Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

Ao induzir eficientemente mutações pontuais usando o editor de bases de citosina mediada pelo CRISPR, a funcionalidade das variantes BRCA1, importante para a prevenção e diagnóstico de doenças, pode ser identificada. A vantagem dessa técnica é que ela muta diretamente brca1 expresso endógeno, o que supera a limitação da avaliação funcional utilizando BRCA1 exogenously expresso. A identificação da perda de mutações de função do BRCA1 pode ser usada para prever a chance de desenvolver cânceres associados a mutações BRCA1, como câncer de mama, ovário, próstata e pâncreas.

Também pode ser usado para encontrar potenciais alvos de drogas, procurando genes essenciais cuja viabilidade é reduzida através do esgotamento funcional. Para começar, obtenha a sequência de genoma BRCA1 do GenBank no NCBI e pesquise os 20 locais-alvo do par base com a sequência de motivos adjacentes protoespaço, NGGNCCN, em torno da mutação de interesse. A mutação de interesse deve estar localizada dentro de quatro a oito nucleotídeos na extremidade PAM-distal das sequências de alvo guia RNA.

Peça dois oligonucleotídeos gratuitos por guia RNA. Para os oligonucleotídeos dianteiros, adicione CACCG ao final de 5'end da sequência guia e para os oligonucleotídeos invertidos, adicione AAC ao 5'end e C ao final de 3'end. Depois de receber os oligonucleotídeos, resuspensá-los em água destilada para uma concentração final de 100 micromolar.

Misture os dois oligonucleotídeos complementares a uma concentração final de 10 micromolar com tampão de ligadura T4 e aqueça-os a 95 graus Celsius por cinco minutos e depois esfrie-os à temperatura ambiente para ressarcimento. Digerir pRG2 usando a enzima de restrição Bsa1 por uma hora a 37 graus Celsius, em seguida, executar o produto digerido em um gel de 1%agarose e purificar a faixa de tamanho apropriado. Ligate o duplex de oligonucleotídeo realado ao DNA vetorial usando a liga ligase de DNA comprada de acordo com o protocolo do fabricante e transforme-os em células competentes DH5-alfa.

Adicione os transformadores a uma placa de ágar contendo 100 microgramas por ampicillina mililitro e incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius. Purificar o DNA plasmá plasma de vários transformadores e analisar suas sequências de RNA guia por Sanger sequenciamento com primers que prime no promotor U6. Semente cinco vezes 10 para a quinta células HAP1-BE3 por poço em placas de 24 poços um dia antes da transfecção e cultas para atingir 70 a 80% de confluência para transfecção.

Transfect BRCA1 guia de segmentação RNAs usando os reagentes de transfecção comprados de acordo com o protocolo do fabricante. Use um micrograma de GUIA DE ALVO BRCA1 RNAs para induzir a conversão de CG para TA em locais alvo BRCA1 e incubar as células a 37 graus Celsius e subcultura a cada três ou quatro dias. Colher as pelotas de célula três, 10 e 24 dias após a transfecção para analisar a eficiência de edição da base.

Extrair DNA genômico usando o kit de purificação de DNA genômico. Projete os primeiros primers pcr para amplificar os locais de destino BRCA1. Embora não haja restrição sobre o tamanho do primeiro produto PCR, recomenda-se um tamanho de produto de menos de um quilobases para amplificar eficientemente uma região específica.

Projete os segundos primers pcr localizados dentro do primeiro produto PCR, levando em consideração o tamanho do amplicon de acordo com o comprimento de leitura ngs. A fim de anexar sequências essenciais para análise de NGS, adicione sequências adicionais às extremidades de 5'ends das primers pcr. Amplie os locais alvo brca1 no DNA genômico obtido a partir dos três pontos de tempo usando polimerase de alta fidelidade.

Para a primeira reação pcr, use 100 nanogramas de DNA genômico para amplificação ao longo de 15 ciclos. Para a segunda reação pcr, use um microliter do primeiro produto PCR para amplificação ao longo de 20 ciclos. Execute cinco microliters do segundo produto PCR em gel de 2% agarose e confirme o tamanho.

Em seguida, conecte as sequências essenciais para a análise de NGS ampliando o segundo produto PCR usando os primers listados no manuscrito do texto. Amplie cada amostra usando diferentes conjuntos de primer. Use um microliter do segundo produto PCR para até 30 ciclos de amplificação com uma polimerase de alta fidelidade.

Execute cinco microliters do produto PCR em gel de 2% agarose para confirmar o tamanho e purificar o amplicon usando um kit comercial de limpeza PCR. Misture cada amostra em quantidades iguais para criar uma biblioteca NGS. Quantifique a biblioteca NGS usando um espectrofotômetro e dilui-a a uma concentração de um nanomolar usando tampão de resuspensão ou Tris-HCl de 10 mililitros em pH 8.5.

Prepare 100 microliters da biblioteca diluídos para a concentração de carregamento apropriada. Como controle combinado PhiX com a amostra diluída. Carregue a biblioteca no cartucho e execute o NGS de acordo com o protocolo do fabricante.

Obtenha mais de 10.000 leituras por amplicon de destino para análise aprofundada da eficiência de edição base. Este protocolo foi utilizado para realizar uma avaliação funcional das variantes brca1 endógenas geradas por editores de base de citosina baseadas em CRISPR. Cas-9 e guia RNAs foram transfectados em linhas celulares HAP1 para interromper o BRCA1, e as frequências de mutação foram analisadas.

As frequências de mutação diminuíram significativamente ao longo do tempo nas linhas celulares HAP1, indicando que o BRCA1 é um gene essencial para a viabilidade celular nessas células. Para investigar se as variantes substituídas por CG para TA afetam a função do BRCA1, os plasmídeos de DNA e o guia de codificação RNAs que poderiam induzir cada mutação foram transfectados para ter linhas celulares HAP1-BE3. E as frequências de substituição foram analisadas.

As frequências relativas de substituição de 3598C para T, uma variante patogênica que induz uma mutação sem sentido, diminuiu drasticamente. Considerando que as de 4527C a T, uma variante benigna que induz uma mutação sem sentido, permaneceram semelhantes com o tempo. Verificou-se que as frequências de substituição de nucleotídeos dessas três variantes diminuíram de forma dependente do tempo.

Uma vez que é necessário obter uma alta frequência inicial de mutação para reconhecer claramente a mudança na viabilidade celular com a passagem da data, é prioritário estabelecer condições otimizadas de transfecção. Este procedimento pode ser aplicado para verificar outras variantes genéticas desconhecidas, como BRCA VUS. Pode fornecer pistas para a patogenicidade de variantes desconhecidas derivadas do paciente e seu tratamento.