Permitindo compensação em tempo real em oxidações fotoquímicas rápidas de proteínas para a determinação de mudanças de topografia de proteínas
1 de setembro de 2020
A oxidação fotoquímica rápida das proteínas é uma técnica emergente para a caracterização estrutural das proteínas. Diferentes aditivos e ligantes de solventes têm variadas propriedades de limpeza radical hidroxyl. Para comparar a estrutura proteica em diferentes condições, a compensação em tempo real dos radicais hidroxis gerados na reação é necessária para normalizar as condições de reação.
O método facilita a medição da confirmação de proteínas e interações proteicas. A composição do buffer, a pureza da amostra e os requisitos de concentração de proteínas são flexíveis, permitindo que o método resolva problemas estruturais desafiadores. Esta técnica permite uma compressão de amostras em uma grande variedade de diferentes sistemas tampão.
Usando nosso método de dosimetria, os pesquisadores podem monitorar o quão bem suas reações de rotulagem estão funcionando em tempo real. Uma aplicação dessa tecnologia está no desenvolvimento de medicamentos porque permite aos pesquisadores testar formulações de medicamentos amplamente diferentes e como elas afetam a estrutura proteica. Para preparar o banco óptico FPOP.
Primeiro ligue o laser e coloque o laser no gatilho externo, energia constante e sem substituição de gás. Quando o laser tiver aquecido, ajuste a energia do laser por pulso entre 80 a 120 miligramas por pulso e use uma tocha de butano para queimar suavemente a codificação de poliimida do capilar no local em que o dosímetro inline lerá o sinal absorvente a 265 nanômetros após a exposição ao laser. Use um lenço sem fiapos e metanol para limpar suavemente os detritos do capilar e colocar o capilar limpo através do caminho do feixe do laser e no dosímetro inline.
Pressione a alavanca na parte superior do dosímetro da linha para abrir a dobradiça e remova os suportes magnéticos. Coloque o capilar no sulco da máquina do dosímetro inline usando os suportes magnéticos para manter o capilar no lugar e feche a dobradiça dosímetro sobre a dobradiça capilar pressionando a dobradiça até que a alavanca se esvaie no lugar. Clique no botão flash iniciar no software de dosimetria para começar a disparar o laser excimer e definir a taxa de repetição predefinida entre 10 a 20 Hertz no software de dosimetria com o disparo a laser mover o estágio motorizado através de sua amplitude de movimento, garantindo que o feixe permaneça centrado na abertura e que a silhueta do capilar possa ser observada por toda parte.
Em seguida, lave o capilar com água a 20 microliters por minuto por minuto e clique em dados de partida mais automático zero no software dosímetro para zerar o dosímetro na água antes de iniciar a coleta de dados. Para realizar um experimento FPOP adicione dois microliters de peróxido de hidrogênio a 18 microliters de solução FPOP e use uma pipeta para misturar suavemente a solução rapidamente coletar a solução na parte inferior do tubo por centrifugação e usar imediatamente uma seringa apertada a gás para carregar a solução em uma bomba de seringa. Clique na bomba inicial e inicie os dados no software dosímetro para iniciar o fluxo na bomba de seringa na taxa de fluxo apropriada e use o dosímetro inline para monitorar a leitura de adenina em tempo real até que o sinal absorvente em 265 nanômetros estabilize a coleta da amostra em um recipiente de resíduos.
Para começar a disparar o laser na taxa de repetição predefinida, clique no botão flash iniciar no software dosímetro e use o dosímetro inline para monitorar a leitura de adenina em tempo real. A diferença na absorção em 265 nanômetros com o laser desligado e o laser ligado serão os absorventes delta a 265 nanômetros de leitura. Para garantir que radicais hidroxil comparáveis estejam disponíveis para reagir com proteínas em diferentes amostras.
Compare os absorventes delta em 265 nanômetros de leitura obtidos com o dosímetro inline com os absorventes delta desejo em 265 nanômetros de leitura obtida de experimentos ou controles anteriores. Se a leitura estiver no nível desejado, colete a amostra imediatamente após o laser ou radiação no tampão de saciar. Para compensar a dose radical eficaz para equalizar as leituras de absorvência alteram a concentração de peróxido de hidrogênio, alteram a energia do laser por pulso ou alteram o plano focal da lente focal para aumentar a fluência do laser.
Para fazer uma mudança de unidade de absorção maior que 10 militos nos absorventes delta lendo refaz a amostra com mais ou menos peróxido de hidrogênio e reprisar a amostra como demonstrado. Para fazer uma pequena mudança na leitura de absorvância em tempo real, use o estágio motorizado de 50 milímetros para ajustar a posição da lente focal para ajustar o plano focal do feixe incidente. Para medir a quantidade efetiva de radical hidroxila presente na amostra após o monitoramento da radiação laser os absorventes delta de adenina a 265 nanômetros em tempo real com um detector capilar UV inline usando o estágio motorizado para ajustar a posição da lente até que os absorventes delta em 265 nanômetros de leitura seja igual à leitura desejada.
A comparação da pegada de peptídeo de cadeia pesada do biossimilar adilumumabe no tampão fosfato e após o aquecimento a 55 graus Celsius por uma hora revela que as regiões de peptídeo indicadas demonstram proteção significativa dos solventes quando a proteína é aquecida para formar agregados. O uso de um dosímetro inline em tempo real para monitorar a diferença nos absorventes de adenina antes e depois do laser ou radiação indica que uma mudança comparável no nível de absorventes de adenina é observada no buffer mes em comparação com o tampão de fosfato. Enquanto a oxidação média dos peptídeos é menor na presença de tampão MES em comparação com o tampão fosfato.
No entanto, à medida que a fluência a laser é aumentada para ter uma resposta de dosimetria de adenina igual, os valores médios de oxidação do peptídeo são quase os mesmos após o tampão e tampão de fosfato FPOP e MES. Como a leitura da dosimetria é afetada pela concentração de peróxido de fluência laser, bem como o carniceiro radical. Tome cuidado para que a resposta da dosimetria entre a pesquisa amostral próxima uma da outra.
Mutagênese dirigida ao site é frequentemente usada para sondar locais protegidos no FPOP. Isso permite que os pesquisadores determinem se as mudanças são devidas a Alistair. Esta técnica facilita a comparação de proteínas em diferentes buffers ou formulações, permitindo que os pesquisadores determinem o efeito de diferentes aditivos na confirmação da proteína.
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Visão Geral
A oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) é uma técnica inovadora para a caracterização de estruturas proteicas. Este método permite o monitoramento em tempo real da geração de radicais hidroxila, permitindo aos pesquisadores avaliar interações e conformações proteicas sob diversas condições.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Caracterização de proteínas
- Biologia estrutural
- Desenvolvimento de fármacos
Contexto
- O FPOP utiliza radicais hidroxila para oxidação de proteínas.
- Diferentes aditivos solventes influenciam as propriedades de eliminação de radicais.
- A compensação em tempo real dos radicais é crucial para resultados consistentes.
- O método é adaptável a diversos sistemas de tampão e condições de amostra.
Objetivo do Estudo
- Facilitar a medição de conformações proteicas.
- Explorar interações proteicas em tempo real.
- Avaliar o impacto de diferentes formulações de fármacos na estrutura proteica.
Métodos Utilizados
- Configuração do banco óptico FPOP.
- Composição flexível do tampão e requisitos de pureza da amostra.
- Dosimetria em tempo real para monitoramento de reações de marcação.
- Aplicação em testes de formulação de medicamentos.
Resultados Principais
- Medição bem-sucedida de interações proteicas em diferentes condições.
- Demonstrou-se flexibilidade em sistemas de tampão para problemas estruturais desafiadores.
- O monitoramento em tempo real aprimorou a confiabilidade das reações de marcação.
- Foram destacadas aplicações potenciais no desenvolvimento de fármacos.
Conclusões
- FPOP é uma ferramenta poderosa para análise estrutural de proteínas.
- A adaptabilidade do método torna-o adequado para diversas aplicações de pesquisa.
- O monitoramento em tempo real aumenta a precisão dos resultados experimentais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) permite a compensação em tempo real da variabilidade na dose de radicais hidroxila, garantindo leituras de oxidação consistentes em amostras heterogêneas. Essa capacidade apoia a detecção confiável de mudanças conformacionais, interfaces de ligação de ligantes e interações proteína-proteína na validação precoce de alvos. Ao fornecer medidas quantitativas baseadas na acessibilidade ao solvente, a FPOP aumenta a confiança preditiva em fluxos de trabalho de biologia estrutural relevantes para o desenvolvimento de biofármacos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Mede alterações na acessibilidade ao solvente para investigar hipóteses terapêuticas e esclarecer estados conformacionais de proteínas.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos ao correlacionar padrões de oxidação com mudanças estruturais específicas ligadas a ligantes ou agregados.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao fornecer dados quantitativos e reprodutíveis de impressão molecular que reduzem os riscos associados a pressupostos mecanicistas sobre o engajamento do alvo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente ao fornecer saídas de oxidação consistentes e controladas por dosimetria.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio do monitoramento em tempo real do sinal de adenina em 265 nm, reduzindo a variabilidade decorrente da fluência do laser ou dos efeitos do tampão.
- Valor de Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma em diversos sistemas tampão (por exemplo, fosfato, MES) mediante ajuste da energia do laser ou da concentração de peróxido para manter uma dose equivalente de radicais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Mantém a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, permitindo a comparação direta da topografia proteica entre formulações, tampões ou condições de estresse (por exemplo, agregação induzida por calor).
- Tomada de Decisão Ajustada ao Risco: Apoia critérios de prosseguimento ou interrupção ao quantificar padrões de proteção em peptídeos (por exemplo, cadeia pesada de biossimilar de adalimumab) sob diferentes condições ambientais.
- Redução de Riscos Mecanística: Isola alterações conformacionais reais de artefatos causados por escavadores de radicais livres ou composição do tampão mediante normalização da dose.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A FPOP insere-se no espectro de descoberta que vai do teste de hipóteses à identificação de compostos promissores, especialmente ao avaliar como formulações medicamentosas ou aditivos influenciam a estrutura proteica em condições próximas às fisiológicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao mapear alterações na acessibilidade ao solvente em resposta à ligação de ligantes, oligomerização ou estresse ambiental.
- Triagem: Fornece perfis de oxidação prontos para ensaio e reprodutíveis quando a dosimetria em tempo real estabiliza o sinal de absorbância delta entre as corridas.
- Análises: Oferece medidas quantitativas de variáveis dependentes (delta de absorbância a 265 nm) que permitem comparar a exposição a radicais hidroxila e o grau de oxidação entre amostras.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao permitir a comparação direta da topografia proteica em diferentes tampões, simulando alterações de formulação encontradas no desenvolvimento.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável controlada por dosimetria, e não como um protocolo de uso único, adaptável a múltiplos alvos e sistemas de tampão mediante ajuste de fluência a laser ou de peróxido.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio de uma correlação direta e quantificável entre oxidação e acessibilidade ao solvente.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização por meio de dosimetria em linha em tempo real que compensa flutuações do laser, decaimento do peróxido e efeitos de eliminação pelo tampão.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir decisões confiáveis de avançar/não avançar no início da descoberta, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados devido ao engajamento do alvo não confirmado.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados estruturais consistentes em conjuntos heterogêneos de amostras, facilitando a comparação objetiva de formulações medicamentosas ou mutantes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em sistemas fotoquímicos baseados em laser e em dosimetria UV-Vis para interpretação precisa do sinal.
- Depende da integração de detector capilar UV em linha e de estágio motorizado para ajuste em tempo real do plano focal e estabilização do sinal.
- Necessita padronização entre equipes dos pontos de referência de dosimetria (absorbância delta a 265 nm) para garantir comparabilidade entre diferentes locais ou experimentos.
- Envolve considerações de adaptação ao alternar entre sistemas tampão devido ao efeito variável de eliminação de radicais (por exemplo, MES versus fosfato), exigindo ajustes na fluência do laser ou na concentração de peróxido.
- Limitação prática: a compensação eficaz depende da detecção estável do sinal de adenina; deriva do sinal ou entupimento do capilar podem exigir recálculo ou manutenção.
