Quantificação do DNA específico do porco circulante no sangue de um modelo de xenotransplante
22 de setembro de 2020
Neste protocolo foram projetados primers específicos porcina, fragmentos de DNA específicos contendo plasmídeos contendo suínos foram construídos, e curvas padrão para a quantitação foram estabelecidas. Utilizando primers específicos de espécies, o CPSDNA foi quantificado por qPCR em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de remendo de artéria de porco para macaco.
Xenotransplante é um método viável para tratar No entanto, o monitoramento efetivo da rejeição imune do xenotransplante é um problema para médicos e pesquisadores. Este protocolo é um método simples, conveniente, de baixo custo e menos invasivo para monitorar a rejeição imune da xenotransmutação. Essa técnica pode ser usada no campo do xenotransplante, incluindo transplante de ilhotas de porco para humano, transplante de rim, transplante de fígado e transplante de coração.
Comece transferindo 500 microliters de amostras de sangue para diferentes tubos de microcrífugas. Adicione 20 microliters de protease K e 500 microliters de tampão de lise nos tubos. Em seguida, agite-os completamente para misturar.
Coloque os tubos em um banho de água a 56 graus Celsius por 10 minutos, sacudindo-os duas a três vezes durante a incubação até que a solução fique clara centrífuga-los brevemente para remover as contas líquidas da parede interna das tampas do tubo. Em seguida, adicione 500 microliters de Anidro, Álcool Etílico e agite bem. Transfira a mistura para a coluna de adsorção.
Em seguida, centrifufique a coluna por dois minutos e descarte o líquido de resíduos. Adicione 800 microliters de solução de enxágue a cada coluna de adsorção e centrífuga por um minuto. Deixe as colunas em temperatura ambiente por alguns minutos para secar a solução restante de lavagem.
Transfira as colunas de absorção para um tubo centrífugo limpo. Adicione 50 microliters de tampão de elução ao meio dos filmes de adsorção e coloque-os em temperatura ambiente por dois a cinco minutos, depois centrifuá-los por um minuto. Prepare a mistura mestre pcr de acordo com as instruções do manuscrito, em seguida, adicione 23 microliters da mistura em cada tubo de micro centrífugas de 0,6 mililitro.
Adicione dois microliters de DNA genômico a cada tubo e cuidadosamente Cabot. Em seguida, misture brevemente e centrífuga. Coloque os tubos em um ciclofaixador PCR e inicie a amplificação.
Quando a reação terminar, realize a agarose eletroforese. Adicione 1,2 gramas de Agarose em um frasco contendo cem milímetros de TAE e ferva-o por cinco minutos no micro-ondas. Uma vez que a Agarose tenha esfriado a aproximadamente 70 graus Celsius, adicione cinco microliters de corante de ácido nucleico no frasco, lentamente, despeje-o na placa e deixe-o em temperatura ambiente até que se solidifique em um gel.
Adicione cinco microliters de cada amostra e 2-Log DNA Ladder ou DNA Marker 1, nos poços do gel agarose e eletroforese em 120 milhões de píer até que as bandas sejam separadas. Visualize o gel com um imager ultravioleta. Após realizar a transformação conforme descrito no manuscrito do texto, verifique os plasmídeos por dupla restrição de digestão enzimática com EcoR I e Bam HI. Separe os produtos digeridos com eletroforese 1%Agarose e exponha o gel à luz UV.
Diluir o plasmídeo concentrado com o fragmento de DNA suíno para duas vezes 10 a 11 cópias por mililitro para a solução padrão inicial, Usando água dupla destilada. Para estabelecer uma curva padrão, prepare uma mistura mestre qPCR, conforme descrito no manuscrito do texto e adicione 40 microliters da mistura em cada tubo de uma tira de oito tubos. Adicione 10 microliters de DNA padrão de diferentes concentrações, tampa os tubos e, em seguida, misture-os brevemente e centrífuga-los.
Coloque os tubos na máquina qPCR e realize a amplificação. Use tubos EDTA para coletar amostras de sangue de cerca de 400 microliters dos modelos de remendo da artéria de porco para macaco, ou 100 microliters dos modelos de transplante de células de porco para rato. Em seguida, transfira as amostras para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro.
Remova as células sanguíneas das amostras de sangue por centrifugação a baixa temperatura e alta velocidade. Transfira o supernante para um novo tubo centrífuga de 1,5 mililitros e remova os detritos celulares por centrifugação a 16.000 vezes G por 10 minutos. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e extraia o DNA circulante usando um soro comercial enquanto circulava o kit de extração de DNA.
Condensar o volume de DNA circulante para 40 microliters e armazená-lo a 20 graus Celsius negativos. Realize qPCR para quantificar o DNA específico do porco circulante. Primers específicos de suínos foram projetados e usados para quantificar DNA específico de porco circulante por qPCR, em modelos de transplante de células de porco para rato e patch de artéria de porco para macaco, modelos de transplante.
A eletroforese agarose foi usada para isolar fragmentos de DNA amplificados. Utilizando PCR, foram identificados os primers específicos para DNA genômico porcina amplificada. Em seguida, foram confirmadas as especificidades dessas primers na coorte de dna genômico de macacos ou humanos ou na coorte de DNA genômico do rato.
Finalmente, dois primers específicos de espécies foram usados para amplificar o DNA de porco no patch da artéria de porco para macaco e modelos de transplante de células. A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este protocolo é que a contaminação de todos os tipos deve ser evitada. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores explorarem novas questões dentro da xenotransplante, pois é um método simples de baixo custo e não invasivo para monitorar a rejeição imune da xenotransplante.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para monitorar a rejeição imunológica em xenotransplante utilizando primers específicos de suínos e qPCR. Foi desenvolvido para ser simples, econômico e minimamente invasivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Xenotransplante
- Imunologia
- Engenharia Genética
Contexto
- O xenotransplante envolve o transplante de órgãos ou tecidos de uma espécie para outra.
- A monitorização da rejeição imunológica é crucial para o sucesso dos xenotransplantes.
- Os métodos atuais podem ser invasivos ou onerosos.
- Este protocolo tem como objetivo fornecer uma técnica de monitorização mais acessível.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para quantificar o DNA suíno em modelos receptores.
- Facilitar o monitoramento das respostas imunes em xenotransplantes.
- Melhorar a viabilidade do xenotransplante em ambientes clínicos.
Métodos Utilizados
- Elaboração de primers específicos para suínos.
- Construção de plasmídeos contendo fragmentos de DNA suíno.
- Estabelecimento de curvas-padrão para quantificação de DNA.
- Uso de qPCR para quantificar cpsDNA em diversos modelos de transplante.
Resultados Principais
- Quantificação bem-sucedida de DNA suíno em modelos de transplante de porco para camundongo e de porco para macaco.
- Estabelecimento de curvas-padrão confiáveis para medição precisa.
- Demonstração da eficácia do método no monitoramento da rejeição imunológica.
Conclusões
- O protocolo fornece um método de baixo custo e menos invasivo para monitorar xenotransplantes.
- Ele possui aplicações potenciais em diversos tipos de transplante de órgãos.
- Essa abordagem pode aprimorar a compreensão das respostas imunes na xenotransplantação.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O monitoramento da rejeição imune em xenotransplante permanece um desafio crítico para o desenvolvimento pré-clínico e a tomada de decisões translacionais. Um método não invasivo baseado em qPCR para quantificar o DNA específico de suíno circulante permite a detecção precoce de lesão do enxerto e ativação imune. Essa abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas ao fornecer um biomarcador translacional associado à viabilidade do xenoenxerto, orientando decisões de avançar ou não avançar nos processos de substituição de órgãos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação dos mecanismos de rejeição de xenotransplantes por meio do rastreamento longitudinal da liberação de DNA específico por espécie.
- Valor Operacional: Fornece uma leitura padronizada e quantificável para avaliar intervenções imunomoduladoras em modelos pré-clínicos.
- Valor Preditivo: Apoia a validação de alvos ao correlacionar níveis de DNA circulante com danos ao enxerto mediados pelo sistema imunológico, reduzindo falsos positivos em abordagens terapêuticas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Estabelece um fluxo de trabalho reprodutível de qPCR com primers específicos para cada espécie e curvas-padrão para quantificação precisa de cpsDNA em diferentes modelos.
- Escalabilidade: Compatível com o processamento de alto rendimento de amostras provenientes de estudos de xenotransplante em camundongos e primatas não humanos.
- Saída Analítica: Gera dados quantitativos de concentração de DNA que permitem análises de resposta à dose e de curso temporal da integridade do enxerto.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Sistema Relevante para a Doença: Aplicável a modelos de transplante de porco para camundongo e de porco para macaco, refletindo a dinâmica imunológica interespécies relevante para xenotransplante humano.
- Continuidade Translacional: O DNA circulante atua como biomarcador não invasivo que conecta a fase de descoberta à avaliação pré-clínica de segurança.
- Progressão Ajustada ao Risco: Permite o monitoramento longitudinal para orientar esquemas de dosagem e avaliar a eficácia da imunossupressão antes de estudos GLP.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico ao fornecer uma leitura molecular do estado do enxerto que complementa os pontos finais funcionais e histológicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias imunológicas responsáveis pela perda de xenotransplantes por meio da cinética mensurável da liberação de DNA.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios para avaliação de biológicos ou moléculas de pequeno porte que visam mecanismos de rejeição.
- Análises: A quantificação de DNAcps derivada de qPCR oferece uma faixa dinâmica sensível para detectar lesão precoce do enxerto antes da diminuição funcional.
- Pesquisa Translacional: O alinhamento do biomarcador com estratégias clínicas de monitoramento de DNA circulante aumenta a confiança preditiva para aplicações humanas.
- Reutilização Empresarial: A plataforma de qPCR pode ser adaptada para diversos programas de xenotransplante (ilhotas, rim, fígado, coração) mediante redesign dos primers.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de rejeição ao fornecer uma medida direta e quantificável da morte celular suína.
- Valor Operacional: Minimiza o uso de animais por meio de amostragens sanguíneas seriadas em vez de análises com ponto final terminal.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao permitir a interrupção precoce de candidatos imunomoduladores ineficazes.
- Impacto no Portfólio: Facilita o avanço com estratificação de risco com base em métricas objetivas de integridade do enxerto.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em extração de ácidos nucleicos, otimização de qPCR e geração de curva padrão.
- Depende do acesso a instrumentação de qPCR, ferramentas de validação em gel de agarose e fluxos de trabalho com controle de contaminação.
- Necessita padronização entre equipes distintas nos procedimentos de manejo de animais, processamento de amostras e análises, para garantir consistência longitudinal.
- A adaptação a sistemas modelo alternativos exige nova validação da especificidade dos iniciadores e da eficiência da extração de DNA.
- As limitações práticas incluem possíveis interferências provenientes de fontes não enxertadas de DNA suíno e a sensibilidade do ensaio em estágios iniciais de rejeição.
