Name: Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a avaliar variantes BRCA1 usando editores de base CRISPR em células vivas. Este método permite mutações diretas no gene endógeno, superando limitações de técnicas tradicionais e auxiliando na predição de risco de câncer.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (bolsas 2017M3A9B4062419, 2019R1F1F1057637 e 2018R1A5A20732 a Y.K.).

NOTA: O método 1 (geração de linhas celulares HAP1-BE3) é opcional. Em vez de construir uma linha celular que expresse BE3, o DNA plasmídeo codificador BE3 pode ser co-transfectado com DNA plasmídeo codificador de gRNA. Outras variantes de editores base de citosina, como o BE4max, também podem ser usadas para edição de base altamente eficiente.
1. Geração de linhas celulares HAP1-BE3
<ol><li>Construção de DNA plasmídeo<ol>
<li>Para construir o DNA plasmídeo lentiBE3-blast para a produção de lentivírus, amplie as sequências de codificação BE3 em pCMV-BE3 (Tabela de Materiais) por PCR usando polimerase de alta fidelidade. Projete o primer PCR para conter sequências sobrepostas do vetor digerido (a partir da etapa 1.1.2) para montagem isotérmica da seguinteforma: 17: primer-F:5'-TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3', primer-R:5'-CAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTTCTTCTTCTTCTTGGG-3' NOTA: Os nucleotídeos mostrados em sublinhados são sobrepostos com o vetor digerido e essas sequências serão específicas para o vetor de destino escolhido pelo usuário.</li>
		<li>Digeste lentiCas9-blast(Tabela de Materiais) DNA plasmídeo com as enzimas de restrição, XbaI e BamHI (1 unidade por 1 μg) por 1 h a 37 °C. Execute o produto digerido em um gel de 0,8% de agarose e purifique as bandas de tamanho apropriado (8,6 kb) utilizando um kit de extração de gel comercial(Tabela de Materiais).</li>
		<li>Clone o produto BE3 PCR amplificado e o vetor lentiCas9-Blast digerido usando o kit de montagem isotemal(Tabela de Materiais). Use um total de 0,02-0,5 pmol de fragmentos de DNA e uma razão de 1:3 de vetor:insert. Transforme o produto de montagem em células alfa-competentes DH518. Adicione os transformadores em uma placa de ágar contendo ampicillina (100 μg/mL) e incubar a placa durante a noite a 37 °C.</li>
		<li>Escolha várias colônias e inocula-as em 4 mL de LB (caldo de litogenia) médio contendo ampicilina (100 μg/mL) e cresça a cultura em uma incubadora de agitação a 180 rpm.</li>
		<li>Purificar o DNA plasmídeo usando um kit comercial de purificação de DNA plasmídeo(Tabela de Materiais) de acordo com os protocolos do fabricante.</li>
		<li>Para confirmar o sucesso da clonagem de DNA, analise as sequências BE3 de cada DNA plasmídeo purificado (a partir da etapa 1.1.5) pelo sequenciamento Sanger usando primers padrão e específico BE3(Tabela Suplementar 1) e selecione a construção de lentiBE3-blast clonada exata. NOTA: Para analisar os resultados do sequenciamento Sanger, recomendamos várias ferramentas como BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) e CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura celular e geração de linhas celulares HAP1-BE3<ol>
<li>Manter as células em uma condição saudável e em um estado ativamente divisória. Cultura Células HAP1 no meio modificado de Dulbecco(Tabela de Materiais)modificado de Iscove contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina. Cultura HEK293T/17 células no meio modificado da Águia de Dulbecco (Tabela de Materiais) contendo 10% de FBS e 1% penicilina/estreptomicina. NOTA: A célula HAP1 é útil para pesquisas genéticas por causa de suas células quase haploides. No entanto, as células podem retornar espontaneamente a um estado diploide na cultura celular. Enriquecimento Hoechst 34580 manchado 1n-população usando flucittometria será útil para a manutenção de haploidy de células HAP119.</li>
		<li>Sementes 5 x 106 células HEK293T/17 em um prato de 100 nm 1 dia antes da transfecção. No dia da transfecção, transfete o DNA plasmídeo (15 μg de lentiBE3-blast, 9 μg de psPAX2 para embalagem viral, e 6 μg de pMD2.G para envelope de frasco de2ª geração do sistema de embalagem lentiviral) utilizando reagentes de transfecção comercial de acordo com os protocolos do fabricante(Tabela de Materiais)20. Altere o meio em 6h após a transfecção e colher o meio contendo vírus em 48 h ou 72 h após a transfecção. Filtre o supernatante usando um filtro de 0,45 μm.</li>
		<li>Transduque as partículas lentivirais de BE3 em células HAP1 em um MOI (multiplicidade de infecção) de 0,1. Para ajustar para um MOI apropriado, use concentrações diluídas em série de vírus. Remova o meio e substitua-o por meio de cultura viral ajustada e fresca.</li>
		<li>Um dia após a transdução, altere o médio para 10 μg/mL de blasticidina(Tabela de Materiais) - contendo meio e selecione as células transduzidas por 3 dias com blasticidina. Após a seleção blasticidin, selecione um poço com ~10% das células sobreviventes para o próximo passo.</li>
		<li>Após a seleção blasticidin, as células transduzidas em placas de 96 poços a uma densidade de 0,5 células/poço, a fim de isolar clones únicos (por exemplo, diluir 50 células em 20 mL (0,5 células por 200 μL) cultura média e alíquota de 200 μL por poço em 96 placas de poço). Incubar as placas de 96 poços por 2 semanas e escolher as colônias individuais para confirmar a atividade BE3.</li>
		<li>Divida as colônias únicas em dois conjuntos, um conjunto para testar a atividade BE3 e outro para manutenção. Transduza as partículas lentivirais de gRNAs em um dos conjuntos para confirmar a atividade BE3. Analise a frequência de mutação de cada colônia utilizando o ensaio de endonuclease T7 I (T7E1, Tabela de Materiais) ou realizando a técnica de sequenciamento profundo direcionada (etapa 4)21. Selecione clones únicos apropriados que sejam saudáveis e tenham um BE3 altamente ativo. NOTA: Para validar as frequências exatas de mutação, recomendamos o sequenciamento profundo direcionado do que o ensaio T7E1. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) é um local de destino bem validado para BE3.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Projeto e construção de BRCA1 visando gRNAs
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig02.jpg"> Figura 2: Um exemplo de DNA plasmídeo gRNA. (A) Para editar efetivamente a sequência de destino com BE3, é necessário um NGG PAM (CCN PAM) que coloque o alvo C (alvo G) dentro de uma janela de cinco nucleotídeos. NGG PAM é mostrado em vermelho e a janela de edição base é representada por uma caixa cinza. (B) A sequência de gRNA para c.8047C&gt;T (H1283Y) é indicada e os pares C:G alvo são mostrados em vermelho enquanto a janela ativa é destacada por uma caixa cinza. Para clonagem de gRNA, as sequências de saliência indicadas em negrito são adicionadas em ambas as extremidades de 50. Os modelos para gRNA foram gerados pela ressarção dos dois oligonucleotídeos complementares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
NOTA: Os controles positivos e negativos das variantes BRCA1 são essenciais. Neste estudo, c.5252G&gt;A (R1751Q) e c.4527C&gt;T (Y1509Y) são usados como controles benignos. c.191G&gt;A (C64Y), 81-1G&gt;A e c.3598C&gt;T (Q1200*) são usados como controles patogênicos. As sequências de destino de cada gRNA estão listadas na Tabela Suplementar 1.
<ol><li>Obtenha a sequência de genoma BRCA1 do GenBank no NCBI22.</li>
	<li>Pesquise os locais de destino de 20 bps com a sequência "NGG" e "CCN" do Protospacer Adjacent Motif (PAM) em torno da mutação de interesse. A mutação de interesse deve estar localizada em 4-8 nucleotídeos na extremidade PAM-distal das sequências de alvo gRNA devido à janela ativa do BE3 é de 4 a 8 nucleotídeos na extremidade PAM-distal das sequências de alvo gRNA14. No caso de c.8047C&gt;T (H1283Y)- e c.5252G&gt;A (R1751Q)-targeting gRNAs, 50-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-30 e 50-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-30, as sequências em negrito são janelas ativas. As conversões C a T e G para A ocorrem com NGG e CCN PAM, respectivamente (Figura 2A). NOTA: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 é uma ferramenta baseada na Web útil para design gRNA.</li>
	<li>Encomendar dois oligonucleotídeos complementares por gRNA; para os oligonucleotídeos dianteiros, adicione "CACCG" à extremidade 50 da sequência guia, e para os oligonucleotídeos invertidos, adicione "AAAC" ao final de 5' e "C" ao final de 3'. Essas sequências adicionais são específicas do vetor de expressão gRNA de destino (a partir da etapa 2.5) usado para este protocolo, e os usuários devem ser ajustados para vetores alternativos de expressão gRNA(Figura 2B).</li>
	<li>Resuspend o oligonucleotídeo em água destilada em uma concentração final de 100 μM. Misture os dois oligonucleotídeos complementares a uma concentração final de 10 μM com tampão de ligadura T4(Tabela de Materiais)e aqueça-os a 95 °C por 5 min e esfrie-os à temperatura ambiente para ressarcimento.</li>
	<li>Digeste pRG2 utilizando a enzima de restrição, BsaI (1 unidade por 1 μg) por 1 h a 37 °C(Tabela de Materiais). Execute o produto digerido em gel de 1% de agarose e purifique a banda de tamanho apropriado (2,5 kb). NOTA: Em vez de usar um método clássico de digestão e ligadura, outro método de clonagem, como a clonagem golden gate, pode ser usado.</li>
	<li>Ligate o duplex de oligonucleotídeo regaled ao DNA vetorial usando a ligase de DNA adquirida(Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante e transformá-los em células alfa-competentes DH5 (Outras cepas E. coli que amplamente utilizadas para subcloamento também podem ser usadas).</li>
	<li>Adicione os transformadores a uma placa de ágar contendo ampicillina (100 μg/mL) e incubar a placa durante a noite a 37 °C. Purificar o DNA plasmídeo de vários transformadores e analisar suas sequências de gRNA por sequenciamento Sanger usando primers que prime no U6 promoter(Tabela de Materiais).</li>
</ol>3. Criação de variantes BRCA1 usando ferramentas de edição base mediadas pelo CRISPR
NOTA: Se as linhas celulares HAP1-BE3 não forem utilizadas, o DNA plasmídeo codificador BE3 pode ser co-transfeinado com gRNA brca1-targeting. Em comparação com a co-transfecção de plasmídeos BE3 e gRNA, a transfecção de plasmídeos de gRNA para células HAP-BE3 induz a edição eficiente de base de até 3 vezes no lócus alvo em nossas mãos.
<ol><li>Sementes 5 x 105 células HAP1-BE3 (ou células HAP1 em caso de métodos de co-transfecção) por poço em placas de 24 poços 1 dia antes da transfecção. No momento da transfecção, as células culturais atingem uma densidade adequada (70%-80% confluência).</li>
	<li>Transfect BRCA1-targeting gRNAs utilizando os reagentes de transfecção adquiridos(Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante. Use 1 μg de gRNAs de segmentação BRCA1(com 1 μg de DNA plasmídeo codificador BE3 em caso de métodos de co-transfecção) para induzir C:G a T:A conversão em locais alvo BRCA1. Incubar as células a 37 °C e subcultura a cada 3-4 dias.</li>
	<li>Colher as pelotas celulares 3, 10 e 24 dias após a transfecção para analisar a eficiência de edição base (Amostras de 3 dias após a transfecção são analisadas como amostras do dia 0).</li>
	<li>Extrair DNA genômico utilizando o kit de purificação de DNA genômico(Tabela de Materiais). NOTA: Recomendamos otimizar as condições de transfecção com proporção variável de reagente para DNA. A condição ideal para transfecção hap1 é 4:1 ração de reagente para DNA em nossas mãos.</li>
</ol>4. Preparação da amostra para sequenciamento de próxima geração de Illumina (NGS)
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig03.jpg"> Figura 3: Preparação para sequenciamento de próxima geração. O primer 1st PCR foi projetado para amplificar o local alvo BRCA1 no DNA genômico. O primer2º PCR foi projetado de tal forma que suas sequências estão localizadas mais dentro do que as sequências de primer 1st PCR. Sequências adicionais mostradas como uma barra amarela foram adicionadas em ambas as extremidades do primer2º PCR para anexar as sequências essenciais para realizar o sequenciamento da próxima geração. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Projete os primers 1st PCR para amplificar os locais de destino BRCA1. Embora não haja restrição sobre o tamanho do produto 1st PCR, recomenda-se um tamanho de produto de &lt;1 kb para amplificar eficientemente uma região específica(Figura 3).</li>
	<li>Projete os 2primers PCR localizados dentro do produto1º PCR. Considere o tamanho do amplicon de acordo com o comprimento de leitura do NGS (Por exemplo, o tamanho do produto amplicon deve ser menor que 300 bp por 2 × corrida final emparelhada de 150 bp para mesclar cada leitura). A fim de anexar sequências essenciais para análise de NGS, adicionar sequências adicionais ao final de 5' dos primers2'º PCR da seguinte forma: para os primers dianteiros, adicione sequências de 5'-ACACTCTTTCTCTACACGACGACGCTTCCGATCT-3' ao final de 5' e, para os primers invertidos, adicione sequências ATCT-3 de 5'-GTGACTGGAGAGCGTGTCGTTCTTCCG ATCT-3' ao final de 5''. NOTA: Usamos PCR aninhado para reduzir a amplicon de vinculação não específica, impedindo que os primers se conectem à sequência não-alvo.</li>
	<li>Amplifique os locais alvo brca1 no DNA genômico obtido a partir de três pontos de tempo. Use polimerase de alta fidelidade de acordo com o protocolo do fabricante para minimizar os erros de PCR. Para a reação 1st PCR, use 100 ng de DNA genômico para amplificação ao longo de 15 ciclos. Para a reação2 º PCR, use 1 μL do 1º produto PCR para amplificação ao longo de 20 ciclos. Execute 5 μL do2º produto PCR em gel de 2% de agarose e confirme o tamanho.</li>
	<li>A fim de anexar as sequências essenciais para a análise de NGS, amplie o2º produto PCR usando os primers listados abaixo. Para a reação pcr, 1 μL do2º produto PCR é usado para amplificação de até 30 ciclos usando polimerase de alta fidelidade.<ol>
<li>Para realizar o sequenciamento multiplex para que um grande número de bibliotecas sejam agrupadas e sequenciadas simultaneamente, use primers para frente (D501 – D508) e primers reversos (D701 – D712), que possuem sequência de índice única(Tabela Suplementar 1). Amplie cada amostra usando conjuntos de primers diferentes para conduzir a estratégia única de indexação dupla.</li>
		<li>Execute 5 μL do produto PCR em gel de 2% de agarose para confirmar o tamanho e purifique o amplicon usando um kit comercial de limpeza pcr(Tabela de Materiais). Misture cada amostra em quantidades iguais para criar uma biblioteca NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifique a biblioteca NGS em comprimento de onda de 260 nm usando espectrofotômetros e dilua a biblioteca NGS para concentração de 1 nM usando tampão de resuspensão ou 10 mM Tris-HCl, pH 8.5. Prepare 100 μL da biblioteca diluída para a concentração de carregamento apropriada, dependendo dos tipos de biblioteca (Por exemplo, prepare 200 pM da biblioteca para Nextera DNA Flex).<ol>
<li>Como controle, combine phiX com a amostra diluída apropriada para o tipo de kit.</li>
		<li>Carregue a biblioteca no cartucho e execute o NGS de acordo com o protocolo do fabricante. Os sistemas Illumina iSeq 100 ou Miseq podem sequenciar os amplicons de vários comprimentos até 300 bp para final de leitura única ou emparelhado. Recomendamos mais de 10.000 leituras por amplicon alvo para análise aprofundada da eficiência de edição base.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Análise da eficiência de edição base para a avaliação funcional das variantes BRCA1
<ol><li>Analise as eficiências de edição base usando MAUND24. A eficiência de edição base é calculada conforme descrito abaixo. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61557/61557equ01.jpg"> Se várias citosinas estiverem presentes na janela ativa BE3, apenas a conversão C para T que é direcionada para avaliação da variante BRCA1 é considerada. Por exemplo, se as sequências da janela ativa BE3 são "C4A5T6C7T8",as possíveis sequências geradas pela edição base são "T4A5T6C7T8","C4A5T 6 T7T8",e "T4A5T 6 T7T8". Neste momento, se a posição 4 for a posição alvo da variante BRCA1 desejada, entãoapenasa sequência "T 4 A5T6C7T8" é considerada para calcular a eficiência de edição base. NOTA: Também recomendamos outras ferramentas web para análise de atividades de edição base, como CRISPResso225e BE-analyzer23.</li>
	<li>Verifique os resultados utilizando controles positivos e negativos das variantes BRCA1. As eficiências de edição base do controle benigno devem permanecer as mesmas, enquanto as do controle patogênico devem diminuir com o tempo.</li>
	<li>Calcule a eficiência relativa da edição de base das variantes BRCA1 e determine sua patogenicidade. As diferenças significativas entre as amostras do dia 0 e 21 do dia 21 são analisadas análises estatísticas adequadas, como o teste T.</li>
</ol>

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<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+library+of+TAL+effector+nucleases+spanning+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).</li>
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<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li>
<li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. , (2020).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+target+specificities+of+CRISPR+RNA-guided+programmable+deaminases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).</li>
<li>Zuo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+base+editor+generates+substantial+off-target+single-nucleotide+variants+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos.</a> Science. 364 (6437), 289-292 (2019).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine%2C+but+not+adenine%2C+base+editors+induce+genome-wide+off-target+mutations+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice.</a> Science. 364 (6437), 292-295 (2019).</li>
<li>Grunewald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+off-target+RNA+editing+induced+by+CRISPR-guided+DNA+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors.</a> Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).</li>
<li>Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+minimization+of+Cas9-independent+off-target+DNA+editing+by+cytosine+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).</li>
<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+A%2AT+to+G%2AC+in+genomic+DNA+without+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage.</a> Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).</li>
<li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve um método simples para avaliações funcionais das variantes BRCA1 usando o editor base de citosina meditada por CRISPR. O protocolo descreve métodos para o desenho de gRNAs no lócus alvo e construção dos DNAs plasmídeos dos quais são expressos. Os editores de base de citosina induzem a conversão de nucleotídeos em uma janela ativa (no caso de BE3, nucleotídeos 4-8 na extremidade PAM-distal das sequências de alvo gRNA). O pesquisador deve escolher cuidadosamente sequências de destino porque...

O gene de suscetibilidade do câncer de mama tipo 1 (BRCA1) é um gene supressor de tumor amplamente conhecido. Como o gene BRCA1 está relacionado à reparação de danos no DNA, mutações nesse gene levariam a um maior risco de desenvolvimento de câncer em um indivíduo1. Câncer de mama, ovário, próstata e pâncreas estão ligados a mutações herdadas de perda de função (LOF) do gene BRCA1 2. A avaliação funcional e identificação das variantes BRCA1 podem ajudar na prevenção e diagnóstico das diversas doenças. Para abordar a função das variantes BRCA1, vários métodos foram desenvolvidos e amplamente utilizados para investigar a patogenicidade das variantes BRCA1, como ensaios de viabilidade de células-tronco embrionárias, ensaios de repórteres fluorescentes e ensaios de sensibilidade à base de drogas terapêuticas3,4,5,6. Embora esses métodos tenham avaliado a função de muitas variantes BRCA1, os métodos que envolvem variantes BRCA1 exogenousamente expressas apresentam limitações em termos de superexpressão que podem afetar a regulação a jusante, a dosagem genética e a dobra deproteínas 7. Além disso, esses ensaios não podem ser aproveitados para a regulamentação pós-transcrição, como emenda mRNA, estabilidade da transcrição e efeito da região não traduzida8,9.
O sistema CRISPR-Cas9 permite a edição de genomas direcionados em células vivas e organismos10. Através de um RNA de guia único, o Cas9 pode induzir quebras de dois fios (DSBs) no DNA cromossômico em loci genômicos específicos, a fim de ativar duas vias de reparaçãode DNA: caminho de junção final nonhomologous propensa a erros (NHEJ) e caminho de reparo direcionado por eliseução não-11 (HDR) sem erros . HDR é um mecanismo de reparo preciso; no entanto, os DSBs induzidos por nuclease Cas9 para HDR muitas vezes resulta em inserção indesejada e supressão (indel) mutação. Além disso, precisa de modelos de DNA de doadores homólogos para reparar danos de DNA e tem relativamente baixa eficiência. Recentemente, cas9 nickase (nCas9) foram fundidos com domínios de deaminase cytidina para direcionar substituições C:G a T:A, sem a necessidade de modelos de DNA homólogos e quebras de cadeia dupla de DNA12,13,14,15. Utilizando o editor base de citosina, desenvolvemos um novo método de análise funcional das variantes BRCA116.
Neste estudo, utilizou-se o editor de base de citosina mediada pelo CRISPR, BE314, que induz mutações eficientes de C:G a T:A point, para a implementação da avaliação funcional das variantes BRCA1 e identificou com sucesso as funções de várias variantes BRCA1 (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig01.jpg"> Figura 1: Uma visão geral do fluxo de trabalho para avaliação funcional. (A) Esquema mostrando a avaliação funcional do BRCA1. Como o LOF do BRCA1 afeta a viabilidade celular, quando a mutação BRCA1 é patogênica, as células morrem à medida que o número de passagem aumenta. (B) Etapas da avaliação funcional do BRCA1. A caixa pontilhada é opcional. Pode ser substituído por co-transfecção de gRNA expressando e BE3 expressando DNA de plasmídeos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td>Enzima de restrição</td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113903</td><td>Droga para selecionar células transduzidas</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>de restrição DNeasy Blood & Kit de lenços de papel</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Kit de preparação de DNA genômico</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Medium para HEK293T/17 células</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td>Supplemetal para cultura de células</td></tr><tr><td>FuGENE HD Reagente de transfecção</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Kit de montagem Gibson</td></tr><tr><td>Iscove' s Dulbecco modificado » s meio</td><td>Gibco</td><td>12440046</td><td>Meio para células HAP1</td></tr><tr><td>lentiCas9-Blast</td><td>Addgene</td><td>52962</td><td>DNA de plasmídeos para clonagem lentiBE3</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>Materiais de transfecção</td></tr><tr><td>pCMV-BE3</td><td>Addgene</td><td>73021</td><td>DNA de plasmídeos para lentiBE3 clonagem</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Supplemetal para cultura</td></tr><tr><td>de células Phusion DNA de alta fidelidade polimerase</td><td>NEB</td><td>M0530SQ</td><td>Polimerase de alta fidelidade</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>DNA de plasmídeos para preparação de vírus.</td></tr><tr><td>pRG2</td><td>Addgene</td><td>104174</td><td>vetor de clonagem de gRNA</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>DNA de plasmídeos para preparação de vírus.</td></tr><tr><td>Kit QIAprep Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Kit de preparação de DNA de plasmídeo</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extração de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Kit de extração de gel</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purificação de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Kit de preparação de produto PCR</td>Kit</tr><tr><td>de ligadura rápida</td><td>NEB</td><td>M2200</td><td>Ligase para clonagem de gRNA</td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>Materiais para ensaio T7E1</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td>Enzima de restrição</td></tr></tbody></table>

avaliação funcional das variantes brca1 usando editores de base mediados pelo crispr

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Estudos recentes têm investigado os riscos associados às mutações genéticas BRCA1 usando vários métodos de avaliação funcional, como ensaios de repórteres fluorescentes, ensaios de viabilidade de células-tronco embrionárias e ensaios de sensibilidade à base de drogas terapêuticas. Embora tenham esclarecido muitas variantes brca1, estes ensaios envolvendo o uso de variantes BRCA1 exogenously expressas estão associados a questões de superexpressão e não podem ser aplicados à regulação pós-transcrição. Para resolver essas limitações, relatamos anteriormente um método de análise funcional das variantes BRCA1 através do editor de base de citosina mediada pelo CRISPR que induz a substituição de nucleotídeos direcionados em células vivas. Usando este método, identificamos variantes cujas funções permanecem ambíguas, incluindo c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T e c.4986+5G>A, e confirmaram que os editores de base mediados pelo CRISPR são ferramentas úteis para reclassificar as variantes de significado incerto no BRCA1. Aqui, descrevemos um protocolo para análise funcional das variantes BRCA1 usando o editor base de citosina baseado em CRISPR. Este protocolo fornece diretrizes para a seleção de locais-alvo, análise funcional e avaliação das variantes BRCA1.

As abordagens experimentais descritas neste protocolo permitem a avaliação funcional das variantes brca1 endógenas geradas pelos editores de base de citosina baseadas em CRISPR. Para selecionar linhas celulares apropriadas para a avaliação funcional das variantes BRCA1, os pesquisadores devem confirmar que o BRCA1 é um gene essencial nas linhas celulares alvo. Por exemplo, nós primeiro transfeinamos Cas9 e gRNAs em linhas celulares HAP1 para interromper brca1 e analisamos frequências d...

Pessoas com mutações BRCA1 têm maior risco de desenvolver câncer, o que garante uma avaliação precisa da função das variantes BRCA1. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base de citosina mediados pelo CRISPR que permitem a conversão de C:G para T:A direcionada em células vivas.

Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Ao induzir eficientemente mutações pontuais usando o editor de bases de citosina mediada pelo CRISPR, a funcionalidade das variantes BRCA1, importante para a prevenção e diagnóstico de doenças, pode ser identificada. A vantagem dessa técnica é que ela muta diretamente brca1 expresso endógeno, o que supera a limitação da avaliação funcional utilizando BRCA1 exogenously expresso. A identificação da perda de mutações de função do BRCA1 pode ser usada para prever a chance de desenvolver cânceres associados a mutações BRCA1, como câncer de mama, ovário, próstata e pâncreas.Também pode ser usado para encontrar potenciais alvos de drogas, procurando genes essenciais cuja viabilidade é reduzida através do esgotamento funcional. Para começar, obtenha a sequência de genoma BRCA1 do GenBank no NCBI e pesquise os 20 locais-alvo do par base com a sequência de motivos adjacentes protoespaço, NGGNCCN, em torno da mutação de interesse. A mutação de interesse deve estar localizada dentro de quatro a oito nucleotídeos na extremidade PAM-distal das sequências de alvo guia RNA.Peça dois oligonucleotídeos gratuitos por guia RNA. Para os oligonucleotídeos dianteiros, adicione CACCG ao final de 5'end da sequência guia e para os oligonucleotídeos invertidos, adicione AAC ao 5'end e C ao final de 3'end. Depois de receber os oligonucleotídeos, resuspensá-los em água destilada para uma concentração final de 100 micromolar.Misture os dois oligonucleotídeos complementares a uma concentração final de 10 micromolar com tampão de ligadura T4 e aqueça-os a 95 graus Celsius por cinco minutos e depois esfrie-os à temperatura ambiente para ressarcimento. Digerir pRG2 usando a enzima de restrição Bsa1 por uma hora a 37 graus Celsius, em seguida, executar o produto digerido em um gel de 1%agarose e purificar a faixa de tamanho apropriado. Ligate o duplex de oligonucleotídeo realado ao DNA vetorial usando a liga ligase de DNA comprada de acordo com o protocolo do fabricante e transforme-os em células competentes DH5-alfa.Adicione os transformadores a uma placa de ágar contendo 100 microgramas por ampicillina mililitro e incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius. Purificar o DNA plasmá plasma de vários transformadores e analisar suas sequências de RNA guia por Sanger sequenciamento com primers que prime no promotor U6. Semente cinco vezes 10 para a quinta células HAP1-BE3 por poço em placas de 24 poços um dia antes da transfecção e cultas para atingir 70 a 80% de confluência para transfecção.Transfect BRCA1 guia de segmentação RNAs usando os reagentes de transfecção comprados de acordo com o protocolo do fabricante. Use um micrograma de GUIA DE ALVO BRCA1 RNAs para induzir a conversão de CG para TA em locais alvo BRCA1 e incubar as células a 37 graus Celsius e subcultura a cada três ou quatro dias. Colher as pelotas de célula três, 10 e 24 dias após a transfecção para analisar a eficiência de edição da base.Extrair DNA genômico usando o kit de purificação de DNA genômico. Projete os primeiros primers pcr para amplificar os locais de destino BRCA1. Embora não haja restrição sobre o tamanho do primeiro produto PCR, recomenda-se um tamanho de produto de menos de um quilobases para amplificar eficientemente uma região específica.Projete os segundos primers pcr localizados dentro do primeiro produto PCR, levando em consideração o tamanho do amplicon de acordo com o comprimento de leitura ngs. A fim de anexar sequências essenciais para análise de NGS, adicione sequências adicionais às extremidades de 5'ends das primers pcr. Amplie os locais alvo brca1 no DNA genômico obtido a partir dos três pontos de tempo usando polimerase de alta fidelidade.Para a primeira reação pcr, use 100 nanogramas de DNA genômico para amplificação ao longo de 15 ciclos. Para a segunda reação pcr, use um microliter do primeiro produto PCR para amplificação ao longo de 20 ciclos. Execute cinco microliters do segundo produto PCR em gel de 2% agarose e confirme o tamanho.Em seguida, conecte as sequências essenciais para a análise de NGS ampliando o segundo produto PCR usando os primers listados no manuscrito do texto. Amplie cada amostra usando diferentes conjuntos de primer. Use um microliter do segundo produto PCR para até 30 ciclos de amplificação com uma polimerase de alta fidelidade.Execute cinco microliters do produto PCR em gel de 2% agarose para confirmar o tamanho e purificar o amplicon usando um kit comercial de limpeza PCR. Misture cada amostra em quantidades iguais para criar uma biblioteca NGS. Quantifique a biblioteca NGS usando um espectrofotômetro e dilui-a a uma concentração de um nanomolar usando tampão de resuspensão ou Tris-HCl de 10 mililitros em pH 8.5.Prepare 100 microliters da biblioteca diluídos para a concentração de carregamento apropriada. Como controle combinado PhiX com a amostra diluída. Carregue a biblioteca no cartucho e execute o NGS de acordo com o protocolo do fabricante.Obtenha mais de 10.000 leituras por amplicon de destino para análise aprofundada da eficiência de edição base. Este protocolo foi utilizado para realizar uma avaliação funcional das variantes brca1 endógenas geradas por editores de base de citosina baseadas em CRISPR. Cas-9 e guia RNAs foram transfectados em linhas celulares HAP1 para interromper o BRCA1, e as frequências de mutação foram analisadas.As frequências de mutação diminuíram significativamente ao longo do tempo nas linhas celulares HAP1, indicando que o BRCA1 é um gene essencial para a viabilidade celular nessas células. Para investigar se as variantes substituídas por CG para TA afetam a função do BRCA1, os plasmídeos de DNA e o guia de codificação RNAs que poderiam induzir cada mutação foram transfectados para ter linhas celulares HAP1-BE3. E as frequências de substituição foram analisadas.As frequências relativas de substituição de 3598C para T, uma variante patogênica que induz uma mutação sem sentido, diminuiu drasticamente. Considerando que as de 4527C a T, uma variante benigna que induz uma mutação sem sentido, permaneceram semelhantes com o tempo. Verificou-se que as frequências de substituição de nucleotídeos dessas três variantes diminuíram de forma dependente do tempo.Uma vez que é necessário obter uma alta frequência inicial de mutação para reconhecer claramente a mudança na viabilidade celular com a passagem da data, é prioritário estabelecer condições otimizadas de transfecção. Este procedimento pode ser aplicado para verificar outras variantes genéticas desconhecidas, como BRCA VUS. Pode fornecer pistas para a patogenicidade de variantes desconhecidas derivadas do paciente e seu tratamento.

functional-assessment-brca1-variants-using-crispr-mediated-base

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Nós fornecemos um método para testar variantes BRCA1 em um ensaio de cultura de tecidos com base homóloga de reparação de danos no DNA de recombinação, esgotando proteína BRCA1 endógenos de uma célula usando RNAi e substituindo-o por um mutante ponto BRCA1 que contém uma mudança de codificação.

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O enriquecimento de gDNA para sequenciamento NGS é uma ferramenta fácil e poderosa para o estudo de mutações constitucionais. Neste artigo, apresentamos o procedimento para analisar de forma simples a sequência completa de 11 genes envolvidos no reparo de danos ao DNA.

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Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

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O objetivo deste protocolo é permitir a edição perfeita do genoma C. elegans usando complexos de ribonucleoproteína montados e o marcador co-CRISPR dpy-10 para triagem. Este protocolo pode ser usado para fazer uma variedade de modificações genéticas em C. elegans incluindo inserções, exclusões, substituições genéticas e substituições de codon.

CRISPR/Cas9 Edição do Gene C. elegans rbm-3.2 utilizando o marcador de triagem co-CRISPR dpy-10 e complexos de ribonucleoproteína montados.

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de edição de genes de edição de genes (CRISPR) regularmente interespaçado de alto rendimento para análise de rede de clusters microRNA que permite a geração rápida de um painel de linhas celulares geneticamente modificadas carregando combinações únicas de exclusão de membros de cluster miRNA de até 35 kb dentro de um único experimento.

Ferramenta de edição de genes CRISPR para análise de rede de cluster microrna

Este protocolo descreve como realizar uma edição eficiente da base de adenina sem limitação de PAM para construir um modelo preciso de doença do peixe-zebra usando zSpRY-ABE8e.

Edição de Base Eficiente sem PAM para Modelagem de Zebrafish de Doenças Genéticas Humanas com zSpRY-ABE8e

Uma barreira significativa para tecnologias como o CRISPR são os eventos fora do alvo que podem interromper genes vitais. 'Circularização para relatórios in vitro de efeitos de clivagem por sequenciamento' (CIRCLE-seq) é uma técnica projetada para identificar locais de clivagem não intencionais. Este método mapeia a atividade de todo o genoma do CRISPR-Cas9 com alta sensibilidade e sem viés.

CIRCLE-Seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo

A entrega de editores genômicos como RNAs é um meio particularmente potente de modificar os genomas das células primárias e linhagens celulares de mamíferos. O objetivo desse protocolo é entregar editores genômicos como mRNA em células e linhagens celulares primárias de mamíferos, seguido por sequenciamento e análise direcionados da Illumina para quantificar os resultados da edição.

Edição do Genoma em Células Primárias de Mamíferos por Eletroporação do RNA Editor

Aprenda a avaliar variantes BRCA1 usando editores de base CRISPR em células vivas. Este método permite mutações diretas no gene endógeno, superando limitações de técnicas tradicionais e auxiliando na predição de risco de câncer.

Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

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