Uma abordagem para estudar transcriômica dependente de forma em um único nível celular

Propomos uma nova plataforma para investigar os efeitos da forma celular na expressão genética, usando métodos para crescer e classificar adesões com diferentes morfologias no nível de célula única. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita o estudo de alto rendimento da forma celular in vitro, pois comparar células com diferentes formas in vivo é tecnicamente exigente. Para configurar uma cultura de cardiomiócito padronizada, transfira uma suspensão cardiomiócito na proporção de interesse para um tubo de 15 mililitros para contagem e diluir as células para uma única vezes 10 para as cinco células por mililitro de concentração média de revestimento apropriada.

Adicione dois mililitros de células em um chip micropatterado revestido de fibronectina submerso em dois mililitros de meio de revestimento quente dentro de uma placa Grenier Petri de 35 mililitros e coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 18 horas. No dia seguinte, verifique o chip por microscopia leve para confirmar que a maioria das células se anexaram. Remova o meio do prato para remover quaisquer detritos e ou células mortas, e começando do centro e movendo-se em direção aos lados de forma suave, adicione suavemente PBS às células.

Após a terceira lavagem, substitua o PBS por quatro mililitros de manutenção e devolva as células à incubadora de cultura celular. Após 72 horas, lave suavemente a superfície do chip duas vezes com dois mililitros de PBS quente de Dulbecco por lavagem como demonstrado e use fórceps para transferir imediatamente o chip lavado para uma nova placa estéril grenier petri de 35 mililitros. Adicione rapidamente 1,5 microliters de dicycle verde vibrante diluído 1000 vezes em DPBS ao chip.

Fixar uma câmara sobre o chip e colocar o prato sobre o suporte do prato do estágio de catador de células. Insira a tampa magnética e localize a mira na janela de visualização ao vivo. Concentre-se na mira e, na janela de digitalização e classificação, selecione a calibração para injeção automatizada e calibrar.

Substitua o supernascedor de prato por 1,5 mililitros de uma solução tripla E de um para um na solução DPBS para soltar as células da fibronectina e abrir a guia de digitalização. Para digitalizar todo o chip, concentre-se no canto superior esquerdo do chip no campo de visão e clique em obter a posição atual do microscópio. Em seguida, concentre-se no canto inferior direito do chip e clique em obter a posição atual do microscópio.

Na janela pop-up, clique no plano mais nítido e clique em ir para o canto superior direito e ir para os botões inferiores do canto esquerdo. Em seguida, clique em terminar para iniciar a varredura. Quando a varredura estiver concluída, abra a guia de análise e clique em mostrar mapa para selecionar as células únicas que passam pelos critérios de estudo.

Centralize o microcapilário de vidro no meio da visão ao vivo do microscópio e abra a aba da bomba. Para criar um vácuo, retraia o êmbolo de uma seringa número um de 50 mililitros e abra a guia de classificação. Para permitir que uma única célula seja colhida, ajuste a válvula dois para ser aberta por 120 milissegundos e a válvula uma a ser aberta por 20 milissegundos após um lapso de tempo de 200 milissegundos.

Para permitir que a célula escolhida seja entregue com sucesso em seu tubo PCR contendo tampão de lise, ajuste a válvula para ser aberta por 20 milissegundos e a válvula dois seja aberta por 10 milissegundos após um lapso de tempo de 10 milissegundos. Quando as configurações da válvula tiverem sido ajustadas, clique em calcular o caminho. O software calculará o caminho mais rápido de célula em célula para pegar e injetar as células selecionadas ao longo do chip.

Em seguida, concentre o microscópio em um padrão na superfície do chip. Use o joystick para mover o microcapilar para baixo cuidadosamente para que a imagem mais nítida da ponta da microcapilar possa ser obtida sem tocar na superfície do chip e clicar no conjunto. Uma nova janela será aberta, mostrando a seção transversal microcapilária.

Para que o software registe a ponta offset do capilar nas coordenadas X, Y e Z, clique no centro exato do capilar. Em seguida, clique em começar a classificar para iniciar a classificação. Nesta análise representativa do CDNA pré-amplificado de uma célula única escolhida, uma banda clara no gráfico de densitometria em gel foi observada correspondente ao pico de 1.852 pares de base no eletroferóograma.

O tamanho médio dos fragmentos foi de 1.588 pares de base com um pequeno número de fragmentos que eram mais curtos que 300 pares de base, indicando a geração de uma boa biblioteca cDNA. A coloração e análise imunofluorescente também podem ser realizadas para avaliar a estrutura de sarcomere dentro dos cardiomiócitos padronizados. Esta plataforma abre caminho para estudos de alto rendimento e triagem de medicamentos de diferentes tipos de insuficiência cardíaca.