Detecção da Expressão de MicroRNA nos Rins de Camundongos Nefropáticos com Imunoglobulina A
8 de julho de 2020
microRNAs estão envolvidos na patogênese da nefropatia por IgA. Desenvolvemos um método confiável para detectar os níveis de expressão de microRNA nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA). Este novo método facilitará a verificação do envolvimento de miRNAs na nefropatia por IgA.
Este método pode ser usado para verificar facilmente a alteração de microRNAs na nefropatia por IGA usando um modelo animal pequeno, tornando possível estudar a nefropatia por IGA sem uma biópsia renal humana. O protocolo pode fornecer novos insights sobre a genética da nefropatia por IGA, o que pode potencialmente ajudar na descoberta de novos métodos diagnósticos e terapêuticos para a doença renal. Depois de garantir que o camundongo esteja devidamente anestesiado, use uma tesoura cirúrgica e uma pinça para fazer uma incisão na linha média de três a quatro centímetros na parede abdominal do camundongo e identificar os dois lados do rim.
Incise as costelas e o diafragma para expor o coração. Depois de incisar o átrio direito, injete PBS no ventrículo esquerdo até que a cor do rim mude para amarelo pálido, indicando que todo o corpo do camundongo está perfundido com PBS. Corte a artéria renal, a veia renal e o ureter e, em seguida, remova o rim.
Homogeneizar as amostras de rim de 30 miligramas usando um homogeneizador de silício e 700 microlitros de reagente de lise à base de fenol guanidina à temperatura ambiente. Transferir o lisado para a coluna de centrifugação trituradora de biopolímeros e centrifugá-lo a 15 000 g durante dois minutos à temperatura ambiente. Continue com a purificação do RBNA seguindo as instruções do manuscrito.
Após a lavagem final, adicione 30 microlitros de água livre de nuclease à coluna de centrifugação à base de membrana de sílica e centrifugue-a a 8.000 G por um minuto para eluir o RNA. Para a síntese de cDNA, prepare uma mistura principal com dois microlitros de mistura de ácido nucleico, dois microlitros de mistura de transcriptase reversa e quatro microlitros de tampão em um total de oito microlitros por amostra. Adicione oito microlitros da mistura master a cada poço de uma tira de tubo de oito poços.
Diluir o RNA total em água livre de nuclease. Em seguida, adicione 12 microlitros da solução total de RNA a cada poço da tira. Coloque as amostras no termociclador e incube-as a 37 graus Celsius por 60 minutos, depois a 95 graus Celsius por cinco minutos.
Para realizar PCR quantitativo em tempo real, prepare a mistura principal de acordo com as instruções do manuscrito e, em seguida, adicione 22,5 microlitros da mistura principal a cada poço de uma placa de reação de 96 poços. Adicione 2,5 microlitros do cDNA preparado a cada poço. Coloque a placa de reação no instrumento de PCR em tempo real.
Em seguida, programe-o para uma ativação inicial a 95 graus Celsius por 15 minutos, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 94 graus Celsius por 15 segundos, recozimento a 55 graus Celsius por 30 segundos e extensão a 70 graus Celsius por 30 segundos. Quantifique a expressão gênica usando o método delta-delta CT. Este protocolo foi utilizado para investigar os níveis de expressão de microRNAs nos rins de camundongos HIGA utilizando os rins de camundongos Balb/c como controle.
Os níveis de expressão de três microRNAs associados à nefropatia IGA foram medidos. Os níveis relativos de expressão de microRNA dos dois grupos foram comparados usando um teste T com um P inferior a 0,05 sendo estatisticamente significativo. O miR-155-5p foi expresso em níveis 3,3 vezes maiores no grupo HIGA em comparação com o grupo controle, e o miR-21-5p foi expresso em níveis 1,58 vezes maiores.
A expressão do miR-1461-5p não diferiu significativamente entre os dois grupos. Ao tentar este protocolo, é importante usar máscara, luvas e touca e manter a mesa e as ferramentas do laboratório limpas para evitar que a nuclease no ambiente afete o experimento. Este método experimental está atualmente em uso prático em nosso laboratório.
Seu objetivo é estabelecer novos métodos diagnósticos e terapêuticos para a nefropatia por IGA.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo apresenta um método confiável para detectar os níveis de expressão de microRNAs nos rins de um modelo murino de nefropatia por IgA. O método permite investigar o envolvimento dos microRNAs na nefropatia por IgA sem a necessidade de biópsias renais humanas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Nefrologia
- Pesquisa de microRNA
- Modelos animais
Antecedentes
- A nefropatia por IgA é uma doença renal caracterizada pelo depósito de IgA nos glomérulos.
- Os microRNAs desempenham um papel significativo na patogênese de várias doenças, incluindo distúrbios renais.
- Compreender a expressão de microRNAs pode fornecer informações sobre os mecanismos das doenças.
- Os métodos atuais para estudar microRNAs frequentemente exigem procedimentos invasivos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para avaliar os níveis de microRNA em um modelo murino de nefropatia por IgA.
- Facilitar a pesquisa sobre os aspectos genéticos da nefropatia por IgA.
- Explorar abordagens diagnósticas e terapêuticas potenciais para doenças renais.
Métodos Utilizados
- Uso de camundongos HIGA como modelo para nefropatia por IgA.
- Administração de anestesia ao camundongo antes da cirurgia.
- Técnicas cirúrgicas para acessar os rins, incluindo incisão mediana e remoção do órgão.
- Perfusão do camundongo com PBS para preparar a extração renal.
Resultados Principais
- O método desenvolvido permite a verificação fácil das alterações de microRNA na nefropatia por IgA.
- Os conhecimentos obtidos com este método podem levar ao desenvolvimento de novas ferramentas diagnósticas.
- Potencial para descobrir novas estratégias terapêuticas no tratamento da nefropatia por IgA.
- Eliminação da necessidade de biópsias renais humanas em estudos preliminares.
Conclusões
- Este método aprimora a compreensão do envolvimento dos microRNAs na nefropatia por IgA.
- Abre novas perspectivas para a pesquisa sobre a genética das doenças renais.
- A abordagem pode impactar significativamente os desenvolvimentos futuros em diagnóstico e terapia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite que equipes de P&D de biofármacos analisem a expressão de microRNAs em um modelo murino validado de nefropatia por IgA, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em programas para doenças renais. Ao fornecer um método reprodutível para detectar níveis alterados de microRNAs sem a necessidade de biópsias humanas, facilita a descoberta precoce de biomarcadores e alvos terapêuticos com maior confiabilidade preditiva. A abordagem está alinhada com esforços em estágio de descoberta para investigar mecanismos da doença e priorizar candidatos para desenvolvimento pré-clínico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de alterações na expressão de miRNAs associados à doença em camundongos HIGA em comparação com controles.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho confiável para a validação funcional de alvos utilizando qRT-PCR para medir os níveis de miR-155-5p, miR-21-5p e miR-146a-5p.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar miRNAs com mudanças significativas no valor médio (por exemplo, 3,3 vezes para miR-155-5p) como possíveis biomarcadores ou alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece dados quantitativos e reprodutíveis de expressão de miRNA adequados para padronização de ensaios em campanhas de triagem de descoberta.
- Valor Operacional: Estabelece um protocolo padronizado de purificação de RNA e síntese de cDNA compatível com plataformas de qRT-PCR de alto rendimento.
- Prontidão do Ensaio: Gera valores de CT normalizados utilizando o método delta-delta CT, permitindo comparação entre amostras e confirmação de hits.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Utiliza um modelo murino HIGA relevante para a doença para conectar descobertas de pesquisa com a validação pré-clínica de vias mediadas por miRNA.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a avaliação de alterações na expressão de miRNA associadas ao depósito de IgA, reduzindo a ambiguidade no mecanismo alvo antes da identificação do composto líder.
- Continuidade Pré-clínica: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao fornecer resultados consistentes e quantificáveis a partir de tecido renal entre os grupos de estudo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial do descobrimento, apoiando testes de hipóteses na validação de alvos e gerando resultados quantitativos para triagem e fluxos de trabalho analíticos que orientam decisões de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Permite a clarificação de vias ao medir alterações na expressão de miRNAs associadas à patogênese da nefropatia por IgA em um modelo genético de camundongo.
- Triagem: Produz dados quantitativos padronizados de miRNAs adequados para avaliar os efeitos de compostos sobre vias-alvo em ensaios subsequentes.
- Análises: Gera valores de delta-delta CT e métricas de variação de expressão que permitem às equipes comparar condições e avaliar a significância estatística utilizando testes T.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas de miRNAs da fase exploratória à continuidade pré-clínica por meio do uso de um modelo validado de nefropatia por IgA com relevância fenotípica.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um protocolo reutilizável de extração de RNA e qRT-PCR aplicável a múltiplos alvos de miRNA em diversos projetos de doenças renais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da medição direta da desregulação de miRNA em um modelo de doença.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e padronização por meio de parâmetros definidos de purificação de RNA, síntese de cDNA e qRT-PCR (por exemplo, centrifugação a 8.000 G, incubação a 37°C).
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados de expressão estatisticamente significativos (p<0,05) para priorizar alvos com forte associação à doença.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de biomarcadores ou alvos terapêuticos baseados em miRNA, com base na magnitude da variação e na reprodutibilidade.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cirurgia de roedores, manipulação de RNA e qRT-PCR para prevenir a degradação por nucleases e garantir a integridade da amostra.
- Depende do acesso a equipamentos de homogeneização, centrífuga, termociclador e instrumento de PCR em tempo real com detecção de fluorescência.
- Necessita padronização entre equipes quanto à quantidade de RNA utilizado (30 mg de rim), volumes de reagentes (700 μL de reagente de lise) e condições de ciclagem (ativação a 95°C, 40 ciclos).
- Requer adaptação dos conjuntos de iniciadores para alvos específicos de miRNA, mantendo temperaturas consistentes de pareamento (55°C) e extensão (70°C).
- Limita-se à análise de RNA em ponto final; não fornece resolução espacial ou em nível de célula única no tecido renal sem metodologias adicionais.
