Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas
22 de janeiro de 2021
Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.
Os dados gerados com essa técnica promoveram a compreensão de modelos de camundongos propensos a autoimunes, bem como camundongos humanizados, que podem ser usados para terapêutica geral de anticorpos ou anticorpos. A disponibilidade de reagentes com uma gama cada vez maior de fluoroforos, permite a análise simultânea de múltiplos parâmetros em células individuais e permite a avaliação da heterogeneidade celular B. Este protocolo foi desenvolvido com o propósito de fenotipar camundongos geneticamente modificados.
para determinar se a manipulação genética alteraria o desenvolvimento de células B. Oi, sou Faith Harris. Vou demonstrar o procedimento hoje.
Comece aliquoting um milhão de cada tipo de célula de cada animal em uma placa de fundo U de 96 poços. Certifique-se de que poços suficientes estejam disponíveis para todas as amostras e controles, incluindo manchas completas, amostras de fluorescência-menos-uma e amostras não manchadas para cada fluoróforo. Para o painel de maturação da medula óssea e o painel de maturação do baço, as células de alíquota em dois poços, 1 milhão de células por poço para cada amostra completa de manchas.
Para os controles de viabilidade de compensação de cores únicas, adicione dois milhões de células cada um de cada tipo de célula a poços individuais. Centrifugar a placa a 845 x g por dois minutos a quatro graus Celsius. Decante o supernatante invertendo rapidamente e sacudindo a placa sobre uma pia, tomando cuidado para não contaminar os poços.
Lave as células duas vezes em 200 microliters de DPBS. Centrifugar e decantar o sobrenante após cada lavagem. Resuspensar as células em 100 microliters de diluído em DPBS na proporção de um a 1000, evitando as células utilizadas para compensação de cor única.
Para cada conjunto de manchas, deixe vários poços não manchados para uma amostra completamente não manchada e outros controles que você pode precisar, bem como um poço adicional não manchado para o controle fmo de viabilidade. Adicione PBS a esses poços. Resuspend as células de controles de viabilidade de compensação de cores únicas em 200 microliters de corante de viabilidade diluída.
Transfira 100 microliters dessas células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e aqueça-o por cinco minutos a 65 graus Celsius, em seguida, transfira as células aquecidas de volta para o poço original com as células vivas restantes. Incubar as células a quatro graus Celsius por 30 minutos protegidos da luz. Após a incubação, centrifugar as células e decantar o supernante, piscando ou invertendo a placa sem contaminar os outros poços.
Lave as células reutilizando em 200 microlitres de DPBS, depois centrífugas e decantam o supernatante como antes. Repita a lavagem dpbs novamente. Adicione microliters de bloco FC diluídos com tampão de manchas em uma proporção de 1 a 50 para obter uma concentração final de 10 microgramas por mililitro.
Para células peritoneal, adicione cinco microliters de bloqueador de monócitos para reduzir a coloração inespecífica. Em seguida, incubar as células a quatro graus Celsius por 15 minutos, protegidas da luz. Prepare misturas completas de mestre de manchas e FMOs no tampão de manchas para um volume final de 100 microliters por milhão de células usando as tabelas de anticorpos no manuscrito do texto.
Sem remover o bloco FC, adicione 100 microliters de misturas completas de manchas e FMOs aos poços selecionados. Prepare controles de compensação de cores únicas para cada anticorpo e um conjunto de manchas. Siga as instruções do fabricante se usar contas de compensação.
Incubar as células e as contas a quatro graus Celsius por 30 minutos, protegidas da luz. Em seguida, centrífugas e decantar o supernatante invertendo e sacudindo a placa. Lave as células e as contas em 200 microliters de tampão de manchas três vezes, centrifugando e decantando o supernatante todas as vezes.
Resuspende as células e contas em 200 microlitres de 2% paraformaldeído em DPBS para fixar as amostras para análise. Incubar a célula e as contas a quatro graus Celsius por 30 minutos, protegidos da luz, depois centrífugas e decantar o supernatante invertendo ou sacudindo a placa. Resuspenja as células e contas em 200 microliters de tampão de manchas.
Coloque uma placa de filtro sobre uma placa de fundo U limpa de 96 poços e transfira cada amostra para um poço da placa do filtro usando uma multi-pipeta. Centrifugar a placa do filtro e decantar o supernante. Para os painéis de maturação de medula óssea e baço, resuspenja as células totalmente manchadas em 100 microliters de tampão de manchas.
Combine os dois poços para cada animal em um poço. Resuspenque os painéis restantes, FMOs e controles em 200 microliters de tampão de manchas. Incubar células fixas e contas a quatro graus Celsius durante a noite, protegidas da luz.
Regiscões de compensação recorde para cada painel de manchas usando as compensações de manchas únicas preparadas e definir portões positivos e negativos para cada amostra. Calcule a matriz de compensação usando o software. Comece a adquirir a primeira amostra, certificando-se de que os portões estejam definidos adequadamente.
Defina a máquina para executar e registrar os vários eventos celulares para cada amostra, conforme mencionado no manuscrito do texto. Proceder com a análise de dados utilizando o software de análise de citometria de fluxo, seguindo as estratégias de gating no manuscrito do texto. A análise citométrica de fluxo para caracterização de células B peritônios no peritônio mostra as frequências de células peritoneais viáveis, células B totais, subconjuntos B-1 e B-2, bem como células B-1a e B-1b em camundongos.
Quando as células B da medula óssea foram analisadas, foram determinadas frequências de células viáveis, células B totais, fração A, células pré-pró-B, Fração B, Fração C, Fração C'Fração D, Fração Imatura E, Fração E transitória e fração F B em camundongos. A análise das células B esplênicas mostra as frequências de células de baço viáveis, células B totais, células B transitórias, células T1, T2, T3, células B maduras, células I foliculares, células foliculares II, células precursoras e maduras da zona marginal, e células B-1 em camundongos. As frequências de células kappa de imunoglobulina e imunoglobulina lambda B em camundongos foram determinadas com análise citométrica de fluxo do baço.
Ao executar este protocolo, você precisa resolver o sinal de um detector sangrando para o próximo usando controles de compensação. Esses controles podem ser manchados de células ou com contas de compensação disponíveis comercialmente. Ensaios adicionais podem ser usados em conjunto com a citometria de fluxo, como a imunohistoquímica para visualizar a localização celular dentro de órgãos linfoides, bem como duas microscopia de fótons para analisar as respostas das células B em espaço e tempo reais.
A análise da citometria de fluxo dos compartimentos celulares B permite a caracterização de fenótipos associados à RBC e deficiências relacionadas, perturbações de moléculas de sinalização BCR ou interrupção de citocinas que modulam a sobrevivência celular B.
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Visão Geral
Este artigo descreve uma análise de citometria de fluxo da heterogeneidade de linfócitos B imunes murinos em diversos tecidos, incluindo o peritônio, baço e medula óssea. O protocolo é adaptável para uso com outros tecidos de camundongo, aprimorando a compreensão do desenvolvimento dos linfócitos B.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Citometria de Fluxo
- Modelos de Camundongos
Antecedentes
- Compreender a heterogeneidade das células B é fundamental para a pesquisa em doenças autoimunes.
- Camundongos geneticamente modificados fornecem informações sobre o desenvolvimento das células B.
- O uso de múltiplos fluoróforos permite uma análise celular detalhada.
- Essa técnica pode ser aplicada a diversos tecidos de camundongo.
Objetivo do Estudo
- Analisar o compartimento de linfócitos B imunes em camundongos.
- Determinar os efeitos da manipulação genética no desenvolvimento de linfócitos B.
- Fornecer um protocolo para fenotipagem de camundongos geneticamente modificados.
Métodos Utilizados
- Citometria de fluxo para analisar populações de células B.
- Uso de fluoróforos para análise simultânea de múltiplos parâmetros.
- Adaptação de protocolos para diferentes tecidos de camundongo.
- Avaliação de modelos de camundongos predispostos a doenças autoimunes.
Resultados Principais
- Demonstrou heterogeneidade das células B em diferentes tecidos.
- Identificou o impacto de modificações genéticas no desenvolvimento das células B.
- Forneceu um protocolo versátil aplicável a diversos contextos de pesquisa.
- Aprimorou a compreensão sobre terapêuticas com anticorpos em modelos murinos.
Conclusões
- O estudo oferece informações sobre a compartimentalização de linfócitos B em camundongos.
- A citometria de fluxo é um método eficaz para analisar células imunes.
- Os achados podem orientar pesquisas futuras sobre doenças autoimunes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A caracterização por citometria de fluxo do desenvolvimento de linfócitos B murinos permite a validação de alvos em pesquisas pré-clínicas de imunologia, fornecendo dados fenotípicos quantitativos provenientes dos compartimentos da medula óssea, baço e peritônio. Essa abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas de candidatos terapêuticos ao associar modificações genéticas a alterações nos subconjuntos de linfócitos B, orientando decisões de avanço ou interrupção em pipelines de descoberta de anticorpos. O método aumenta a confiança preditiva em modelos murinos utilizados para avaliar terapêuticas biológicas direcionadas a vias dos linfócitos B.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação das frequências de subconjuntos de linfócitos B em camundongos geneticamente modificados.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio da triagem fenotípica padronizada do desenvolvimento de células imunes.
- Valor Estratégico: Facilita a triagem de portfólios ao associar a modulação do alvo a alterações mensuráveis nas etapas de maturação de linfócitos B.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece leituras quantitativas de alta dimensão da heterogeneidade de células B utilizando painéis multiparamétricos de fluoróforos.
- Valor Operacional: Permite a padronização de ensaios por meio de controles de compensação e controles de fluorescência-menos-um (FMO) para um gateamento reprodutível.
- Valor Estratégico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em etapas subsequentes e estudos de engajamento de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece caracterização do sistema relevante para doenças em modelos de camundongos predispostos a autoimunidade e humanizados.
- Valor Operacional: Garante continuidade translacional ao alinhar os estágios de desenvolvimento de linfócitos B murinos com a imunologia humana.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco por meio do monitoramento longitudinal da compartimentalização dos linfócitos B.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica, fornecendo dados padronizados de imunofenotipagem que orientam a seleção do alvo e o mecanismo de ação.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao identificar alterações nos subconjuntos de linfócitos B em resposta a perturbações genéticas ou farmacológicas.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios e resultados quantitativos essenciais para avaliar os efeitos de moduladores no desenvolvimento dos linfócitos B.
- Análise: Permite a comparação entre condições por meio de medições padronizadas das frequências dos subconjuntos de linfócitos B em diferentes tecidos.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à validação pré-clínica mediante a caracterização de fenótipos de linfócitos B em modelos relevantes para doenças.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma de imunofenotipagem reutilizável em múltiplos projetos direcionados a vias mediadas por linfócitos B.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de desenvolvimento de linfócitos B.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade por meio de protocolos padronizados de marcação, compensação e aquisição.
- Valor Estratégico: Aprimora a eficiência do capital ao permitir a detecção precoce de efeitos imunológicos fora do alvo em candidatos principais.
- Impacto sobre a Carteira: Orienta a priorização ajustada ao risco ao vincular o engajamento do alvo a desfechos imunológicos funcionais.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em design de painéis de citometria de fluxo, compensação e estratégias de gateamento para imunofenotipagem.
- Depende do acesso a citômetros de fluxo com capacidade suficiente de laser e detectores para análise multiparamétrica.
- Necessita padronização entre equipes dos painéis de anticorpos, protocolos de marcação e configurações de software de análise.
- Envolve considerações de adaptação ao estender os painéis para modelos de camundongos humanizados ou específicos para doenças.
- Inclui limitações práticas, como sobreposição espectral que exige seleção cuidadosa de fluoróforos e controles de compensação.
