Name: Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprenda a medir a microcirculação coronária em coração de rato ex vivo, monitorando pressão e fluxo arteriais. Este método permite analisar pericitos e componentes vasculares em tempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado em parte pelo Núcleo de Engenharia e Tecnologia Biomédica (BioMET); NIH (1U01HL116321) e (1R01HL142290) e a American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).

Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes da Universidade de Maryland Baltimore e o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou protocolos.
1. Preparação das soluções
NOTA: Prepare as soluções com antecedência. Dois tipos de soluções básicas são utilizadas nos experimentos: (1) soluções fisiológicas de soro fisiológico (PSS) para superfusato de banho e (2) soluções de Tyrode para o perfusato de lúmen. O borbulhamento contínuo com CO2 é necessário para manter o pH do PSS. A solução de Tyrode tamponada pelo HEPES é usada no lúmen em vez de PSS para evitar que bolhas entrem nos vasos, uma vez que as bolhas danificariam as células endoteliais7 e ocluiriam o fluxo.
<ol><li>Solução PSS: Veja a fórmula e a composição da solução PSS na Tabela 1. Faça 10 L de Ca2+-free e sem glicose solução de estoque PSS e armazene a temperatura ambiente. 1 h antes de qualquer procedimento, tire 1 L da solução de estoque e bolha com 5% de CO2 (74% N2 e 21% O2) para manter o pH da solução em ~7,4. Adicione 1,8 g de glicose e 1,8 mL CaCl2 (1 M de estoque)8. NOTA: Adicione Ca2+ somente depois de borbulhar quando o pH estiver ~7.4, caso contrário, Ca2+ será precipitado.</li>
	<li>Solução de Tyrode: Veja a fórmula e a composição da solução do Tyrode na Tabela 1. Filtre a solução (0,22 μm) e armazenada a 4 °C para uso futuro9.</li>
	<li>Solução de Tyrode com BDM (monoxime 2,3-Butanedione): Adicionar BDM como um inibidor reversível de miofilação para evitar a contração dos miócitos10. Pese 600 mg BDM e adicione a 200 mL da solução de Tyrode. Mexa a solução com BDM até que esteja completamente dissolvida. Não é necessária mais filtragem.</li>
	<li>Armazene a solução do Tyrode contendo BDM a 4 °C para uso futuro.</li>
</ol>2. Preparação da câmara
<ol><li>Cubra a câmara de dissecação e a câmara experimental com antecedência com polidimetilasiloxano (PDMS) seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante.</li>
	<li>Encha a câmara de dissecação com a solução do Tyrode contendo BDM.</li>
	<li>Ligue o refrigerador 1h antes do procedimento. Coloque a temperatura em 4 °C.</li>
</ol>3. Preparação da cânula
<ol><li>Ligue o puxador de micropipette. Selecione as configurações de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Tome um tubo de vidro borossilicato limpo (o diâmetro externo e interno dos tubos de vidro utilizados foi de 1,2 mm e 0,69 mm, respectivamente).</li>
	<li>Insira um tubo de vidro nos grampos ranhurados de um puxador de pipeta Sutter com um filamento de aquecimento de platina em forma de U.</li>
	<li>Ative o puxador para produzir duas cânulas, cada uma com uma ponta fina longa.</li>
	<li>Corte a ponta de cada cânula usando um belo par de tesouras sob um microscópio dissecando para fazer o diâmetro final da ponta em torno de 100 a 150 μm.</li>
	<li>Coloque o polimento da ponta da cânula cortada para contornar ligeiramente as bordas afiadas.</li>
	<li>Dobre a cânula ao longo do eixo usando um fio de platina (aquecido com controle fino) posicionado na lateral do eixo aproximadamente 2 mm da ponta. O ângulo da curva na cânula deve ser de cerca de 45°.</li>
	<li>Insira a extremidade aberta da cânula no suporte da câmara de miógrafo de pressão e aperte a montagem. Conecte uma seringa de 5 mL preenchida com a solução de Tyrode para o outro lado do encaixe. Conecte a cânula a um micromanipulador montado na câmara (ver Figura 1 e Figura 2).</li>
	<li>Encha a cânula com a solução de Tyrode usando a seringa (5 mL), lavando-a, o tubo e o conector das bolhas de ar.</li>
	<li>Antes do procedimento de canulação, meça a pressão de perfusão dentro da cânula sobre uma determinada faixa de fluxo (50 a 300 μL/min, Figura 3). Faça isso somente quando uma nova cânula é usada. NOTA: A pressão de perfusão dentro da cânula é proporcional ao fluxo e é linear(Figura 3).</li>
</ol>4. Extração do coração do rato
<ol><li>Coloque um rato C57BL/6 (sexo, 8-16 semanas de idade) na caixa de anestesia que está conectada aos tanques de isoflurane e oxigênio.</li>
	<li>Ligue o tanque de oxigênio e inicie o fluxo de isoflurane. Espere ~5 min até que o mouse esteja totalmente anestesiado.</li>
	<li>Após a anestesia ser estabelecida, tire o rato da caixa de anestesia e injete heparina IP (na cavidade peritoneal, 360 unidades, 0,5 mL/rato) para evitar a formação de coágulos sanguíneos na vasculatura. Em seguida, coloque o rato de volta na caixa de anestesia.</li>
	<li>10 minutos após a injeção da heparina, mova o mouse para a cama aquecida em uma posição supina e estabilize suas patas usando fita de rotulagem. Mantenha o rato sob anestesia completa com isoflurano usando um cone de nariz.</li>
	<li>Levante a pele abdominal do camundongo acima do diafragma com fórceps e use uma tesoura cirúrgica para cortar e expor o diafragma.</li>
	<li>Corte o diafragma e o esterno. Abra o peito.</li>
	<li>Dissecar o coração para fora da cavidade torácica, cortando o mais próximo possível da parede torácica dorsal.</li>
	<li>Coloque o coração na solução de Tyrode gelada contendo 30 mM BDM.</li>
	<li>Limpe o coração para remover os tecidos conjuntivos, como o pulmão.</li>
	<li>Transfira o coração para a câmara de dissecação pré-refrigerada cheia de solução de Tyrode contendo BDM de 30 mM.</li>
</ol>5. Preparação e cannulação da artéria septal
<ol><li>Ligue a bomba de servo. Ajuste a bomba de servo para o modo "fluxo". Deixe-o funcionar em alta velocidade até que a tubulação esteja cheia com a solução do Tyrode que será usada para perfundir o lúmen vascular. Certifique-se de que não há bolhas na tubulação. Em seguida, abaixe a velocidade.</li>
	<li>Coloque o coração no PDMS, evitando qualquer dano na área do meio do coração.</li>
	<li>Remova a ária direita e esquerda. Abra o ventrículo direito e remova a parede livre ventricular direita usando um microscópio dissecando.</li>
	<li>Exponha e identifique a artéria septal. Coloque uma linha de nylon (30 μm de diâmetro) sob a artéria septal e amarre um nó solto para uso futuro. NOTA: A artéria septal pode ser facilmente identificada usando um microscópio dissecando. A artéria septal é uma artéria importante no septo originário da artéria coronária direita na maioria dos casos.</li>
	<li>Remova a parede livre ventricular esquerda usando uma tesoura fina.</li>
	<li>Transfira a preparação do músculo papilar para a câmara experimental na qual a cânula foi posicionada. A câmara está cheia com a solução de Tyrode contendo BDM. A parte inferior desta câmara é revestida com uma fina (~2 mm) camada de PDMS.</li>
	<li>Ajuste a posição da cânula (usando o micromanipulador) para permitir a cannulação da artéria septal. Aperte o nó.</li>
	<li>Fixar o músculo papilar usando pequenos pinos no chão da câmara para que o objetivo do microscópio tenha uma visão clara da vasculatura. Preste atenção ao ângulo e à posição da cânula e certifique-se de que a ponta da cânula esteja paralela à parede arterial.</li>
	<li>Teste aculação expulsando gradualmente a solução da seringa através da cânula. Se todos os elementos funcionarem corretamente, o sangue residual no músculo papilar sairá do tecido no início deste processo e apenas a solução de Tyrode será vista mais tarde.</li>
</ol>6. Estabilização da preparação
<ol><li>Ligue a bomba peristáltica que fornecerá a solução de superfusão. Em seguida, sobrefundir constantemente a preparação no banho com PSS pré-gaseado à taxa de 3-4 mL/min.</li>
	<li>Ligue o controlador de temperatura para a solução de superfusão. Ajuste a temperatura do superfusado do banho para ~35-37 °C.</li>
	<li>Conecte a cânula à bomba de servo. Leia a pressão exibida no controlador de servo de pressão.</li>
	<li>Monitore o fluxo e a pressão. A pressão de fluxo (μL/min) e a perfusão arterial (mm Hg) é digitalizada por digitalização por digitalização e registrada por meio de um software associado(Figura 2).</li>
	<li>Ajuste o fluxo para definir a pressão ~10 mmHg e deixe-a funcionar por ~10 min.</li>
	<li>Aumente o fluxo da solução luminal para fazer a pressão da artéria ~60 mmHg. Obtenha a pressão final de perfusão da própria arteriola subtraindo a queda de pressão da cânula(Figura 3). NOTA: Se o modo "pressão" no controlador de servo de pressão for selecionado, a pressão luminal será definida ~60 mmHg para esses experimentos. Em seguida, monitore a mudança do fluxo.</li>
	<li>Deixe a amostra estabilizar por ~30-60 min monitorando os níveis de fluxo e/ou pressão. Um aumento gradual da pressão arterial é normalmente observado no início da perfusão após a canulação. Um novo estado estável será estabelecido por si só em cerca de 30 min(Figura 4).</li>
	<li>Inicie um experimento depois que a pressão de perfusão for estabilizada (em fluxo constante).</li>
</ol>7. Carregando a preparação com aglutina de germe de trigo fluorescente (WGA)
<ol><li>Prepare a solução da Tyrode contendo WGA conjugada Alexa-Fluor-488 adicionando 100 μg de WGA conjugada em 5 mL da solução de Tyrode.</li>
	<li>Alterne cuidadosamente o perfusato da solução normal de Tyrode para uma contendo WGA marcada fluorescentemente. É importante alternar cuidadosamente o perfusato para que não sejam introduzidas bolhas.</li>
	<li>Depois de ~30 minutos de perfusão WGA ou quando a solução WGA está prestes a acabar, mude o perfusado de volta para a solução normal de Tyrode.</li>
</ol>8. Imagem confocal de arterioles e capilares
<ol><li>Ligue o sistema de microscópio confocal do disco Nipkow.</li>
	<li>Use o microscópio para localizar a artéria septal usando um objetivo de baixa potência (4x) no modo de luz transmitido. NOTA: A artéria septal pode ser localizada seguindo a posição da cânula.</li>
	<li>Inicie a imagem confocal com o disco giratório confocal e escolha 488 nm laser de excitação, ampliação objetiva de 40x e ajuste a intensidade do laser e a taxa de amostragem (10 - 500 ms por imagem).</li>
	<li>Configure posições de imagem superior e inferior para o microscópio confocal para definir a faixa de imagem e digite os parâmetros para a imagem de pilha z.</li>
	<li>Defina o tamanho da etapa conforme recomendado para o sistema que está sendo usado ou defina o tamanho da etapa conforme desejado.</li>
	<li>Escolha as configurações de pilha z e/ou as configurações da série de tempo.</li>
	<li>Selecione ou defina uma nova pasta para armazenar a nova imagem.</li>
	<li>Clique em "Executar" para começar a gravar imagens para análise futura(Figura 5).</li>
</ol>9. Exemplo de experimento vasodilatador: vasodilatação induzida por pinácido (Vídeo 1).
<ol><li>Prepare a solução de estoque de pinácido (100 mM em DMSO) e armazenada a 4 °C.</li>
	<li>Prepare 10 mL da solução de Tyrode. Adicione 10 μL de solução de estoque de pinácido para fazer a concentração final de pinácido 100 μM.</li>
	<li>Imagem do músculo papilar em baixa ampliação (objetivo 4x) para incluir a artéria septal e as artérias do ramo.</li>
	<li>Alterne a solução luminal para a solução contendo pinácido.</li>
</ol>10. Exemplo de experimentos de controle de fluxo sanguíneo: aumento da pressão arterial induzida por vasoconstritor ao fluxo constante(Figura 6)
<ol><li>Prepare a solução de estoque endotelina-1 (ET-1) e armazenada a -20 °C.</li>
	<li>Prepare 10 mL da solução de Tyrode. Adicione 10 μL de solução de estoque ET-1 (10 μM) para fazer a concentração final de ET-1 10 nM.</li>
	<li>Regissão a pressão luminal com fluxo constante e imagem do músculo papilar.</li>
	<li>Alterne a solução luminal para a solução contendo ET-1.</li>
</ol>11. Exemplo de imagens capilares com pericílitos (Figura 7)
<ol><li>Sacrifique um rato transgênico NG2DsRedBAC, conforme descrito na seção 4 deste protocolo.</li>
	<li>Extrair o coração, cannular a artéria septal e carregar a amostra com Alexa-Fluor-488 conjugada WGA seguindo os protocolos 5-7.</li>
	<li>Imagem do músculo papilar a 488 nm e excitação de 560 nm, e 510-525 nm, 575-625 nm de emissão usando confocal. A pressão da arteriola será em torno de 40 mmHg.</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li>
<li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li>
<li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li>
<li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li>
<li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li>
<li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li>
<li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li>
<li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents%2C+Ca2%2B+signals%2C+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Amercian+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li>
<li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1+enhances+SR+Ca2%2B+content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li>
<li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li>
<li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99(2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

No presente trabalho, introduzimos um método ex vivo notavelmente simples, mas altamente prático, para estudar a microcirculação coronariana no coração em condições fisiológicas. Este método foi modificado a partir de investigações mecânicas utilizando ratos2. A adição desafiadora foi a tecnologia de imagem com alta velocidade e alta resolução óptica. Nós, portanto, fomos capazes de aproveitar os sistemas avançados de imagem óptica que agora estão disponíveis comercialmente. Através da dissecção c...

A regulação adequada do fluxo de pressão coronariana garante o suprimento sanguíneo suficiente ao coração para atender às suas demandas metabólicas1. No entanto, só recentemente ficou claro como o fluxo de pressão coronária é dinamicamente regulado no coração, apesar de extensos estudos que têm sido realizados in vivo e in vitro nas últimas décadas. Uma das razões é a dificuldade em estabelecer um modelo de trabalho fisiológico para tais estudos devido à constante batida do coração. Independentemente disso, uma variedade de métodos foram estabelecidos para a observação dos micro-vasos coronários em tecidos ou animais vivos, mas nenhum desses métodos foi capaz de alcançar foco constante/estável e as medidas da pressão, fluxo e diâmetro microvascular ao mesmo tempo2,3. A visualização direta de micropescos arteriais coronárias no coração pulsante foi introduzida décadas atrás4,3, mas as medidas de diâmetro em pequenos vasos foram desafiadoras e as funções específicas dos muitos tipos de células especializadas associadas à microcirculação foram igualmente vexato. Mesmo o método estromacópico e o sistema objetivo flutuante não puderam fornecer as informações acima simultaneamente5. No entanto, uma quantidade significativa de informações valiosas foi obtida utilizando-se as tecnologias acima mencionadas, que nos ajudaram a entender mais sobre a regulação do fluxo sanguíneo coronário6. O método que estamos descrevendo neste artigo ajudará a investigar e entender detalhadamente como os componentes das artérias coronárias, das artérias e da microvasculatura respondem de forma diferente às estimulações e demandas metabólicas.
O modelo de trabalho que estabelecemos para prosseguir esses estudos foi construído sobre o trabalho anterior de Westerhof et al.2. Após a cannulação da artéria septal do coração do camundongo, a solução fisiológica salina foi usada para perfundir essa artéria para manter os miócitos e outros componentes do tecido cardíaco nutridos. A pressão arterial de perfusão, o fluxo e o diâmetro vascular foram monitorados entre outras funções fisiológicas utilizando indicadores fluorescentes adequados. Este método nos permite visualizar o leito microvascular coronariano sob pressão fisiológica no tecido vivo e estudar os mecanismos celulares subjacentes à regulação da microcirculação pela primeira vez.

<table><tbody><tr><td>1 M CaCl2 solução</td><td>MilliporeSigma, EUA</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2 solução</td><td>MilliporeSigma, EUA</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>AxoScope software</td><td>Molecular Devices, San Jose, CA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chiller/incubadora de água</td><td>FisherScientific, EUA</td><td>Isotemp 3016S</td><td></td></tr><tr><td>Confocal</td><td>Nikon Instruments, EUA</td><td>A1R</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de vidro personalizada</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-3301</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Molecular Devices, San Jose, CA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Olympus, Japão</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>MilliporeSigma, EUA</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sódica Sal</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de solução em linha</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, EUA</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>VETone, Idaho, EUA</td><td>Extrator de</td> micropipeta 502017 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments, Novato, CA, EUA</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de micropipeta/cânula</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, EUA</td><td>64-0981</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo transgênico NG2DsRedBAC</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#008241</td><td></td></tr><tr><td>Fio de nylon para amarrar vasos sanguíneos</td><td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>PDMS (polidimetilsiloxano)</td><td>SYLGARD, Germantown, WI, USA</td><td>184 SIL ELAST KIT</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Servo Controlador</td><td>de Instrumentação de Sistemas Vivos, Burlington, Vt, EUA</td><td>PS-200-S</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA, EUA</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentação de Sistemas Vivos de Bomba Servo</td><td>, Burlington, Vt, EUA</td><td>PS-200-P</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, EUA</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Aglutinina de Gérmen de Trigo, Alexa Fluor 488 Conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA EUA</td><td>W11261</td><td></td></tr></tbody></table>

medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

O tom arterial coronário, juntamente com a abertura ou fechamento dos capilares, determinam em grande parte o fluxo sanguíneo para cardiomiócitos com pressão constante de perfusão. No entanto, é difícil monitorar as mudanças dinâmicas das artérias coronárias e dos capilares em todo o coração, principalmente devido ao seu movimento e espancamento sem parar. Aqui descrevemos um método que permite o monitoramento da taxa de perfusão arterial, pressão e as alterações de diâmetro das artérias e capilares nos músculos papilares ventriculares do mouse direito. A artéria septal do rato é cânulada e perfundida em um fluxo ou pressão constante com a outra medida dinamicamente. Após a perfusão com uma lectina fluorescente (por exemplo, Alexa Fluor-488 ou -633 rotulada de Agglutinina-Germe de trigo, WGA), as arterioles e capilares (e outros vasos) no músculo papilar e septo papirlículo do ventrículo direito podem ser prontamente imagens. As alterações do diâmetro do vaso poderiam então ser medidas na presença ou ausência de contrações cardíacas. Quando proteínas fluorescentes geneticamente codificadas foram expressas, características específicas poderiam ser monitoradas. Por exemplo, pericítos foram visualizados em corações de camundongos que expressavam NG2-DsRed. Este método forneceu uma plataforma útil para estudar as funções fisiológicas dos pericítos capilares no coração. Também é adequado para estudar o efeito dos reagentes no fluxo sanguíneo no coração, medindo o diâmetro vascular/capilar e a pressão luminal arterial simultaneamente. Esta preparação, combinada com um sistema de imagem óptica de última geração, permite estudar o fluxo sanguíneo e seu controle a nível celular e molecular no coração em condições quase fisiológicas.

Quando um marcador vascular de fluorescência é perfumado em lúmen vascular (aqui WGA conjugado com Alexa Fluor-488), é possível visualizar árvores vasculares inteiras como mostrado na Figura 5 (painel esquerdo) usando microscópio confocal de alta velocidade. A ampliação adicional permite a imagem capilar em detalhes(Figura 5, Painel Direito). Uma vez que o sistema pressurizado suporta um monitoramento constante da pressão luminal, esta preparação pode ser usada ...

Apresentado aqui é um protocolo para estudar a microcirculação coronária no tecido cardíaco murino vivo por ex vivo monitoramento da pressão e fluxo de perfusão arterial que mantém a pressão, bem como componentes de árvores vasculares, incluindo os leitos capilares e pericitos, já que a artéria septal é canulada e pressurizada.

Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Este método pode ser usado para estudar a microcirculação coronariana no tecido cardíaco murino vivo e componentes da árvore vascular por meio do monitoramento ex vivo da pressão e fluxo de perfusão arterial. Este método fornece uma plataforma útil para estudar a função da microcirculação de pericitos e reagentes dentro do coração, por isso tendemos a medir o diâmetro vascular e a pressão luminal da arteríola. Para preparar uma cânula para o experimento, use um extrator de micropipeta para produzir duas cânulas com pontas longas e finas, a partir de um único tubo de vidro borossilicato limpo.Use uma tesoura fina e um microscópio de dissecação para cortar a ponta de cada cânula em um diâmetro final de ponta de 100 a 150 micrômetros e polir as pontas para arredondar levemente as bordas afiadas. Use um fio de platina posicionado na lateral do eixo, a aproximadamente dois milímetros da ponta para dobrar a cânula ao longo do eixo em um ângulo de cerca de 45 graus e insira a extremidade aberta da cânula no suporte da cânula. Em seguida, aperte a conexão e use uma seringa de cinco mililitros para lavar a cânula e o tubo com a solução de Tyrode.Monte o suporte da cânula na micromanipulação de uma câmara de miógrafo de pressão. Para coletar um coração de camundongo para o experimento, primeiro insira um par nele e injete 500 microlitros de heparina em um camundongo C 57 preto de seis anos anestesiado de oito a 16 semanas de idade. Após 10 minutos, coloque o mouse em uma cama aquecida em decúbito dorsal e estabilize as patas com fita adesiva.Use fórceps e tesouras cirúrgicas para fazer uma incisão na pele abdominal, acima do diafragma e corte o diafragma e o esterno para permitir a dissecção do coração da cavidade torácica. Coloque o coração em uma solução gelada de Tyrode contendo 30 BDM milimolar e remova todos os tecidos conjuntivos do coração conforme necessário. Em seguida, coloque o coração em uma câmara de dissecação pré-resfriada, preenchida com solução fresca de Tyrode suplementada com 30 milimolares BDM.Para preparar a artéria septal para a canulação, ligue a pompa do servo e ajuste a pressão do servo controlador para o modo de fluxo. No coração para o PDMS, tomando cuidado para evitar danos à área média do tecido e coloque o tecido sob um microscópio de dissecação. Remova um ou ambos os átrios e abra o ventrículo direito.Remova a parede livre do ventrículo direito e exponha a artéria septal. Use um fio de náilon de 30 micrômetros de diâmetro para dar um nó solto ao redor da artéria septal. Use uma tesoura fina para remover a parede livre do ventrículo esquerdo e transfira a preparação do músculo papilar para a câmara experimental.Use um micromanipulador para inserir uma cânula na artéria septal e prenda a cânula com a sutura. Em seguida, use pinos para prender o músculo papilar ao assoalho da câmara com a ponta da cânula paralela à parede arterial, de modo que uma visão clara da vasculatura possa ser obtida e use a seringa para lavar gradualmente a solução através da cânula. Para estabilizar a preparação do tecido, ligue uma bomba peristáltica e continuamente superfunda a preparação com solução salina fisiológica pré-gaseificada a uma taxa de fluxo de três a quatro mililitros por minuto, ligue o controlador de temperatura para a solução de superfusão e ajuste a temperatura do superfusato do banho para 35 a 37 graus Celsius.Conecte a cânula à servobomba e ajuste o fluxo para ajustar a pressão para aproximadamente 10 milímetros de mercúrio. Deixe a superfusão funcionar por cerca de 10 minutos, depois aumente o fluxo da solução luminal para ajustar a pressão arterial para aproximadamente 60 milímetros de mercúrio e permitir que a amostra se estabilize por 30 a 60 minutos com monitoramento. Para carregar a amostra com aglutinina de gérmen de trigo, perfunda a preparação com cinco mililitros de solução de Tyrode, suplementada com 100 microgramas de aglutinina conjugada de gérmen de trigo Alexa Fluor-488.Após 30 minutos, troque o auxiliar de perfusão de volta à solução normal de Tyrode e ligue o sistema de microscópio confocal. Use o microscópio em uma potência de ampliação mais baixa para localizar a artéria septal no modo de luz transmitida e comece a imagem com este disco giratório confocal. Selecione uma ampliação objetiva de 40X e o laser de excitação de 488 nanômetros e ajuste a intensidade do laser e a taxa de amostragem.Para definir a faixa de imagem, defina as posições de imagem superior e inferior para o microscópio e defina o tamanho do passo e os parâmetros de imagem da pilha Z. Em seguida, selecione uma pasta para armazenar a imagem e clique em executar para começar a gravar as imagens. Quando um marcador vascular de fluorescência é perfundido no lúmen vascular, é possível visualizar árvores vasculares inteiras, usando microscopia confocal de alta velocidade.Uma ampliação adicional permite a aquisição de imagens do capilar em detalhes. Quando o agonista do canal de potássio sensível ao pinacidil e ao ATP é servido a partir do lúmen, o diâmetro das artérias aumenta. Quando a endotelina vasoconstritora é aplicada a partir do lúmen.O diâmetro da artéria diminui. Quando o conjunto de fluxo é constante, a pressão luminal aumenta. Nessas imagens de tecido papilar de um camundongo transgênico que expressa NG dois DS vermelho, tanto o capilar quanto os pericitos podem ser visualizados dentro do tecido muscular papilar, sob condições que imitam melhor a fisiologia de animais vivos.É importante que não haja bolhas presentes dentro da tubulação em nenhum momento durante o procedimento. Combinando este método com técnicas de imagem óptica, a preparação pode ser usada para estudar a microcirculação no coração e as comunicações intercelulares entre diferentes tipos de células, usando camundongos transgênicos com tecnologia de fluorescência.

dynamic-measurement-imaging-capillaries-arterioles-pericytes-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

Este artigo detalha o procedimento de dissecação, a configuração instrumental, e as condições experimentais durante o mapeamento óptico de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio intracelular (CAT) em Langendorff isolados intactos corações perfundidos mouse.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

A camada de superfície endotelial glicocálice / endotelial está idealmente estudada por microscopia intravital. Microscopia intravital é tecnicamente desafiante em um órgão em movimento, tais como o pulmão. Demonstramos como brightfield simultânea e microscopia de fluorescência pode ser utilizado para estimar a espessura da camada endotelial da superfície em um movimento...

Na medição in vivo da camada superficial do rato pulmonar endotelial

Microscopia intravital do cremaster microcirculação rato M. oferece um único e bem padronizados modelo in vivo para a análise de medula óssea a migração de células estaminais periféricas.

Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular

Exame ecocardiográfico é frequentemente usada em ratos. Aparelhos de ultra-som de alta resolução caro foram desenvolvidos para esta finalidade. Este protocolo descreve um procedimento ecocardiográfico acessível, combinado com análises morfométricas histológica para determinar a morfologia cardíaca.

Exame ecocardiográfico e histológico da morfologia cardíaca no Mouse

Este estudo utiliza uma técnica de microscopia (LSFM) de fluorescência de luz-folha de iluminação dupla face combinada com compensação óptica para estudar o coração murino.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

Este estudo descreve um protocolo abrangente de ressonância magnética cardiovascular (RMC) para quantificar os parâmetros funcionais ventriculares esquerdos do coração do camundongo. O protocolo descreve a aquisição, pós-processamento e análise das imagens da RMC, bem como a avaliação de diferentes parâmetros funcionais cardíacos.

Quantificação da função ventricular esquerda do coração do rato, tensão do miocárdio e forças hemodinâmicas por ressonância magnética cardiovascular

Este protocolo apresenta etapas para adquirir e analisar imagens fluorescentes de cálcio de pericytes e dados de fluxo sanguíneo de vasos sanguíneos próximos em camundongos anestesiados. Essas técnicas são úteis para estudos de fisiologia celular mural e podem ser adaptadas para investigar transitórios de cálcio em qualquer tipo de célula.

Imagem pericínica cerebral de cálcio e hemodinâmica em camundongos transgênicos em Vivo

Relatamos um método para reconstrução mesoscópica de todo o coração do rato, combinando novos avanços na transformação e coloração de tecidos com o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz digitalizado axialmente.

Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

A preparação intensiva de "tubos" endoteliais cerebrais intactos de arteriolas parenchímicas cerebrais é ilustrada para o estudo da regulação do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, demonstramos os pontos fortes experimentais deste modelo de estudo endotelial para a medição de imagens de fluorescência e eletrofisiologia das principais vias de sinalização celular, incluindo alterações no potencial intracelular [Ca2+] e membrana.

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

Este protocolo apresenta um método rápido para imagens vasculares tridimensionais quantitativas de montagem total usando microscopia de fluorescência de folha de luz. A eficácia do método é demonstrada usando o sistema de artérias do arco faríngeo do modelo de embrião de galinha, com forças hemodinâmicas quantificadas via fluidodinâmica computacional.

Imagens rápidas de alta resolução de montagem total de vasculatura de pequenos animais para estudos quantitativos

Aprenda a medir a microcirculação coronária em coração de rato ex vivo, monitorando pressão e fluxo arteriais. Este método permite analisar pericitos e componentes vasculares em tempo real.

Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato

Explorar mais vídeos