-B3</td><td>1 ng/mL</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Cayman</td><td>10005583</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>Reagentes de dissociação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente de dissociação de célula única (StemPro Accutase)</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>1x</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Gibco</td><td>11575020</td><td>0,5 mM</td></tr><tr><td>RNA isolamento e kit de cDNAkit de isolamento Qiagen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>74106</td><td>Tampão de lise de RNA Rneasy MiniKit</td></tr><tr><td>Tampão</td> de lise <td>de 15596018</td> Trizol da <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>(tampão de lise de RNA )</td></tr><tr><td>Transcriptase reversa (kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080-085</td><td>SuperScript III Transcriptase</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> reversa <tr><td>Software</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Descrição/Aplicação</td></tr><tr><td>Cell Culture Framework (CCF) (interface gráfica do usuário, GUI)</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Interface</td><td>de usuário personalizada para o sistema automatizado</td></tr><tr><td>Software CellPathFinder (software de análise de imagem 1)</td><td>Software Yokogawa</td><td>CellPathfinder HCS</td><td>Ferramenta de análise de imagem</td></tr><tr><td>Sistema de Medição CellVoyager</td><td>Yokogawa</td><td>Incluído com CellVoyager 7000</td><td>Software de controle de microscópio </td></tr><tr><td>Software Columbus (software de análise de imagem 2)</td><td>Perkin Elmer</td><td>Columbus</td><td>Ferramenta de análise de imagem</td></tr><tr><td>Aplicativo qPCR baseado em nuvem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Themo Fisher nuvem</td><td>Software de análise para dados qRT-PCR</td></tr><tr><td>Venus software</td><td>Hamilton Robotics</td><td>VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software</td><td>Software de controle para o sistema automatizado </td></tr></tbody></table>

produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

A cultura manual e os protocolos de diferenciação para células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) são difíceis de padronizar, mostram alta variabilidade e são propensos à diferenciação espontânea em tipos de células indesejadas. Os métodos são intensivos em mão-de-obra e não são facilmente favoráveis a experimentos em larga escala. Para superar essas limitações, desenvolvemos um sistema automatizado de cultura celular acoplado a um sistema de imagem de alto rendimento e implementamos protocolos para manter múltiplas linhas hiPSC em diferenciação paralela e neuronal. Descrevemos a automação de um protocolo de diferenciação de curto prazo usando a superexpressão neurogenin-2 (NGN2) para produzir neurônios corticais derivados do hiPSC dentro de 6\u20128 dias, e a implementação de um protocolo de diferenciação de longo prazo para gerar neurônios dopaminérgicos do cérebro médio derivados do cérebro (mDA) derivados de hiPSC dentro de 65 dias. Além disso, aplicamos a abordagem NGN2 a uma pequena célula precursora neural derivada de moléculas (smNPC) transduzidas com lentivírus GFP e estabelecemos um ensaio de crescimento de neurite automatizado de células vivas. Apresentamos um sistema automatizado com protocolos adequados para a cultura hiPSC de rotina e diferenciação em neurônios corticais e dopaminérgicos. Nossa plataforma é adequada para cultura viva-voz de longo prazo e alto teor/alta taxa de hiPSC com base em hiPSC, exibições RNAi e CRISPR/Cas9 para identificar novos mecanismos de doença e alvos de drogas.

Mostramos a automação das culturas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) e diferenciações neuronais compatíveis com imagens e análises automatizadas.

Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

O objetivo geral deste estudo é mostrar como implementar procedimentos automatizados para a cultura e diferenciação de células IPS humanas em linhagens neuronais, bem como suas imagens automatizadas. Procedimentos automatizados padronizados permitem baixa variação experimental, garantindo alta reprodutibilidade fenotípica. Além disso, o sistema pode ser adaptado para o desenvolvimento de novos protocolos.Os procedimentos serão Joachim Tager e Elisangela Bressan, pós-doutores do nosso laboratório. Na interface gráfica do usuário do sistema automatizado, clique na visualização do processo de instrumento de recurso e selecione o processo de instrumento de recurso. Clique no processo de instrumento de execução e execute os processos hepa e recarga executados.Selecione os recursos a serem carregados, abra a porta e carregue as placas de cultura celular e as pontas descartáveis nas posições apropriadas, conforme indicado pelas imagens popup. Em seguida, descontaminar a porta com 70% de etanol antes de fechar e executar o processo de descontaminação. O sistema será esterilizado por radiação UV por 30 minutos.Para carregar as placas com meio de cultura ou reagente de dissociação, execute a etapa do capô hepa e abra a porta da estação de manuseio líquido. Após a descontaminação com 70% de etanol, coloque os reservatórios no convés para a posição atribuída e descobrilá-los. Feche a porta da estação de manuseio de líquidos e execute o processo de instrumento de recurso InitHepaHood para desligar o capô HEPA.Para executar um método de cultura automatizado, na visualização do calendário da interface gráfica do usuário, clique em adicionar etapa de processo e selecione a linha celular a ser usada no experimento. Use o assistente para selecionar o projeto e marque o lote a ser usado. Clique na seta direita e navegue até a próxima página do assistente para selecionar a etapa do processo a ser executada.Na última página do assistente, agende o experimento e defina os parâmetros apropriados para detalhar as variáveis necessárias para a execução do método. Em seguida, clique em OK. Depois de carregar um tubo de 50 mililitros com a suspensão celular IPS humana, carregue placas de cultura revestidas para receber as células na prateleira e execute a semeadura de placas a partir do método de tubos. Para contar as células do cítmetro de imagem Brightfield, prepare automaticamente uma placa de contagem de 384 poços com suspensão celular no convés e use o braço robótico para transferir a placa de contagem de 384 poços do convés para o citómetro de imagem Brightfield.Após a contagem, o sistema devolverá a placa à sua posição original e transferirá uma cultura revestida ou placa de ensaio da prateleira para o deck de tubulação. Em seguida, o sistema semeará as células no número definido pelo usuário e volumes adequados para a placa e misturará por pipetação. Após a semeadura, a placa será movida para o agitador no convés por 10 segundos a 500 rotações por minuto para distribuição celular antes de ser transferida para a incubadora de dióxido de carbono.Para avaliar a confluência automatizada, execute o método de confluência de verificação e selecione um lote que contenha pelo menos uma placa de cultura e nenhuma placa de ensaio. Na seção de detalhes dos parâmetros, digite iPSCf_2020 para aquisição de imagens nas configurações de análise de imagem. Em seguida, o sistema transferirá a primeira placa da incubadora para o cítmetro de imagem Brightfield e a imagem da confluência celular.Para alterar a cultura celular ou a mídia de placas de ensaio, execute a mudança de mídia do método de placas de cultura e selecione um lote contendo apenas placas de cultura. O sistema transferirá as placas para o convés e inclinará as placas para permitir a aspiração do supernatante. O supernasário será descartado no módulo de coleta de resíduos e descartará as pontas e 12 mililitros de meio fresco serão adicionados a cada placa.Em seguida, o sistema recobrirá as placas e devolverá as placas à incubadora de cultura celular. Alternativamente, para alterar o meio das placas de ensaio, execute a mudança de mídia do método de placas de ensaio. Para subcultivar as células, execute a subcultivação do método de células aderentes e selecione o lote contendo as placas de cultura que precisam de subcultivação.Depois de descartar o meio, o sistema lavará as células uma vez com oito mililitros de PBS por placa antes de adicionar oito mililitros de 0,5 mililitros EDTA às células. Após oito minutos no convés com opção de inclinação, o EDTA será substituído por 12 mililitros de meio fresco por placa. O sistema vai agitar as placas a 2.000 revoluções por minuto durante um minuto para desalojar as colônias antes de triturar as células com cinco ciclos de tubulação para quebrar as colônias em 50 a 80 mícrons.As células serão então transferidas para um tubo de 50 mililitros no convés antes de semeá-las em uma proporção de uma a sete divisões. Para conteúdo automatizado de alto conteúdo, imagens de células de alto rendimento, execute o método de imagem e selecione um lote que contenha pelo menos uma placa de ensaio e nenhuma placa de cultura. Em seguida, o sistema transferirá uma placa de ensaio para o microscópio confocal automatizado para imagens.Certifique-se de selecionar os IDs de lote e placa corretos enquanto executa as etapas de processo necessárias. As culturas hiPSC devem ser monitoradas diariamente para o crescimento e analisadas por sua porcentagem de confluência no citômetro de imagem Brightfield. Após a passagem e a cultura manual ou automatizada do sistema, as células exibem uma expressão típica de marcador de células-tronco e pluripotência.Neurônios diferenciados no sistema de cultura automatizada demonstram uma organização de morfologia e rede neuronal semelhante aos neurônios cultivados manualmente. Após seis dias de diferenciação, os neurônios cortical automaticamente diferenciados são positivos para a beta-tubulina de classe III específica do neurônio e a expressão do marcador de camada cortical superior. Após oito dias, as células também expressaram proteína associada a microtúbulos 2, a molécula de adesão de células neurais e a sinapssina I, bem como marcadores de neurônio cortical.Muito baixo ou nenhuma expressão desses marcadores é observada em hiPSC. Este sistema também pode ser usado para estabelecer um ensaio de extensão de neurite automatizado de células vivas que permite que os comprimentos de neurite sejam medidos ao longo de 11 dias de diferenciação sem intervenção manual. O uso do sistema de cultura automatizado para realizar mudanças médias durante um período de cultura de 65 dias facilita a diferenciação hiPSC em neurônios dopaminérgicos de cérebro médio com a organização celular e morfologia esperadas.Além do crescimento do neurite, outros ensaios fenotípicos automatizados relevantes para estudar neurodegeneração, por exemplo, focos de RNA de translocação TDP-43 e captação fibril alfa-sinucleína, podem ser explorados usando este alto rendimento, alto formato de conteúdo.

automated-production-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Os protocolos para a diferenciação neuronal de células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) são muitas vezes demorado e requer habilidades substanciais cultura de células. Aqui, nós adaptamos um procedimento de diferenciação pequena molécula baseada em um formato de placa de multititre, permitindo a geração de simples, rápido e eficiente de neurônios humanos de uma maneira controlada.

Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

Este vídeo demonstra um método para diferenciar células progenitoras neurais humanas (NPCs) em neurônios. Os NPCs são introduzidos em uma co-cultura estabelecida de neurônios corticais de astrócitos de camundongos e ratos, promovendo a diferenciação de NPCs em neurônios. A diferenciação é confirmada pela visualização das células sob um microscópio confocal.

Uma técnica de co-cultura para diferenciar células progenitoras neurais humanas em neurônios

O vídeo demonstra um método para gerar neurônios corticais excitatórios a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Após a indução da doxiciclina, as hiPSCs superexpressam a neurogenina-2, um fator de transcrição neural-específico. Ao usar meios específicos e co-cultura com astrócitos, esse processo facilita a diferenciação dos hiPSCs em neurônios com conexões sinápticas.

Diferenciando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em neurônios em matrizes de microeletrodos

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Nós modificar e implementar um protocolo publicado anteriormente descrevendo a diferenciação rápida, reprodutível e eficiente dos humanos pluripotentes induzidas (células-tronco hiPSCs) em neurônios corticais excitatórios 12. Especificamente, nossa modificação permite o controle da densidade de células neuronais e uso em matrizes de micro-eléctrodos para medir as propriedades eletrofisiológicas no nível da rede.

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para ressusciar e cultivar os neurônios derivados humanos da pilha de haste que foram diferenciados previamente dos progenitores neural in vitro por semanas múltiplas. O procedimento facilita os ensaios com base em imagens de neuritos, sinapses e marcadores neuronais de expressão tardia em um formato compatível com microscopia de luz e triagem de alto conteúdo.

Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Descrevemos um método para diferenciar astrócitos e neurônios derivados pluripotentes induzidos por humanos da medula espinhal e sua co-cultura para registro eletrofisiológico.

Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas

Os sistemas de diferenciação de células-tronco pluripotentes (PSC) para células funcionais disponíveis são atualmente impedidos por problemas de variabilidade severa linha a linha e lote a lote. Aqui, usando a diferenciação cardíaca como exemplo principal, apresentamos um protocolo para monitorar e modular de forma inteligente o processo de diferenciação de CEP com base em aprendizado de máquina baseado em imagem.

Uma estratégia de aprendizado de máquina baseada em imagem de células vivas para monitorar a diferenciação de células-tronco pluripotentes

Aprenda a diferenciação automatizada de neurônios corticais e dopaminérgicos a partir de hiPSCs humanos com monitoramento de células vivas. Este método padronizado garante alta reprodutibilidade fenotípica para pesquisas em neurociência.

Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas (Vídeo) | JoVE Journal

Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

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