Name: Taurocholate de sódio induziu pancreatite aguda grave em C57BL/6 camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Aprenda a induzir pancreatite aguda biliar em camundongos C57BL/6 usando infusão retrógrada de taurocolato de sódio. Este método reproduz eventos inflamatórios precoces e permite estudar respostas terapêuticas.

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Os autores agradecem ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Universidade de São Paulo; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP).

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética para o uso de animais da Faculdade de Medicina da USP, Num. Projeto: 1343/2019-CEUA: FMUSP. Para este protocolo, foram utilizados camundongos C57BL/6, com idade de 6 semanas, pesando 20 ± 2 g (n = 9/grupo).
1. Laparotomia
<ol><li>Anestesize animais com xilazina (10 mg/kg) e solução de cetamina (80 mg/kg), subcutânea (0,1 mL/10g de peso corporal) utilizando uma seringa de 1 mL e agulha de 13x0,45mm 26G 1/2. Verifique se há profundidade de anestesia suficiente beliscando o dedo do dedo do sol. Controle a temperatura do corpo usando almofadas aquecidas. Certifique-se de que todos os materiais cirúrgicos são estéreis.</li>
	<li>Limpe a área abdominal com 5% de solução de povidona-iodo e use um aparador para remover o cabelo entre o peito e o abdômen inferior (aproximadamente 2 cm2). Limpe a área cirúrgica com 70% de álcool.</li>
	<li>Imobilize o animal no tabuleiro cirúrgico usando fita cirúrgica. Use uma tesoura para cortar 5 mm da pele horizontalmente, na parte superior do abdômen e 1 cm abaixo do processo xifoide. Repita o corte no peritônio. Isso resultará em uma laparotomia com exposição mínima da cavidade.</li>
</ol>2. Localizar e expor o pâncreas
<ol><li>Com o auxílio de um retrátil, puxe o fígado em direção à cabeça do rato, ~1 cm do intestino.</li>
	<li>Localize a região do pâncreas que será injetada com taurocholate de sódio (cabeça de pâncreas). Localize o duodeno com referência ao fígado abaixo do fígado, no lado direito (à esquerda como o rato é visto). O duodeno é a primeira parte do intestino delgado e está ligado à parte final do estômago.</li>
	<li>Com o auxílio de fórceps, levante o fígado em direção à cabeça do animal, e puxe suavemente a porção do intestino delgado. Fixar as duas extremidades laterais do intestino delgado com uma sutura de polipropileno 6-0 para melhor visualizar a porção distal do ducto biliar comum.</li>
</ol>3. Indução grave de pancreatite aguda
<ol><li>Oclui temporariamente o ducto biliar comum proximal com um clipe de microvessel para evitar que a infusão retrógrada vaze no fígado. O ducto biliar comum pode ser visto no lado do fígado do duodeno e sua junção com o duodeno aparecerá branca. Expor o órgão da cavidade abdominal.</li>
	<li>Puna a região periampulária (parte esbranquiçada da parede do intestino delgado) para acessar o ducto biliar comum com uma agulha de 0,4 mm conectada a um tubo de polietileno de 0,54 mm.</li>
	<li>Faça uma oclusão temporária do ducto biliar comum distal com 8-0 sutura para evitar que a solução de taurocholate de sódio vaze para o duodeno.</li>
	<li>Inicie a bomba de infusão e programe uma solução de taurocholate de sódio de 2,5% (diluída em 0,9% de soro fisiológico) a uma velocidade constante de 10 μL/10 g de peso corporal por 3 min.</li>
	<li>Após a infusão, remova o clipe de microvessel, o 8-0 temporário sutura, e a agulha de injeção do ducto pancreático bile para reconstituir o fluxo fisiológico da bile.</li>
	<li>No final, sutura o abdômen com 6-0 monofilament monofilament polipropilente sutura. O tempo entre a laparotomia e a sutura final deve ser de no máximo 30 min (ver Figura 1).</li>
	<li>Após a cirurgia, abriga os animais em caixas de polietileno forradas com aparas de madeira e água e ad libitum alimentar.</li>
	<li>Trate os camundongos de controle da mesma forma que os camundongos experimentais, mas certifique-se de que o infusor consiste apenas em soro fisiológico. Realizar o procedimento cirúrgico e a infusão de solução salina (10 mL/min, por 3 min) em um grupo controle (SHAM) para eliminar o viés inflamatório causado pela cirurgia e cannulação.</li>
	<li>Use tramadol 12,5 mg/kg subcutâneamente a cada 8 horas, começando após a recuperação pós-cirúrgica.</li>
</ol>4. Métodos para análise
<ol><li>Às 12h após a indução de AP, anestesia os animais com xilazina (10 mg/kg) e cetamina (80 mg/kg) para coletar aproximadamente 250 μL de sangue através do plexo orbital.<ol>
<li>Segure suavemente a pele nas costas, promovendo uma leve saliência do globo ocular, e posicione-a com o olho voltado para cima.</li>
		<li>Incutir um gota de pomada ocular contendo anestésico local no olho do animal.</li>
		<li>Posicione a extremidade do tubo capilar no canto medial do olho e insira-o suavemente sob o globo ocular, com um ângulo de ~30°-45°. Gire o tubo capilar até que o fluxo sanguíneo comece. Lembre-se que não é necessário usar a força para o procedimento.</li>
		<li>Uma vez que a coleção acabou, certifique-se de homeostase mantendo as pálpebras fechadas por compressão leve com a gaze. Descarte o tubo capilar no recipiente sharps19.</li>
		<li>Centrifugar o soro (700 x g, 15 min) e estocar o supernatante para dosagem de amilase e IL-6 (passo 4.7 e 4,8).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eutanize camundongos por asfixia de CO2 .</li>
	<li>Use uma agulha de 27 G para injetar 4 mL de 1x PBS gelado na cavidade peritoneal. Erram a pele abdominal e garantem que a agulha seja empurrada lentamente no peritônio para não perfurar nenhum órgão. Após a injeção, massageie suavemente o peritônio por 10 s para remover as células aderidas ao peritônio.</li>
	<li>Usando tesouras e pinças, faça um pequeno corte (0,5 cm) na pele interna e musculatura para expor a cavidade abdominal. Insira uma pipeta de lâmpada no peritônio e colete o fluido. Tenha cuidado para não aspirar tecido gorduroso ou outros órgãos.</li>
	<li>Colete o máximo de fluido possível e deposite a suspensão celular coletada em tubos mantidos no gelo. Descarte a pipeta da lâmpada no recipiente sharps20. Centrifugar o fluido peritoneal (250 x g, 5 min) e estocar o supernacido para dosagem IL-6 (passo 4.9).</li>
	<li>Recolher a região do pâncreas adjacente ao duodeno (<5mm).</li>
	<li>Processe o pâncreas fixando em 10% de formalina e incorpore-o em parafina.<ol>
<li>Manche os slides com hematoxilina e eosina para análises histopatológicas sob microscopia leve. Use o protocolo de Schmidt21 (edema pancreático, célula acinar, lesão/necrose, inflamação pancreática) para avaliar a extensão da AP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir amilase (U/dL) usando kits disponíveis comercialmente de acordo com as recomendações do fabricante.</li>
	<li>Medir os ensaios IL-6 da Luminex utilizando kits comerciais de acordo com as recomendações do fabricante.</li>
	<li>Armazene o supernanato de fluido peritônio e sérico obtido nas etapas 4.1 e 4.4 em um congelador a -80 °C, se necessário.</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+different+clinical+features+between+hypertriglyceridemia+and+biliary+acute+pancreatitis%3A+A+retrospective+study+of+730+patients+from+a+tertiary+center%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Significantly different clinical features between hypertriglyceridemia and biliary acute pancreatitis: A retrospective study of 730 patients from a tertiary center.</a> BMC Gastroenterology. 18 (1), 1-8 (2018).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método de indução de pancreatite aguda por infusão de taurocholate de sódio retrógrado já foi mostrado em ratos22,23,24. Três trabalhos semelhantes, publicados em 2008, 2010 e 2015, serviram de referência para o protocolo3,14,15. Neste trabalho, listamos todas as etapas críticas para a reprodução deste método em camundongos C57BL/6 e ...

Em humanos, a presença de cálculos biliares é a causa mais comum de pancreatite devido à obstrução da porção terminal do choledochal, interrompendo o fluxo de secreções pancreáticas e causando um intenso processo inflamatório no pâncreas, com aumento da concentração de enzimas digestivas no soro e mediadores inflamatórios1,2.
Duas teorias diferentes foram propostas para explicar o desenvolvimento de pancreatite aguda (AP). A teoria do "canal comum" sugere que as pedras presentes na vesícula biliar obstruem o sistema de ducto biliar comum distal, permitindo que a secreção biliar flua retrógrada para o ducto pancreático. A segunda teoria (a teoria da "obstrução do ducto") sugere que a obstrução do ducto pancreático por excesso de cálculos biliares causa um bloqueio no fluxo de secreção pancreática para o duodeno, causando hipertensão ductal3. Embora os mecanismos que levam à pancreatite biliar aguda não sejam totalmente compreendidos, o resultado é um processo inflamatório intenso. Erupção de enzima digestiva e auto-digestão do pâncreas levam a alterações histopatológicas, aumento de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α) em fluido ascético e soro, e aumento de proteínas de fase aguda4,5,6.
A pancreatite aguda grave é uma condição que merece atenção clínica devido ao envolvimento de múltiplos órgãos e a um alto risco de mortalidade. Modelos animais para a reprodução de pancreatite aguda (AP) são importantes, pois explicam os mecanismos fisiodicosiológicos da doença e ajudam no acompanhamento da evolução dos eventos inflamatórios, a partir dos estágios iniciais da doença. Isso geralmente não é possível nas clínicas2,7. Além disso, o acesso a tecidos pancreáticos é fácil em estudos pré-clínicos, favorecendo a elucidação de alterações ligadas às condições clínicas8, juntamente com a possibilidade de trabalhar com espécies isogênicas, eliminando variáveis indesejáveis e espelhando a semelhança clínica com os desfechos observados na condição humana9.
Modelos biliares e não biliares para a indução de pancreatite aguda em espécies de ratos e camundongos têm sido frequentemente estudados na literatura científica. Os métodos não biliares de indução incluem a administração de doses estimulantes supramaximais da colecistocina secretagogue ou sua cerulein analógica10; administração de doses quase letais de L-arginina; ou administração de uma dieta deficiente de colina suplementada com ethionine11. Embora esses métodos sejam fáceis de reproduzir e resultem em inflamação pancreática, eles não replicam os mecanismos que, em teoria, desencadeiam AP (ou seja, o refluxo da secreção bile no ducto pancreático). A técnica que aborda o modelo biliar baseia-se na infusão retrógrada de ácidos biliares no ducto pancreático e requer pesquisadores bem treinados para realizar este protocolo. Vários estudos foram publicados utilizando esse método em ratos (aparentemente por razões técnicas, uma vez que esses experimentos envolvem procedimentos cirúrgicos)12,13. No entanto, a abordagem em camundongos pode oferecer resultados mais interessantes no estudo da inflamação3,14,15. Neste estudo, mostraremos uma lista dos passos a serem seguidos para a reprodução de pancreatite aguda grave por infusão de taurocolato de sódio em camundongos anestocás C57BL/6.
Para trabalhos que envolvem a necessidade de experimentos com anticorpos e análise da expressão genética e proteica, o uso de camundongos é preferível devido ao maior arsenal de materiais para esses animais e à possibilidade de trabalhar com espécies isogênicas e eliminatórias, entre outras que podem ser utilizadas relevantes para estudos16. Camundongos C57BL/6 é uma variedade de camundongos originalmente desenvolvida para o estudo da atividade antitumoral e imunologia. Essa cepa está cada vez mais sendo preferida pelos pesquisadores por ser isogênica, permitindo uma maior reprodutibilidade de resultados, o que pode implicar o uso de um número menor de animais em um experimento e menor variabilidade dos resultados entre o mesmo grupo17,18.
Perides et al. (2010)14 publicaram um protocolo para indução de AP em camundongos por infusão de taurochoola de sódio. Aqui atualizamos este modelo utilizando uma maior concentração de taurocholate de sódio (2,5%) em camundongos C57BL/6, com volume e velocidade definidos de infusão (Figura 1). O nível máximo de gravidade é alcançado dentro de 12 h de indução em camundongos. A elevação da concentração de IL-6 tanto no soro quanto na cavidade peritoneal está correlacionada com a progressão da AP. Com a prática, o tempo total estimado desde a indução da anestesia até a conclusão da infusão, é de 25 minutos por animal. É essencial que um pesquisador treinado conduza esse experimento. Para garantir que a solução seja injetada corretamente no ducto biliar comum, realize várias sessões de treinamento piloto usando azul de metileno em vez de taurocolato de sódio.

<table><tbody><tr><td>Agulha de 0,4 mm</td><td>INTRAG MEDICAL TECH</td><td></td> 90183210 <td>30G</td></tr><tr><td>&nbsp; Tubo de polietileno de 0,54 mm</td><td>Tygon</td><td>730010-Bloco</td> <td>de</td></tr> <tr><td>isopor</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr>fita <tr><td>adesiva para montagem do mouse</td><td>Missner</td><td>1236-Bomba</td><td></td></tr> <tr><td>de infusão programada para 10&micro; L / min.</td><td>Bomba Peristáltica Havard aparatus Série</td><td>MA1 55-7766</td><td>&nbsp; Modelo 66 Tesoura</td>e pinça</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> peristáltica <tr><td>pequena Iodo antisséptico Pfizer</td><td></td><td>12086OR</td><td>anti-sepsia</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>SIGMA</td><td>459836</td><td>Misture 700 mL 100% etanol com 300 mL dH2O Lâmina de</td></tr><tr><td>barbear</td><td>Lord</td><td>bdk9a1ghk6</td><td>Para tricotomia</td></tr><tr><td>Taurocolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86339- 1G</td><td>NÚMERO CAS- 345909-26-4</td></tr><tr><td>clipe de microvaso</td><td>Medicon Surgical</td><td>56.87.35</td><td>Aproximador, abertura 4,0 mm, pressão de fechamento 30 -&nbsp; 40 g</td></tr><tr><td>6-0 prolene</td><td>Bioline</td><td>5162</td><td>Linha de sutura</td></tr><tr><td>Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL</td><td>Crist&aacute; lia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazine 2%</td><td>Syntec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina estéril (0,9% (peso/vol) salina)</td><td>Farmace</td><td>105851</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Blue</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>M5528</td><td></td></tr><tr><td>MILLIPLEX&nbsp; MAPA Painel de esferas magnéticas de citocinas/quimiocinas de camundongo - Ensaio multiplex de imunologia</td><td>MERCK</td><td>MCYTOMAG-70K</td><td>Analise simultaneamente vários biomarcadores de citocinas e quimiocinas com ensaios multiplex baseados em esferas usando a tecnologia Luminex, em amostras de soro de camundongo, plasma e cultura de células.</td></tr><tr><td>Ensaio de amilase</td><td>Labtest</td><td>11</td><td></td></tr><tr><td>Desmarres afastador 13-mm largura</td><td>ROBOZ</td><td>RS-6672</td><td></td></tr></tbody></table>

taurocholate de sódio induziu pancreatite aguda grave em c57bl/6 camundongos

Sodium Taurocholate Induced Severe Acute Pancreatitis in C57BL/6 Mice

A indução de pancreatite aguda biliar por infusão de taurocoolato de sódio tem sido amplamente utilizada pela comunidade científica devido à representação da condição clínica humana e à reprodução de eventos inflamatórios correspondentes ao aparecimento de pancreatite biliar clínica. A gravidade dos danos pancreáticos pode ser avaliada medindo a concentração, velocidade e volume do ácido biliar infundido. Este estudo fornece uma lista atualizada dos materiais e métodos utilizados na reprodução do protocolo e mostra os principais resultados deste modelo de pancreatite aguda (AP). A maioria das publicações anteriores limitou-se a reproduzir esse modelo em ratos. Aplicamos esse método em camundongos, o que proporciona vantagens adicionais (ou seja, a disponibilidade de um arsenal de reagentes e anticorpos para esses animais, juntamente com a possibilidade de trabalhar com cepas geneticamente modificadas de camundongos) que podem ser relevantes para o estudo. Para indução aguda de pancreatite em camundongos, apresentamos um protocolo sistemático, com uma dose definida de 2,5% de taurocolato de sódio a uma velocidade de infusão de 10 μL/min por 3 min em camundongos C57BL/6 que atinge seu nível máximo de gravidade dentro de 12 h de indução e destacam resultados com resultados que validam o método. Com a prática e a técnica, o tempo total estimado, desde a indução da anestesia até a conclusão da infusão, é de 25 minutos por animal.

A gravidade da pancreatite foi pontuada entre 0-3 de acordo com a escala de Schmidt21 , onde zero corresponde à ausência, 1 corresponde a uma presença leve (&lt;25%), 2 corresponde a uma presença moderada (entre 25 e 50%) e 3 corresponde a uma presença intensa (&gt; 50%) (Tabela 1). As medidas realizadas foram atividade de amilase plasmática, edema pancreático, célula acinar, lesão/necrose, inflamação pancreática (por análise histologia de seções m...

Modelos animais para pancreatite aguda grave permitem o estudo de alterações fisiodicosiológicas no estágio inicial, facilitando a observação da evolução dos eventos inflamatórios. Aqui fornecemos um protocolo para a indução de pancreatite biliar aguda grave por infusão retrógrada de taurocholate de sódio no ducto pancreático de camundongos C57BL/6 anestesiados.

Taurocholate de sódio induziu pancreatite aguda grave em C57BL/6 camundongos

Biliary acute pancreatitis induction by sodium taurocholate infusion has been widely used by the scientific community due to the representation of the ...

Este método pode ser usado para reproduzir os eventos inflamatórios que ocorrem na pancreatite biliar aguda. É possível estudar alterações no tecido pancreático em seus estágios iniciais, o que geralmente não é possível na clínica. As principais vantagens dessa técnica são que ela é rápida e fácil de reproduzir para um pesquisador treinado, e oferece resultados semelhantes à pancreatite aguda em humanos.O método pode ser usado para estudar respostas imunes farmacológicas de moléculas de drogas e outras intervenções terapêuticas, pois permite o estudo de células inflamatórias mediadores no pâncreas e órgãos adjacentes. Ao tentar esse protocolo, localizar os órgãos e estabelecer a região de cannulação é crucial. Memorize a localização dos órgãos e exerça a aplicação da injeção primeiro usando uma solução colorida como azul metileno.Depois de verificar a profundidade da anestesia com uma pitada de dedo do dedo do dedo, limpe a área abdominal de um rato anestesiado com uma solução de iodo povidone de 5%. Usando um aparador, remova o cabelo entre o peito e o abdômen inferior e limpe uma área cirúrgica de aproximadamente dois centímetros quadrados com 70% de álcool. Imobilize o animal na

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Research

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Medicine

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Este vídeo descreve o procedimento para a geração de um modelo de camundongo com pancreatite biliar aguda por infusão pancreática de taurocolato de sódio. Este modelo ajuda a estudar as alterações fisiopatológicas induzidas pelo taurocolato de sódio no pâncreas.

Modelo de pancreatite biliar aguda: um método para gerar modelo de camundongo com pancreatite biliar aguda por meio de infusão de ducto pancreático

Pancreatite crônica (PC) é uma doença caracterizada por inflamação e fibrose do pâncreas, frequentemente associada a dor abdominal intratável. Este artigo se concentra na refinação da técnica para gerar um modelo de camundongo de CP via infusão de ducto biliar com ácido sulfônico de 2,4,6 -trinitrobenzene (TNBS).

Um modelo de rato para pancreatite crônica através da infusão TNBS do ducto biliar

Um modelo de rato de pancreatite aguda grave é descrito aqui. O procedimento aqui apresentado é muito rápido, simples e acessível, permitindo, assim, potencialmente o estudo dos mecanismos moleculares e diferentes intervenções terapêuticas na pancreatite aguda de forma conveniente.

Estabelecimento de um modelo de pancreatite aguda grave do rato usando injeção retrógrada de taurocholate de sódio no ducto biliopancreático

A administração intraperitoneal de medicamentos é uma abordagem não invasiva segura e eficaz para induzir lesão pancreática. Este estudo comparou cinco protocolos distintos de injeção intraperitoneal em camundongos para induzir graus variados de lesão pancreática e estabeleceu um modelo de lesão pancreática grave para investigar as alterações patológicas e estratégias de tratamento para pancreatite aguda grave (SAP).

Preparando um modelo de camundongos de pancreatite aguda grave por meio de uma combinação de injeção intraperitoneal de ceruleína e lipopolissacarídeo

CO expirado 2 Medição em pacientes entubados com respiração espontânea ou do Departamento de Emergência

Um modelo murino para o ventilador lesão pulmonar induzida é uma ferramenta importante para estudar uma lesão pulmonar...

Ventilação a pressão controlada para induzir lesão pulmonar aguda em ratos

Descrevemos modelos de lesão renal por isquemia e reperfusão induzida moderada e grave em que os ratos submetidos a clampeamento do pedículo renal unilateral seguido de nefrectomia contralateral simultânea ou tardia, respectivamente. Estes modelos consistentemente dar origem a uma disfunção renal e fibrose pós-lesão, mas a gravidade da lesão e sobrevivência dependem de fundo, idade e equipamento cirúrgico mouse.

Isquemia-reperfusão modelo de lesão renal aguda e Pós Lesão fibrose em camundongos

Trauma cerebral aguda é uma lesão grave que não tem tratamento adequado à data. Microscopia Multiphoton permite estudar longitudinalmente o processo de desenvolvimento agudo trauma cerebral e sondagem estratégias terapêuticas em roedores. Dois modelos de trauma cerebral aguda estudou com in vivo de dois fótons de imagem de cérebro são demonstrados neste protocolo.

Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem

A transferência de linfócitos bm12 para um receptor C57BL/6 é um modelo estabelecido de lúpus eritematoso sistêmico. Aqui descrevemos como iniciar a doença usando este modelo e como caracterizar células T foliculares auxiliares, células B do centro germinativo e células plasmáticas por citometria de fluxo.

O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6

Murino colostomia distal fornece um modelo murino para colite de diversão humana, uma colite linfocítica predominantemente no segmento de cólon excluído do fluxo fecal.

Murino colostomia Distal, um novo modelo de colite de diversão em camundongos C57BL/6

Aprenda a induzir pancreatite aguda biliar em camundongos C57BL/6 usando infusão retrógrada de taurocolato de sódio. Este método reproduz eventos inflamatórios precoces e permite estudar respostas terapêuticas.

Taurocholate de sódio induziu pancreatite aguda grave em C57BL/6 camundongos

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