Name: Isolamento e Cultivo de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea Mandibular em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar células-tronco mesenquimais de medula óssea mandibular em ratos usando adesão de medula óssea e citometria de fluxo. Este método eficiente purifica células para pesquisa em doenças craniofaciais.

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Agradecemos pela ajuda do Laboratório de Estomatologia Digitalizada e Centro de Pesquisa para Anomalias Craniofaciais do Hospital do Nono Povo de Xangai. O trabalho deste manuscrito é apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, o fundo SHIPM-mu do Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai No People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], o Projeto de Incentivo da Equipe de Inovação de Alto Nível para a Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. E L.J. é um estudioso dos Talentos Médicos Da Juventude, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program e o projeto "Chen Xing" da Universidade de Xangai Jiaotong.

Todos os procedimentos experimentais animais neste artigo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais do Hospital do Nono Povo de Xangai, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.
1. Preparação
<ol><li>Use dois ratos de 5 semanas de idade, Sprague Dawley, para o experimento.</li>
	<li>Esterilize todos os instrumentos, incluindo porta-agulhas, pinças e tesouras em alta temperatura ou imerso em 75% de etanol por 10 minutos. NOTA: A imersão do etanol não deve demorar muito para evitar danos celulares.</li>
	<li>Prepare previamente os meios de comunicação culturais, da qual a composição está prevista na Tabela 1. Suplemente cada meio descrito abaixo.<ol>
<li>Preparação de α-MEM médio cultural (com 10% FBS): Suplementação mínimo de alfa médio essencial mínimo (α-MEM) com soro bovino fetal de 10% e 1% penicilina e estreptomicina.</li>
		<li>Preparação do meio de diferenciação osteogênica: Suplemento de diferenciação osteogênica meio basal com soro bovino fetal de 10%, 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 0,20% ácido ascórbico, 1% β-glicosfatosfato e 0,01% de dexametasona.</li>
		<li>Preparação do meio de indução osteogênica: Misture 70% α-MEM meio de cultura (com 10% FBS) e 30% de meio de diferenciação osteogênica.</li>
		<li>Preparação do meio de diferenciação adipogênica A: Suplemento de diferenciação adipogênica meio basal com soro bovino fetal de 10%, 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 0,20% insulina, 0,10% IBMX, 0,10% Rosiglitazone e 0,01% Dexametasona.</li>
		<li>Preparação do meio de diferenciação adipogênica B: suplemento de diferenciação adipogênica meio basal com soro bovino fetal de 10%, 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina e 0,20% insulina.</li>
		<li>Preparação do meio de diferenciação condrogênica: Suplemento de diferenciação condrogênica meio basal com 0,01% Dexametasona, 0,30% Ácido ascórbico, 1% ITS, 0,10% piruvato de sódio, 0,10% Proline e 1% TGF-β3. NOTA: O meio de diferenciação osteogênica deve ser utilizado dentro de um mês após a configuração. O período efetivo do meio de diferenciação condrogênica configurado é de 12 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolamento e cultivo de mBMSCs de ratos
NOTA: Todas as operações experimentais devem ser realizadas no gelo o máximo possível para manter a viabilidade celular.
<ol><li>Colhendo mandíbulas de rato<ol>
<li>Eutanize dois ratos de 5 semanas de idade, Sprague Dawley, por asfixia de CO2. Certifique-se de que a respiração do animal está parada antes de prosseguir com o experimento.</li>
		<li>Enxágüe esses ratos em um béquer contendo 75% de etanol por 3 min.</li>
		<li>Coloque o rato dentro de um capô de fumaça limpa para colher mandíbulas. NOTA: Esterilize a capa de fumaça por radiação de luz ultravioleta por 30 minutos antes de usar.</li>
		<li>Coloque o rato em uma posição supina. Incisar as peles e os músculos do buccinador desde anguluss bilaterais oris até a região posterior da mandíbula, que é o único osso móvel com incisivo inferior. NOTA: Recomenda-se fazer uma incisão de 2 cm em cada lado do angulus oris para obter um campo de operação claro.</li>
		<li>Abra a boca do rato empurrando os incisivos maxilares e mandibulares na direção oposta com ambos os polegares para expor os dentes mandibulares, que estão ligados à mandíbula.</li>
		<li>Desconecte completamente os músculos buccal e os tendões ligados aos coracoides e à borda inferior da mandíbula. NOTA: Observa-se um aumento da mobilidade da mandíbula durante esta etapa devido à falta de tensão muscular.</li>
		<li>Pressione os dentes posteriores mandibulares e gire para trás e para baixo até que os condyles de ambos os lados estejam claramente expostos. NOTA: Este passo é realizado para abrir artificialmente a boca do rato na medida do possível para deslocar o condíle. A mandíbula está conectada ao crânio através de condyles bilaterais, então a exposição dos condyles leva à desconexão entre o crânio e a mandíbula.</li>
		<li>Separe o corpo da mandíbula do crânio.</li>
		<li>Limpe o tecido mole aderente na superfície óssea usando uma gaze molhada.</li>
		<li>Coloque o osso em um prato de vidro estéril de 10 cm cheio de α mínimo essencial pré-cozido (α-MEM) ou salina tampão fosfato (PBS) no gelo para preservar a viabilidade.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento e cultivo dos mBMSCs<ol>
<li>Corte o osso anterior ao longo da borda mesial do primeiro molar do corpo mandibular. Remova o ramus mandibular, incluindo coracoide e condíle ao longo da borda distal do terceiro molar para expor a cavidade da medula.</li>
		<li>Encha um prato de vidro estéril de 10 cm com 10 mL de α-MEM (com 10% de FBS).</li>
		<li>Use seringa de 1 mL para aspirar α-MEM. Com a agulha de seringa inserida na cavidade da medula óssea, lave repetidamente a medula óssea no prato. Lave a cavidade óssea pelo menos 3 vezes dos lados mesial e distal do osso, respectivamente, até que o osso ficou branco. NOTA: Este é o passo mais crítico, pois a cavidade da medula óssea de uma mandíbula de rato não é tão óbvia quanto no osso longo e o ponto adequado para inserir a agulha precisa ser determinado empiricamente. Todas as amostras experimentais acima devem ser armazenadas no gelo para manter a viabilidade celular e, portanto, o tempo de operação não deve ser superior a 2 h.</li>
		<li>Transfira a mídia contendo as células lavadas em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 800 x g em 4 °C por 5 min. Descarte o supernaspeso.</li>
		<li>Resuspense as células com 3 mL de α-MEM (com 10% de FBS). Coloque as células em um novo prato de cultura de 10 cm e incubar a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2.</li>
		<li>Verifique as mudanças morfológicas e o crescimento dessas células no 3º dia de cultura. Remova o meio de cultura com células não aadeentes e fragmentos de tecido. Adicione suavemente 10 mL de α-MEM fresco (com 10% de FBS).</li>
		<li>Após 7 dias de cultura, os P0 mBMSCs atingiram 70% a 80% de confluência.</li>
	</ol></li>
	<li>Classificação de células de fluxo NOTA: Os P0 mBMSCs foram identificados fenotipicamente e purificados principalmente através da triagem de células de fluxo.<ol>
<li>Aspire e descarte o meio de cultura e depois lave o prato com PBS. Descarte o PBS.</li>
		<li>Adicione 1 mL de 0,25% de trippsina com 0,02% de EDTA no prato. Digerir as células a 37 °C por 5 min, depois adicione 2 mL de α-MEM (com 10% de FBS) para parar a reação.</li>
		<li>Transfira a suspensão das células para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 800 x g por 5 min.</li>
		<li>Resuspensar as células em 120 μL de PBS (com 10% de FBS) após centrifugação.</li>
		<li>Bloqueie estas suspensões celulares com 1 μL de anticorpo contra CD16/CD32 a 4 °C por 15 min.</li>
		<li>Transfira 100 μL da suspensão celular para um novo tubo de microcentrífuga, colorir as células com anticorpo conjugado Phycoerythrin (PE) contra CD45, anticorpo conjugado fluoresceína (FITC)contra CD90 e Allophycocyanin (APC)-anticorpo contra CD29 a 4 °C por 1 h no escuro13,15. A concentração de anticorpos utilizados neste experimento é mostrada na Tabela 2. Use os outros 20 μL de suspensão celular como controle negativo não manchado.</li>
		<li>Em seguida, centrifugar os tubos a 800 x g por 5 min, descartar a suspensão e resuspensar as células em 0,5 mL de PBS (com 10% de FBS).</li>
		<li>Adicione 10 μL de 0,01 mg/mL DAPI por 10 minutos antes da análise.</li>
		<li>Use filtros de 40 nm colocados em tubos de centrífuga para filtrar as células.</li>
		<li>Analise as células do Sorter celular ativado pela Fluorescência. Coloque os painéis da seguinte forma. Em primeiro lugar, remova as células mortas da contagem total de células, gating DAPI- células, depois portão CD29+CD90+CD45- nas células selecionadas como mBMSCs direcionados.</li>
		<li>Colete as células cd29+CD90+CD45classificadas em um tubo de centrífuga de 15 mL com 3 mL de α-MEM (com 10% FBS) pré-preparados.</li>
		<li>Centrifugar os tubos a 800 x g por 5 min. Remova o buffer de coleta e adicione 1 mL de α-MEM fresco (com 10% de FBS) para resuspensar as células. Em seguida, emplaque-los em um prato de cultura de 6 cm.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Capacidade de formação de colônias
NOTA: Esta etapa foi realizada para verificar a capacidade de divisão dos mBMSCs. 15
<ol><li>Selecione mBMSCs de segunda passagem (P2) para este experimento. Quando a confluência celular atingiu 80% a 90%, reseed as células em um gradiente serial em uma placa de 6 poços para avaliar sua capacidade de proliferação clonal. NOTA: Recomenda-se definir o gradiente de 1 x 102 a 1 x 103 células por poço, mas as diluições finais de diferentes linhas celulares de origem humana ou animal foram empiricamente determinadas.</li>
	<li>Cultura as células em α-MEM (com 10% de FBS) por aproximadamente duas semanas até que um bom número de unidades formadoras de colônias pudesse ser visto sob microscópio leve. Refrescar o meio de cultura a cada 3 dias.</li>
	<li>Aspire e descarte o meio de cultura, lave os poços com PBS duas vezes por 5 minutos de cada vez. Em seguida, adicione 4% de solução de paraformaldeído a cada poço e fixe por pelo menos 10 min.</li>
	<li>Retire o paraformaldeído e enxágue os poços duas vezes com PBS.</li>
	<li>Manche as células com solução de coloração violeta cristalina e incuba-as em 37 °C por cerca de 10 minutos. NOTA: O tempo de coloração ajustado adequadamente até que a sombra desejada seja alcançada.</li>
	<li>Remova a solução de coloração e lave as amostras com água destilada para impedir a reação.</li>
	<li>Imagem sob um estereómico e contar colônias de células dispersas que consistiam de pelo menos 50 células.</li>
</ol>4. Diferenciação de multilineagem de mBMSCs
NOTA: Os P2 mBMSCs foram usados para experimentos subsequentes, a menos que descritos de outra forma.
<ol><li>Indução osteogênica de mBMSCs<ol>
<li>Digerir os mBMSCs conforme descrito acima. Células de sementes a uma densidade de 2,5 x 105/cm2 em uma placa de 12 poços suplementadas com 1 mL α-MEM (com 10% FBS).</li>
		<li>Quando a confluência celular atingiu 60-70%, mude o meio para 30% de mídia de indução osteogênica. Cultuem as células com α-MEM (com 10% de FBS) como controle negativo e alterem o meio a cada 2 dias. NOTA: Depois que um grande bom número de nódulos de cálcio aparecerem durante a osteogênese, recomenda-se alterar o padrão de troca média para uma troca média de meio volume a cada 2 dias, para evitar que os osteoblastos flutuassem.</li>
		<li>Após a colheita por sete dias, avalie a calcificação dessas células por manchas alcalinas de fosfatase16,17.</li>
		<li>Remova o meio de cultura e fixe as células com 4% de paraformaldeído por 10 minutos. Enxágüe as células usando 1 mL de PBS por poço por 3 minutos duas vezes.</li>
		<li>Em seguida, colorir as células com solução alcalina de coloração de fosfatase e incubar a 37 °C por 10-30 min. NOTA: A incubação pode ser realizada durante a noite à temperatura ambiente para obter a cor necessária.</li>
		<li>Lave os poços com água destilada para parar a reação. Tire fotos sob microscópio leve. Grânulos pigmentados vermelhos representam atividade alcalina de fosfattase (ALP).</li>
		<li>Após a cultura das células restantes por mais 7 dias, realize a coloração vermelha alizarina para avaliar a capacidade de mineralização das células.</li>
		<li>Colorisse as células com solução de coloração vermelha de 0,5% após fixação celular por 10 min16,18. Pare a reação cromogênica com água destilada após 3-5 min. NOTA: O tempo de reação pode ser estendido dependendo da cor desenvolvida.</li>
		<li>Por fim, coloque a placa de cultura sob o microscópio de luz para observar o efeito da coloração osteogênica; nódulos vermelhos indicam depósitos de cálcio dessas células.</li>
	</ol></li>
	<li>Indução adipogênica de mBMSCs<ol>
<li>Seed P2 mBMSCs em uma placa de 12 poços como descrito acima.</li>
		<li>Após o bem se tornar 90% confluente, cultura as células com diferenciação adipogênica média A. Use células cultivadas em α-MEM meio de cultura (com 10% FBS) como controle negativo.</li>
		<li>Após 2 dias de indução, aspire o médio A do poço e adicione 1 mL de diferencial adipogênica médio B em cada poço.</li>
		<li>Depois de um dia, remova o médio B e inicie o ciclo novamente com o meio A adicionado de volta ao poço. Cultura as células alternadamente usando médio A e B.</li>
		<li>Aplique os meios de diferenciação A e B alternadamente por três ciclos e detecte a adipogênese dessas células por mancha O vermelha de óleo16,18. NOTA: Muitas gotículas redondas e grandes lipídicas podem ser observadas culminando com essas células com meio de diferenciação B por mais 2 a 3 dias.</li>
		<li>Retire o meio e fixe as células com 4% de paraformaldeído por 10 minutos. Lave as células com PBS.</li>
		<li>Colora as células com óleo vermelho Solução de coloração O e incubar a 37 °C por aproximadamente 3 min.</li>
		<li>Remova a solução de coloração e lave os poços com água destilada.</li>
		<li>Observe adipogênese sob microscópio leve.</li>
	</ol></li>
	<li>Indução de condronese de mBMSCs<ol>
<li>Semente P2 mBMSCs em tubo centrífuga de 15 mL a uma densidade de 5 x 105/cm2.</li>
		<li>Centrifugar os tubos a 300 x g por 5 min. Descarte o supernaspeso.</li>
		<li>Resuspense as células com 0,5 mL de meio de diferenciação condrogênica. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min.</li>
		<li>Solte a tampa do tubo de centrífuga e incuba-o a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2. Renove o meio a cada 2 dias. NOTA: As células começam a ser pelotas após 24h. Recomenda-se não mover o tubo centrífuga por 48 h. Tenha cuidado para não aspirar a pelota celular ao trocar o meio.</li>
		<li>Após 21 dias de indução, fixar as pelotas celulares com 4% de paraformaldeído, seguida de desidratação, incorporação de parafina e secção.</li>
		<li>Após a desparafinação e hidratação, manche os slides em solução azul alciana por pelo menos 15 min18,19,20,21, depois lave com água destilada para parar a reação. Capture as fotografias sob microscópio leve.</li>
		<li>Para coloração imunofluorescente do colágeno tipo II, realize as etapas abaixo.<ol>
<li>Incubar os slides com 5 μg/mL proteinase K por 15 min a 37 °C após a desparafinação e a hidratação.</li>
			<li>Incubar os slides no tampão de bloqueio por 1h a 37 °C.</li>
			<li>Aplique 1 μL de anticorpo tipo 2 de colágeno em 200 μL de tampão de bloqueio para os slides e incubar durante a noite a 4 °C.</li>
			<li>No dia seguinte, lave os slides com PBS duas vezes e incubar com anticorpos secundários a 37 °C por 1h.</li>
			<li>Incubar as fatias com 40,6-diamidino-2-fenilômado (DAPI) por 10 minutos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tire fotos de cada slide sob microscopia de fluorescência.</li>
	</ol></li>
</ol>5. PCR em tempo real
<ol><li>Extrair RNA total de mBMSCs usando um reagente comercialmente disponível com isothionato à base de guanidium.</li>
	<li>Realize a transcrição reversa do RNA em DNA complementar usando um kit comercialmente disponível. As condições de reação da transcrição reversa foram as seguintes: 65 °C para 5 min, 37 °C para 15 min, 85 °C para 15 s.</li>
	<li>Execute o PCR em tempo real para detectar genes específicos de osteogênese e adipogênese usando primers listados na Tabela 3. O procedimento de amplificação do PCR foi o seguinte: 95 °C para 5 min. 95 °C para 5 s, 60 °C para 30 s para 40 ciclos.</li>
</ol>

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<li>Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+protocol+for+long-term+culture+of+murine+bone+marrow+stromal%28mesenchymal%29+stem+cells+that+retained+their+in+vitro+and+in+vivo+stemness+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Proceedings+Online%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture.</a> Biology Proceedings Online. 21, 3(2019).</li>
</ol>

Todos os autores afirmam que não têm conflitos de interesse.

Este protocolo descreve um método para isolar BMSCs de mandíbulas de ratos in vitro, combinando a adesão total da medula óssea e a classificação celular fluorescente, que é uma maneira simples e confiável de obter mBMSCs proliferativos com forte capacidade de diferenciação. Este método poderia purificar preliminarmente os mBMSCs por classificação de células de fluxo, mas se houver requisitos mais elevados para homogeneidade celular, métodos de purificação mais precisos podem ser necessários.
A...

As células-tronco mesenquimais de medula óssea (BMSCs) são células-tronco não hematopoiéticas derivadas da medula óssea que manifestam forte capacidade de proliferação e potencial de diferenciação de multi-linhagem1,2,3,4. De fato, os BMSCs têm sido considerados como um candidato ideal para engenharia e regeneração de tecidos ósseos desde que foram descobertos. Durante anos, a crista ilíaca ou ossos longos, como a tíbia e o fêmur, têm sido a fonte mais comum de BMSCs para regeneração craniofacial. No entanto, os BMSCs orofacial, como os BMSCs mandibulares (mBMSCs), apresentam algumas diferenças em relação aos BMSCs longos, como diferentes padrões de origem embrionária e de desenvolvimento. As mandíbulas surgem de células de crista neural da camada germe neuroectoderm e sofrem ossificação intramembana, enquanto esqueletos axial e appendicular são do mesoderme e sofrem ossificação endocondral. Além disso, observações clínicas e estudos experimentais em animais têm consistentemente indicado que há diferenças funcionais entre os BMSCs orofacial e ilíaca5,6,7,8. Relatos mostraram que os BMSCs derivados de ossos craniofaciais como mandíbula, osso maxilar e osso alveolar apresentaram proliferação superior, tempo de vida e capacidade de diferenciação do que os dos ossos axiais e appendiculares9. os mBMSCs, portanto, são considerados os recursos preferidos para futuras aplicações terapêuticas de doenças craniofaciais como querubismo, tumor de mandíbula, osteoporose do osso da mandíbula e defeito do tecido periodontal10,11,12. Para entender o potencial de tratamento em experimentos pré-clínicos, é essencial estabelecer um método para isolar e culminar rapidamente os MBMSCs in vitro.
Neste estudo, o objetivo foi obter mBMSCs purificados por adesão integral da medula óssea e triagem de citometria de fluxo. A morfologia anatômica da mandíbula de rato, claramente observada através de tomografia microcomputífica (Micro-CT) e seções histológicas, mostrou que o osso trabecular da mandíbula estava entre o espaço medular incisivo e o osso alveolar. A medula óssea do osso trabecular foi lavada para obter células de medula mandibular, mas as células cultivadas dessa forma não eram mBMSCs puras e provavelmente consistiam em múltiplos tipos de células com potências incertas e diversas linhagens como células de células ósseas, gordas e endoteliais13,14. O próximo passo da purificação celular foi particularmente importante. A citometria de fluxo filtra as células reconhecendo uma combinação de proteínas da superfície celular e tem sido amplamente adotada no enriquecimento de células-tronco mesenquimais. A homogeneidade celular é a principal vantagem da citometria de fluxo, mas o processo não determina a viabilidade celular e pode resultar em um rendimento celular limitado. Neste estudo, os P0 mBMSCs obtidos a partir da adesão total da medula óssea foram classificados por citometria de fluxo para obtenção de mBMSCs com alta pureza e forte capacidade de proliferação.
Este estudo introduz um protocolo reprodutível e confiável para isolamento, cultura e diferenciação de BMSCs mandibulares de ratos usando uma combinação de adesão total da medula óssea e classificação de citometria de fluxo. É um método confiável e conveniente para pesquisadores em áreas relacionadas a usar.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1X)</td> <td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de 10 cm</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acutenáculo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de diferenciação adipogênica</td><td>Cyagen biosciences inc.</td><td>MUBMX-90031</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alizarin red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Desenvolvimento de Cor de Fosfatase Alcalina</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>alfa-Mínimo meio essencial</td><td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td><td>SH30265.01B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CollagenII Rabbit pAb</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos contra CD16/CD32</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antifade Meio de Montagem com DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0131</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-camundongo/rato CD29 Anticorpo biolegend</td><td>inc</td><td>102215</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança</td><td>Esco</td><td>AC2-4S8-CN</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Anticorpo Monoclonal (OX1), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0461-82</td><td></td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Anticorpo monoclonal (HIS51), FITC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>11-0900-85</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td>L500</td><td></td></tr><tr><td>Meio de diferenciação de condrogênese</td><td>Cyagen Biosciences Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contador de células automatizado</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração violeta de cristal</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0121</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG H & L (Alexa Fluor 488)</td> <td>abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Esco</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Magzol reagente (reagente Trizol)</td> <td>Magen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micropipettor</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de diferenciação osteogênica</td><td>Cyagen Biosciences Inc.</td><td>MUBMX-90021</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (1X)</td> <td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Kit</td><td>TakaRa Bio Inc</td><td>RR036A</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>QuickBlock Blocking Buffer</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>scissor</tr><tr><td>SYBR1 Premix</td><td>TakaRa Bio Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluidina Azul</td><td>Beyotime Biotecnologia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e cultivo de células-tronco mesenquimais de medula Óssea mandibular em ratos

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Aqui apresentamos um método eficiente para isolar e culminar células-tronco mesenquimais de medula óssea mandibular (mBMSCs) in vitro para obter rapidamente numerosas células de alta qualidade para requisitos experimentais. os mBMSCs poderiam ser amplamente utilizados em aplicações terapêuticas como células de engenharia tecidual no caso de doenças craniofaciais e regeneração cranio-maxilofacial no futuro devido à excelente capacidade de autoconexão e potencial de diferenciação de multi-linhagem. Por isso, é importante obter mBMSCs em grande número.
Neste estudo, a medula óssea foi liberada da mandíbula e os MBMSCs primários foram isolados através de todo o cultivo adepto da medula óssea. Além disso, CD29+CD90+CD45− mBMSCs foram purificados através da classificação celular fluorescente. A segunda geração de mBMSCs purificados foi utilizada para estudos mais aprofundados e apresentou potencial na diferenciação de osteoblastos, adipócitos e condrócitos. Utilizando esse modelo in vitro, pode-se obter um alto número de mBMSCs proliferativos, o que pode facilitar o estudo das características biológicas, a reação subsequente ao microambiente e outras aplicações de mBMSCs.

Usando este protocolo, uma grande proporção de células aderiu à placa no terceiro dia após a cultura inicial. Normalmente, após 3-4 dias adicionais de cultura, a confluência celular atingiu 70 a 80%(Figura 1B). Com classificação celular fluorescente, DAPI-CD29+CD90+CD45− mBMSCs foram purificados18,22, que representaram cerca de 81,1% nas células P0(Figura 1C).<...

Este artigo apresenta um método que combina a adesão total da medula óssea e a classificação da citometria de fluxo para isolar, cultivar, classificar e identificar células-tronco mesenquimais de medula óssea a partir de mandíbulas de ratos.

Isolamento e Cultivo de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea Mandibular em Ratos

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

Estudos mostraram que as BMSCs derivadas do osso craniano facial exibem capacidades superiores às dos ossos axiais e apendiculares. Portanto, as BMSCs mandibulares são consideradas o recurso preferido para o desenvolvimento de futuras terapêuticas de doenças craniofaciais. Este protocolo combina as vantagens da adesão da medula óssea total e da classificação de células fluorescentes para obter um número significativo de BMSCs mandibulares purificados em um curto espaço de tempo.Se você está tentando este protocolo pela primeira vez, acho muito importante entender a estrutura anatômica e o movimento funcional da mandíbula do rato, o que pode ser alcançado assistindo a este vídeo ou lendo literatura relacionada. Depois de sacrificar o rato, coloque-o em uma capela limpa em decúbito dorsal. Incisar a pele e os músculos bucinadores do ângulo oral bilateral até a região posterior da mandíbula.Abra a boca do rato empurrando os incisivos superiores e inferiores na direção oposta com os dois polegares, para expor os dentes mandibulares, que estão presos à mandíbula. Desconecte completamente os músculos bucais e os tendões ligados aos coracóides e à borda inferior da mandíbula. Em seguida, pressione os dentes posteriores inferiores e gire-os para trás e para baixo até que os côndilos de ambos os lados estejam claramente expostos.Separe o corpo da mandíbula do crânio e limpe o tecido mole de aderência na superfície óssea usando uma gaze úmida. Coloque o osso em um prato de vidro estéril de 10 centímetros cheio de alfa médio essencial mínimo pré-resfriado, ou PBS no gelo, para preservar a viabilidade. Corte o osso anterior ao longo da borda mesial do primeiro molar do corpo mandibular e, em seguida, remova o ramo mandibular, incluindo o coracoide e o côndilo, ao longo da borda distal do terceiro molar para expor a cavidade medular.Encha um prato de vidro estéril de 10 centímetros com 10 mililitros de alfa-MEM com 10% de FBS. Aspire o meio com uma seringa de 10 mililitros, insira a agulha na cavidade da medula óssea e lave repetidamente a medula óssea no prato. Nivele a cavidade óssea pelo menos três vezes nos lados mesial e distal do osso, respectivamente, até que o osso fique branco.Transferir o meio que contém as células lavadas para um tubo de centrifugação de 15 mililitros e centrifugar a 800 RPM e durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com três mililitros de alfa-MEM com 10% de FBS. Coloque as células em uma nova placa de cultura de 10 centímetros e incuba-as a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono.Aspire o meio de cultura e lave o prato com PBS. Adicione dois mililitros de 0,25% de tripsina com 0,02% de EDTA no prato e digerir as células a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione quatro mililitros de alfa-MEM com 10% de FBS para interromper a reação.Transferir a suspensão celular para um tubo de centrifugação de 15 mililitros e centrifugá-lo a 800 RPM durante cinco minutos. Ressuspender as células em 120 microlitros de PBS com 10% de FBS após centrifugação. Transfira 100 microlitros da suspensão celular para um novo tubo de microcentrífuga.Bloqueie as suspensões celulares com um microlitro de anticorpo contra CD16 a CD32 a quatro graus Celsius por 15 minutos e cove as células com anticorpo conjugado com PE contra CD45, anticorpo conjugado com FITC contra CD90 e anticorpo APC contra CD29, a quatro graus Celsius por uma hora no escuro. Use os outros 20 microlitros de suspensão celular como controle negativo não corado. Centrifugue os tubos a 800 RPM durante cinco minutos.Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 0,5 mililitros de PBS com 10% de FBS. Adicione 10 microlitros de 0,01 miligramas por mililitro DAPI 10 minutos antes da análise. Use filtros de 40 nanômetros colocados em tubos de centrífuga para filtrar as células e, em seguida, analise as células em um classificador de células ativado por fluorescência.Primeiro, remova as células mortas da contagem total de células bloqueando células DAPI negativas e, em seguida, bloqueie CD29 positivo, CD90 positivo, CD45 negativo, nas células selecionadas como mBMSCs direcionados. Colete os mBMSCs classificados em um tubo de centrífuga de 15 mililitros com cinco mililitros de alfa-MEM com 10% de FBS. Centrifugue os tubos a 800 RPM durante cinco minutos e retire o tampão de recolha.Adicione um mililitro de meio fresco para ressuspender as células e, em seguida, coloque-as em uma placa de cultura de seis centímetros. Usando esse protocolo, uma grande proporção de células aderiu à placa no terceiro dia após a cultura inicial. Após mais três a quatro dias de cultura, a confluência celular atingiu 70 a 80%A classificação de células fluorescentes foi usada para purificar mBMSCs, que representaram cerca de 81,1% nas células P0.Após o cultivo de mBMSCs P2 em uma placa de seis poços por uma semana, uma quantidade significativa de unidades formadoras de colônias foi observada. Para avaliar a capacidade de diferenciação de múltiplas linhagens das mBMSCs, elas foram induzidas em osteo-condro e adipo-linhagens. O aumento da atividade de ALP, nódulos calcificados vermelhos sob coloração com vermelho de alizarina e aumento da expressão dos genes osteogênicos específicos Runx2, Alp, Bsp e Ocn indicaram indução osteogênica.A coloração óleo-vermelho-O foi usada para identificar a adipogênese. Numerosos vacúolos ricos em lipídios foram evidentes após nove dias de indução. Além disso, a expressão dos genes específicos adipogênicos Ppar-gama-1 e Cebpa foi aumentada.As amostras apresentaram coloração positiva para azul de Alcian durante a observação microscópica da diferenciação condrogênica. Além disso, a imunomarcação com anticorpo anti-colágeno tipo II mostrou maior acúmulo de matriz cartilaginosa. Garantir a viabilidade dos mBMSCs é muito importante neste protocolo.Esse objetivo pode ser alcançado escolhendo o animal experimental adequado, operando no gelo e encurtando o tempo experimental. Utilizando este modelo in vitro, pode-se obter um grande número de BMSCs mandibulares proliferativas, o que pode facilitar o estudo das características biológicas, a reação subsequente ao microambiente e outras aplicações de BMSCs mandibulares.

isolation-cultivation-mandibular-bone-marrow-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Rat CTMs foram isoladas do fémur ea tíbia e então enriquecida por separação de células magnéticas. Células classificadas foram confirmados para a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo. Estas células também foram cultivadas na densidade clonal para formar colônias individuais e, em seguida essas colônias foram separados por cilindros de clonagem.

Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs

Os osteoclastos são polykaryons tecido-específicos do macrófago derivados da linhagem do monocyte-macrófago de pilhas de haste hematopoietic. Este protocolo descreve como isolar pilhas da medula de modo que as grandes quantidades de osteoclastos sejam obtidas ao reduzir o risco de acidentes encontrados em métodos tradicionais.

Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos

Aqui apresentamos um protocolo para o isolamento de BMMs de ratos SD, chamado de método de adesão secundária.<br...

Isolamento das células de linhagem monócito-macrófago dos ossos de ratos por método de adesão secundário

Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

As células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula têm funções significativas em diversas diferenciações, auto-renovação e modulação imunológica. Eles surgiram como um reservatório crucial de células precursoras em terapia genética, engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Aqui, apresentamos um método único para isolar células-tronco mesenquimais da medula óssea da mandíbula em ratos.

Técnica para Isolamento e Cultura de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea da Mandíbula de Rato

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Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

As tirosina quinases receptoras são ectopicamente expressa em muitos cancros e foram identificadas como alvos terapêuticos em leucemia aguda. Este manuscrito descreve uma estratégia eficaz para a avaliação pré-clínica de inibidores da tirosina cinase para o tratamento de leucemia aguda.

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Este protocolo descreve um procedimento para amostragem seriada da medula óssea (MO) femoral sem exigir o sacrifício de camundongos. Este procedimento facilita estudos longitudinais da composição da MO de camundongos ao longo do tempo e fornece acesso serial às células dentro da MO para estudos ex vivo e de transplante.

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As células-tronco do câncer de pâncreas (CSCs) podem ser expandidas in vitro usando a técnica de cultura de esfera independente de ancoragem, que representa uma ferramenta poderosa para estudar a biologia do CSC e pode servir como o primeiro passo para desenvolver novas terapias direcionadas ao CSC. Aqui é fornecida a metodologia para expansão, análise e direcionamento de CSCs pancreáticas.

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Aprenda a isolar e cultivar células-tronco mesenquimais de medula óssea mandibular em ratos usando adesão de medula óssea e citometria de fluxo. Este método eficiente purifica células para pesquisa em doenças craniofaciais.

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