Isolamento e Cultivo de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea Mandibular em Ratos

Estudos mostraram que as BMSCs derivadas do osso craniano facial exibem capacidades superiores às dos ossos axiais e apendiculares. Portanto, as BMSCs mandibulares são consideradas o recurso preferido para o desenvolvimento de futuras terapêuticas de doenças craniofaciais. Este protocolo combina as vantagens da adesão da medula óssea total e da classificação de células fluorescentes para obter um número significativo de BMSCs mandibulares purificados em um curto espaço de tempo.

Se você está tentando este protocolo pela primeira vez, acho muito importante entender a estrutura anatômica e o movimento funcional da mandíbula do rato, o que pode ser alcançado assistindo a este vídeo ou lendo literatura relacionada. Depois de sacrificar o rato, coloque-o em uma capela limpa em decúbito dorsal. Incisar a pele e os músculos bucinadores do ângulo oral bilateral até a região posterior da mandíbula.

Abra a boca do rato empurrando os incisivos superiores e inferiores na direção oposta com os dois polegares, para expor os dentes mandibulares, que estão presos à mandíbula. Desconecte completamente os músculos bucais e os tendões ligados aos coracóides e à borda inferior da mandíbula. Em seguida, pressione os dentes posteriores inferiores e gire-os para trás e para baixo até que os côndilos de ambos os lados estejam claramente expostos.

Separe o corpo da mandíbula do crânio e limpe o tecido mole de aderência na superfície óssea usando uma gaze úmida. Coloque o osso em um prato de vidro estéril de 10 centímetros cheio de alfa médio essencial mínimo pré-resfriado, ou PBS no gelo, para preservar a viabilidade. Corte o osso anterior ao longo da borda mesial do primeiro molar do corpo mandibular e, em seguida, remova o ramo mandibular, incluindo o coracoide e o côndilo, ao longo da borda distal do terceiro molar para expor a cavidade medular.

Encha um prato de vidro estéril de 10 centímetros com 10 mililitros de alfa-MEM com 10% de FBS. Aspire o meio com uma seringa de 10 mililitros, insira a agulha na cavidade da medula óssea e lave repetidamente a medula óssea no prato. Nivele a cavidade óssea pelo menos três vezes nos lados mesial e distal do osso, respectivamente, até que o osso fique branco.

Transferir o meio que contém as células lavadas para um tubo de centrifugação de 15 mililitros e centrifugar a 800 RPM e durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com três mililitros de alfa-MEM com 10% de FBS. Coloque as células em uma nova placa de cultura de 10 centímetros e incuba-as a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono.

Aspire o meio de cultura e lave o prato com PBS. Adicione dois mililitros de 0,25% de tripsina com 0,02% de EDTA no prato e digerir as células a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione quatro mililitros de alfa-MEM com 10% de FBS para interromper a reação.

Transferir a suspensão celular para um tubo de centrifugação de 15 mililitros e centrifugá-lo a 800 RPM durante cinco minutos. Ressuspender as células em 120 microlitros de PBS com 10% de FBS após centrifugação. Transfira 100 microlitros da suspensão celular para um novo tubo de microcentrífuga.

Bloqueie as suspensões celulares com um microlitro de anticorpo contra CD16 a CD32 a quatro graus Celsius por 15 minutos e cove as células com anticorpo conjugado com PE contra CD45, anticorpo conjugado com FITC contra CD90 e anticorpo APC contra CD29, a quatro graus Celsius por uma hora no escuro. Use os outros 20 microlitros de suspensão celular como controle negativo não corado. Centrifugue os tubos a 800 RPM durante cinco minutos.

Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 0,5 mililitros de PBS com 10% de FBS. Adicione 10 microlitros de 0,01 miligramas por mililitro DAPI 10 minutos antes da análise. Use filtros de 40 nanômetros colocados em tubos de centrífuga para filtrar as células e, em seguida, analise as células em um classificador de células ativado por fluorescência.

Primeiro, remova as células mortas da contagem total de células bloqueando células DAPI negativas e, em seguida, bloqueie CD29 positivo, CD90 positivo, CD45 negativo, nas células selecionadas como mBMSCs direcionados. Colete os mBMSCs classificados em um tubo de centrífuga de 15 mililitros com cinco mililitros de alfa-MEM com 10% de FBS. Centrifugue os tubos a 800 RPM durante cinco minutos e retire o tampão de recolha.

Adicione um mililitro de meio fresco para ressuspender as células e, em seguida, coloque-as em uma placa de cultura de seis centímetros. Usando esse protocolo, uma grande proporção de células aderiu à placa no terceiro dia após a cultura inicial. Após mais três a quatro dias de cultura, a confluência celular atingiu 70 a 80%A classificação de células fluorescentes foi usada para purificar mBMSCs, que representaram cerca de 81,1% nas células P0.

Após o cultivo de mBMSCs P2 em uma placa de seis poços por uma semana, uma quantidade significativa de unidades formadoras de colônias foi observada. Para avaliar a capacidade de diferenciação de múltiplas linhagens das mBMSCs, elas foram induzidas em osteo-condro e adipo-linhagens. O aumento da atividade de ALP, nódulos calcificados vermelhos sob coloração com vermelho de alizarina e aumento da expressão dos genes osteogênicos específicos Runx2, Alp, Bsp e Ocn indicaram indução osteogênica.

A coloração óleo-vermelho-O foi usada para identificar a adipogênese. Numerosos vacúolos ricos em lipídios foram evidentes após nove dias de indução. Além disso, a expressão dos genes específicos adipogênicos Ppar-gama-1 e Cebpa foi aumentada.

As amostras apresentaram coloração positiva para azul de Alcian durante a observação microscópica da diferenciação condrogênica. Além disso, a imunomarcação com anticorpo anti-colágeno tipo II mostrou maior acúmulo de matriz cartilaginosa. Garantir a viabilidade dos mBMSCs é muito importante neste protocolo.

Esse objetivo pode ser alcançado escolhendo o animal experimental adequado, operando no gelo e encurtando o tempo experimental. Utilizando este modelo in vitro, pode-se obter um grande número de BMSCs mandibulares proliferativas, o que pode facilitar o estudo das características biológicas, a reação subsequente ao microambiente e outras aplicações de BMSCs mandibulares.