Entrega intramiocárdica atrasada de células-tronco após lesão de reperfusão de Isquemia em um modelo murino

Danos isquêmicos induzm um ambiente hostil pró-inflamatório que afeta a sobrevivência de células transplantadas. Nosso protocolo apresenta um método alternativo para fornecer biológicos contornando a resposta imune inicial à lesão. A principal vantagem deste protocolo é que ele possibilita a administração terapêutica uma semana após a lesão, imitando o tratamento no ambiente clínico.

Nosso foco principal é no modelo de lesão de reperfusão de isquemia e transplante de células STEM. No entanto, essa abordagem também pode ser utilizada para modelos de doença inflamatória que envolvam a introdução de terapias biológicas. Comece autoclavando todos os instrumentos cirúrgicos.

Se várias cirurgias forem realizadas em uma sessão, limpe os instrumentos após cada animal e reesterirem-os usando um esterilizador de contas quentes. Subcutâneamente administre analgésicos, pese o animal e insira o peso no ventilador. Raspe o lado esquerdo do peito do esterno até o nível do ombro e aplique creme depilatório para remover o excesso de pele.

Para evitar o colapso pulmonar, mantenha a pressão expiratória final positiva em dois centímetros de água para o procedimento de reperfusão da isquemia e mude-a para três centímetros de água para a injeção retardada do procedimento celular. Depois de anestesiar o mouse, entuba-o com um tubo endotraqueal de 20 bitolas e transfira-o para uma almofada de aquecimento controlada para manter uma temperatura corporal de 35 a 37 graus Celsius. Coloque o mouse em recumbência lateral com extremidade craniana à esquerda e caudal na direita.

Esfregue a área cirúrgica alternando entre cotonetes de iodo povidone e álcool três vezes e aplique pomada oftálmica em ambos os olhos. Use um bisturi de lâmina número 10 para fazer uma incisão vertical de 2,5 milímetros à direita do mamilo mais à esquerda no campo de visão, em seguida, use uma tesoura para cortar as camadas musculares superficiais até que o músculo intercostal e costelas sejam visíveis. Enquanto levanta as costelas e o tecido circundante, corte o espaço intercostal entre a quarta e a quinta costelas, em seguida, insira o retrátil das pálpebras no espaço aberto.

Retraia o pericárdio usando fórceps curvos, movendo o pulmão para cima e para fora da vista. Passe uma sutura de nylon 9-0 através do miocárdio sob a artéria LAD 2,5 milímetros distal para a aurícula esquerda mantendo movimentos suaves e consistentes para evitar rasgar o tecido ou perfurar um vaso sanguíneo principal. Amarre um nó quadrado solto, em seguida, coloque um centímetro de tubo de polietileno dentro do nó solto.

Fixar a sutura ao redor da tubulação e confirmar isquemia por palidez e arritmia ventricular e, em seguida, solte após 35 minutos. Depois de remover a tubulação, espere cinco minutos para confirmar a re-perfusão do miocárdio. Coloque um tubo de cateter 24 de calibre IV na cavidade torácica um espaço intercostal à direita da abertura.

Use suturas absorvíveis de 6-0 para fechar a incisão intercostal em um padrão simples interrompido e a camada muscular em um padrão de sutura contínua. Após fechar a camada muscular superficial, remova o tubo torácico enquanto retira o ar da cavidade torácica com uma seringa de tuberculina de um mililitro. Feche a incisão da pele com uma sutura absorvível de 6-0 em um padrão de colchão horizontal contínuo.

Quando terminar, administre 1,5 mililitros de soro fisiológico quente subcutâneamente e aplique pomada com antibiótico triplo no local de incisão para prevenir a infecção. Transfira o mouse para uma gaiola livre de cama ou uma gaiola com roupa de cama coberta em uma almofada quente e uma temperatura de 35 a 37 graus Celsius até que ele esteja totalmente recuperado. Depois de preparar e entubar o camundongo como descrito anteriormente, remova a sutura da camada de pele com tesouras e fórceps, em seguida, use um bisturi número 10 para fazer uma incisão no mesmo local da cirurgia anterior.

Continue a cortar o tecido cicatricial até que a sutura da camada muscular esteja visível, em seguida, use a tesoura e fórceps para remover a sutura e cortar a camada muscular aberta. Remova as suturas segurando as costelas juntas e continue cortando o músculo intercostal da incisão anterior. Coloque o retrátil das pálpebras no espaço intercostal e localize a área da ligadura anterior.

Carregar 300.000 células STEM mesenquimais suspensas em 20 microliters de PBS em uma seringa de insulina calibre 30 e dobrar a agulha ligeiramente para alcançar o ângulo adequado para injeção. Movendo-se na direção do ápice em direção à base do coração, insira a seringa na região peri-infarto até que a abertura da agulha esteja completamente dentro do miocárdio, em seguida, injete lentamente as células no miocárdio, espere três segundos e remova a agulha. Observe o coração de perto por três minutos para ter certeza de que não há reação anormal às células, como fibrilação ventricular.

Após três minutos, coloque um tubo de cateter 24 de calibre IV na cavidade torácica um espaço intercostal à direita da abertura. Feche as camadas intercostal do músculo e da pele e remova o tubo torácico como descrito anteriormente. Administre 1,5 mililitros de soro fisiológico quente subcutâneamente e aplique pomada com antibiótico triplo no local de incisão para prevenir a infecção.

Transfira o mouse para uma gaiola ou gaiola livre de cama com roupa de cama coberta em uma almofada quente até que esteja totalmente recuperado. Ecocardiograma pós-operatório e eletrocardiograma foram realizados no dia em que procedem a implantação de células STEM, confirmando infarto e diminuição da função contratil ventricular. Um exame mais aprofundado dos dados mostrou que a fração de ejeção e o encurtamento fracionado foram diminuídos em camundongos que receberam lesão isquêmica, enquanto os volumes diastólicos e sistólicos finais aumentaram.

A coloração tricrômica masson do tecido miocárdio sete dias após a lesão mostrou aumento da deposição de colágeno e afinamento da parede ventricular esquerda em corações de camundongos que receberam lesão isquêmica. A imagem bioluminescente in vivo ou BLI foi realizada no dia seguinte à implantação de células STEM mesenquimais. A entrega bem sucedida de MSCs é exemplificada pelo sinal BLI em comparação com camundongos que tiveram lesão de reperfusão de isquemia induzida, mas não receberam MSCs.

Ao tentar este protocolo, tenha em mente que pequenos movimentos intencionais ao cortar através dos intercostais, ligando o vaso e células injetáveis são vitais para evitar danos indevidos ao coração ou ao pulmão no campo de visão. Esses procedimentos oferecem a capacidade de monitorar a função cardíaca após o transplante através do ultrassom, viabilidade celular via bioluminescência por imagem, ou outras técnicas moleculares ou bioquímicas, dependendo da terapia utilizada.