Diferenciação de monócitos em macrófagos fenotipicamente distintos após o tratamento com células-tronco do sangue do cordão humano (CB-SC)-Exósmos derivados

A terapia de educador de células-tronco foi desenvolvida para tratar diabetes tipo I e outra doença autoimune. Este método foi desenvolvido para explorar o mecanismo de molécula subjacente à moderação imunológica da terapia de educador de células-tronco através de exosóis liberados pelo CB-SC. Este protocolo fornece orientações sobre como purificar exosóis de culturas de células-tronco sanguíneas do cordão umbilical humano e determinar sua modulação imunológica de monócitos.

Demonstrando o procedimento será Wei Hu, uma estudante de doutorado, do meu laboratório. Para começar, centrífugue o meio condicionado derivado do CB-SC três vezes como descrito no manuscrito do texto, coletando o supernatante em um novo tubo cônico de 50 mililitros após cada centrifugação. Após a terceira centrifugação, filtre o supernante obtido com um filtro de microliter de 0,22 e transfira 15 mililitros de mídia para cada unidade de filtro centrífugo de 10 kilodalton.

Centrífugas a 4.000 x g por 30 minutos para isolar a mídia exosome concentrada. Transfira os exossomos concentrados para um tubo ultracentrífuga. Em seguida, pellet os exossomos a 100.000 x g por 80 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, descarte o supernatante e resuspenda os exossomos pelleted em 10 mililitros de PBS. Realize uma ultracentrifugação final para coletar a pelota exome e resuspensá-la em 200 microliters de PBS. Adicione 30 milhões de PBMCs humanos a um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 300 x g por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Resuspengue as células em 300 microliters de PBS frio e adicione 60 microesculadores de microesferas CD14. Misture bem e incuba as células no gelo por 15 minutos. Adicione mais seis mililitros de PBS frio e centrífuga a 300 x g por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, resuspende as células pelotas em 500 microliters de tampão de corrida a frio. Coloque a coluna de separação no separador de ímãs e lave-a três vezes com dois mililitros de tampão de corrida a frio. Transfira as células resuspended para a coluna de separação e deixe-as passar.

Novamente, lave a coluna três vezes com dois mililitros de tampão de corrida por lavagem. Em seguida, levante a coluna do separador de ímãs e coloque-a sobre um tubo de centrífuga de 15 mililitros no gelo. Elute as células positivas CD14 com dois mililitros de tampão de corrida a frio e centrifusado a 300 x g por 10 minutos a quatro graus Celsius para pelotar as células.

Resuspend a pelota em dois mililitros de meio soro químico frio definido e transfira 50 microliters dele em um tubo de 1,5 mililitro. Manche as células obtidas com 10 microlitadores de anticorpos monoclonais cd14 conjugados por 20 minutos. Adicione um mililitro de PBS e centrífuga a 300 x g por 10 minutos para de pelotar as células.

Resuspend a pelota celular em 200 microliters de PBS e transferi-lo para um tubo de cinco mililitros. Determine a pureza de CD14+monócitos por citometria de fluxo. Semente um milhão dos monócitos purificados obtidos em uma cultura tecidual tratada placa de seis poços e incubar por duas horas a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono.

Após a incubação descarte o supernatante e adicione suavemente dois mililitros de 37 graus de meio de cultura sem soro pré-aquecido, depois adicione 80 microgramas dos exosóis derivados do CB-SC à cultura monócito na placa de seis poços com um volume total de dois mililitros. Incubar a placa a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono por três a quatro dias. Em seguida, imagem a morfologia celular usando um microscópio invertido na ampliação de 200X.

Adicione um mililitro de tampão de dissociação celular baseado em PBS para desprender as células pipetando para cima e para baixo e colher as células restantes com um raspador de células. Colete as células por centrifugação a 1.690 x g por cinco minutos e resuspensá-las em 200 microliters de PBS. Adicione cinco microliters de bloqueador FC para bloquear a ligação não específica e, em seguida, adicione os anticorpos.

Incubar as células à temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione um mililitro de PBS às células incubadas e centrífugue-as a 300 x g por 10 minutos. Resuspenja a pelota em 200 microliters de PBS e adicione cinco microliters de iodeto de propídio por amostra.

Transfira as células para um novo tubo de fluxo de cinco mililitros e execute a citometria de fluxo para avaliar os níveis de expressão CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 e CD209. O fenótipo e a pureza dos CB-SCs foram examinados por citometria de fluxo com marcadores associados ao CB-SC. A análise mostrou altos níveis de cd45, OCT3/4, SOX2, CD270 e expressão galectin 9, mas nenhuma expressão de CD34 foi observada.

A análise da citometria de fluxo também confirma a expressão de marcadores específicos exome, CD9, CD 81 e CD63 em exosóis derivados do CB-SC. A morfologia de tamanho dos exosóis foi caracterizada pelo TEM e a distribuição de tamanho foi determinada pelo DLS. A mancha ocidental prova ainda mais a expressão do exome associado marcador Alix sem expressão do marcador associado ao ER, calnexin.

A interação direta do CB-SC-Exo com PBMC foi observada por meio de microscopia de fluorescência. Para melhor definir qual população celular interagiu com o discagem rotulado CB-SC-Exo, diferentes compartimentos celulares foram fechados com marcadores específicos de células, como CD3 para células T, CD11C para células dendríticas mieloides, CD14 para monócitos, CD19 para células B e CD56 para células NK. Os monócitos foram principalmente alvos dos exosóis derivados do CB-SC, pois apresentaram maior intensidade de fluorescência mediana do que as de outras células imunes.

Os monocitos tratados exosome se diferenciaram com sucesso em morfologias semelhantes a fusíveis. Houve uma regulação no nível de marcadores associados ao M2, como CD163, CD206 e CD209 após o tratamento com exosóis derivados do CB-SC. A comparação fenotípica entre os macrófagos M2 convencionais e os macrófagos M2 induzidos pelo CB-SC não apresentou diferenças significativas.

O passo chave neste protocolo é adicionar exosósmos derivados do CB-SC ao monócito da cultura em placas de seis poços e incuba-lo por três a quatro dias, o que precisava da diferenciação da célula para outros macrófagos tipo 2 com morfologia semelhante ao fuso. Em seguida, vamos explorar os componentes da molécula dentro de exosósmos derivados do CB-SC que contribuíram para a indução da diferenciação do monócito em macrófagos tipo 2.