Isolamento e enriquecimento de células progenitoras epiteliais pulmonares humanas para a cultura organoide

As culturas organoides 3D são proximais no epitélio pulmonar distal desenvolvidas usando este protocolo. Fornece um modelo tratável para estudar os mecanismos fundamentais de manutenção do tecido pulmonar ou remodelação associada a doenças e serve como uma plataforma eficaz para descoberta e validação de medicamentos. Este protocolo é compatível com outras abordagens de fracionamento celular de dissociação tecidual.

E como as células progenitoras epiteliais são isoladas de diferentes compartimentos anatômicos e mantêm sua identidade posicional in vitro, elas podem ser usadas para modelar diferenças regionais nas respostas pulmonares a estímulos exógenos ou endógenos. Esta técnica de nível pode ser usada para o isolamento de diferentes subpopulações de células epiteliais, incluindo células progenitoras específicas da região que podem ser cultivadas para produzir progênie diferenciada especializada representativa da região de origem. Ao receber o tecido pulmonar, separe a traqueia proximal e os brônquios do epitélio pulmonar distal, que contém pequenas vias aéreas de dois milímetros de diâmetro ou menos, e do tecido parenquimatoso circundante.

Coloque as amostras em placas de Petri estéreis individuais de 150 por 15 milímetros e corte a amostra de tecido distal em pedaços cúbicos de aproximadamente um centímetro. Coloque as peças em um tubo limpo de 50 milímetros e lave os lenços três vezes com HBSS fresco e resfriado por lavagem. Após a última lavagem, transfira os lenços para uma nova placa de Petri e seque os pedaços com lenços antifiapos estéreis.

Em seguida, use uma pinça e uma tesoura para remover o máximo possível de pleura visceral antes de picar os tecidos em fragmentos de aproximadamente dois milímetros de diâmetro. Para a digestão de fragmentos de tecido, adicione 50 microgramas por mililitro de liberase e 25 microgramas por mililitro de DNAs em 25 mililitros de HBSS estéril em um tubo cônico de 50 mililitros. E adicione aproximadamente dois a três gramas do tecido picado ao tubo.

Em seguida, coloque os tecidos a 37 graus Celsius com agitação contínua a 900 rotações por minuto por 40 a 60 minutos. Após 30 minutos, use uma seringa de 10 mililitros para triturar o tecido digerido para evitar a formação de aglomerados. No final da incubação, use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 16 para triturar o tecido cinco vezes.

Em seguida, use uma pipeta de furo largo para passar a suspensão por uma série de filtros de células sob pressão de vácuo, conforme indicado. Depois de lavar o último filtro com 20 mililitros de HBSS plus para coletar as células restantes, centrifugue os filtrados para coletar as células isoladas. Depois de descartar os sobrenadantes, adicione um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos aos pellets com pipetagem suave antes de incubar as células por um minuto de gelo.

No final da incubação, adicione 10 a 20 mililitros de HBSS mais tampão para neutralizar a lise e coletar as células restantes por centrifugação. Esgote as células endoteliais CD31 positivas e as células imunes CD45 positivas do conjunto de células totais usando as microesferas CD31 e CD45 conjugadas ao anticorpo monoclonal anti-humano CD31 e CD45 e às colunas LS de acordo com o protocolo do fabricante. Para coloração da superfície celular para FACS, adicione os anticorpos primários apropriados de interesse na concentração necessária e incube as células por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro.

No final da incubação, lave as células com três mililitros de HBSS plus e rotule as células com a concentração apropriada de anticorpo secundário conjugado com fluoróforo para uma incubação de 30 minutos no gelo, conforme apropriado. No final da incubação, lave as células com três mililitros de HBSS plus e ressuspenda as células em uma concentração de uma vez 10 elevado ao sétimo por mililitro de HBSS plus antes de filtrar as células em tubos de poliestireno de cinco mililitros através de uma tampa de filtro para garantir a formação de uma única suspensão celular. Em seguida, adicione um micrograma por mililitro de DAPI para corar as células permeáveis.

Para o enriquecimento das células progenitoras epiteliais do tecido proximal, disseque as vias aéreas proximais dos pulmões e use uma tesoura para abrir as vias aéreas ao longo de seu comprimento para expor o lúmen. Cubra os tecidos em 50 microgramas por mililitro de liberase para incubação de 20 minutos a 37 graus Celsius com agitação contínua em um misturador. No final da incubação, transfira o tecido para um prato estéril de 150 por 15 milímetros e use um bisturi para raspar suavemente a superfície das vias aéreas para retirar completamente as células epiteliais luminais do tecido.

Em seguida, lave o prato com cinco mililitros de HBSS estéril mais tampão para coletar todas as células epiteliais luminais desalojadas e transfira as células para um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros. Triturar sucessivamente a suspensão cinco vezes com uma pipeta de 10 mililitros para obter uma suspensão unicelular. Em seguida, recolher a suspensão por centrifugação.

Em seguida, ressuspenda o pellet em HBSS fresco mais tampão no gelo. Use uma tesoura para cortar o tecido traqueobrônquico restante ao longo de seus anéis para gerar pequenas tiras de tecido. Em um novo prato, use uma lâmina de barbear de um lado para picar as tiras em pedaços menores e transfira os pedaços de tecido para tubos C contendo dois mililitros de liberase por tubo.

Em seguida, use o protocolo de pulmão humano dois em um dissociador automatizado gentleMACS para dissociar mecanicamente ainda mais o tecido. No final da dissociação, transferir aproximadamente dois gramas de tecido proximal picado para tubos cónicos de 50 mililitros contendo 50 microgramas por mililitro de liberase e 25 microgramas por mililitro de solução de ADN. No final de uma incubação de 45 minutos a 37 graus Celsius com agitação, filtre a pasta do tecido através de uma série de filtros, conforme demonstrado para o tecido pulmonar distal, e adicione um volume igual de HBSS mais tampão ao filtrado para interromper a digestão.

Adicione as células luminais proximais isoladas das vias aéreas ao tubo e colete as células por centrifugação. As células podem então ser enriquecidas por isolamento de microesferas e coradas para marcadores de superfície celular de interesse, conforme demonstrado para as células do tecido pulmonar distal. As vias aéreas proximais revestidas por um epitélio pseudoestratificado incluem abundantes células progenitoras basais que são imunorreativas para a proteína de membrana NGFR.

Em contraste, as células epiteliais que revestem os alvéolos incluem um subconjunto que mostra imunorreatividade da membrana apical com o anticorpo monoclonal HTII-280 sugestivo de sua identidade celular alveolar tipo II. A depleção do grânulo magnético de células contaminantes do sangue vermelho, imunes e endoteliais resulta em um enriquecimento significativo das populações de células epiteliais em amostras de tecido distal e proximal com aumentos correspondentes na eficiência do FACS. A depleção adicional de FACS leva a populações de células distais altamente enriquecidas que podem ser adicionalmente fracionadas com base em sua coloração de superfície NGFR ou HTII-280.

As culturas de células epiteliais pulmonares distais positivas para HTII-280 produzem organoides em rápida expansão com uma eficiência média de formação de colônias de 10% A coloração por imunofluorescência das culturas do dia 30 revela que os organoides contendo lúmen são compostos predominantemente por células epiteliais pulmonares distais positivas para HTII-280 e SPC. Organoides epiteliais pulmonares proximais cultivados a partir de células positivas para NGFR resultam na formação de organoides contendo lúmen no dia 30 de cultura com uma eficiência média de formação de colônias de 7,8% A otimização empírica da associação de tecidos enzimáticos é crítica para a preservação de epítopos de superfície, permitindo a coloração por imunofluorescência e o enriquecimento de subconjuntos de células epiteliais viáveis para a geração subsequente de culturas organizadas específicas da região. Este método pode ser adaptado para a identificação e enriquecimento de subconjuntos de células imunológicas, vasculares, estromais e epiteliais e desenvolvimento de modelos de co-cultura usando plataformas de chips organoides 3D.

Recentemente, descrevemos o uso de organoides alveolares gerados usando essa técnica como uma plataforma para estudar a infecção por SARS-CoV-2 do epitélio pulmonar humano e para a validação de medicamentos para COVID-19.