Name: Nanofios de Silício e Estimulação Óptica para Investigações de Acoplamento Elétrico Intra e Intercelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda a usar nanofios de silício para bioestimulação óptica intracelular em células cardíacas e cerebrais. Este método versátil permite investigações bioeletrônicas com alta resolução espacial em preparações in vitro e ex vivo.

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Este trabalho é apoiado pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea (AFOSR FA9550-18-1-0503).

Para garantir o cumprimento das normas éticas, todos os procedimentos animais relacionados à isolação de cardiomiócitos de corações de roedores foram aprovados pela Primeira Vez pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago (IACUC). Além disso, todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com a orientação da Universidade de Chicago IACUC.
1. Preparação de híbridos de Células SiNWs
<ol><li>Isole os cardiomiócitos primários (CMs) utilizando um kit comercial seguindo as diretrizes do fabricante.</li>
	<li>Prepare dMEM completo para isolamento celular primário suplementado com soro bovino fetal inativado 10%, 1% penicilina-estreptomicina e 1% L-glutamina.</li>
	<li>Para isolar o miofibroblast (MFs) da suspensão MFs-CMs, pré-emplaque as células isoladas em um prato de cultura tecidual (células isoladas de 2 corações a partir do passo 1.1. por prato de 100 mm) por 1 h. Como os CMs precisam de uma superfície tratada com fibronectina ou colágeno para aderir, apenas os MFs se ligarão à superfície da cultura tecidual.</li>
	<li>Aspire a suspensão da célula CMs enriquecida. Estes CMs podem ser usados para experimentos de acoplamento heterocelular, conforme descrito na seção 3. Enxágüe os MFs com DMEM para eliminar quaisquer CMs restantes do prato MFs.</li>
	<li>Adicione meio de cultura fresco aos MFs e permita que eles se proliferem até que sejam ~80% confluentes (2-4 dias). Mude o meio dia não.</li>
	<li>Quando as células estiverem prontas (80% confluentes), prepare siNWs para a etapa de hibridização abaixo (passo 1.7). NOTA: Muitos tipos de SiNWs podem ser usados para isso. Neste experimento, siNWs que foram cultivados por deposição de vapor químico (DCV) com uma configuração de junção p-i-n de concha central foram usados como descrito anteriormente16. Durante o crescimento da DCV, os SiNWs são cultivados em um substrato de wafer de silício, e eventualmente são mantidos como chips de silício cobertos com SiNWs.</li>
	<li>Corte um chip de 3 mm x 3 mm de um wafer com SiNWs cultivados em DCV usando um escriba de diamante. Use fórceps afiados para manusear o wafer e minimizar a área de superfície que é tocada com os fórceps, pois isso pode quebrar os SiNWs.</li>
	<li>Esterilize o chip enxaguando-o com 70% de etanol e permitindo que o etanol seque por 30 minutos sob luz UV em uma capa de fluxo laminar de biossegurança.</li>
	<li>Transfira o chip para um tubo de microcentrifus e enxágue o excesso de etanol usando mídia de cultura completa.</li>
	<li>Adicione 1 mL de mídia cultural e sonicar o chip no banho de sônica por 1-10 min. A mídia deve ficar turva à medida que os SiNWs são lançados na mídia. NOTA: O tempo e a energia da sônicação devem ser otimizados para diferentes sonicadores ou células diferentes, uma vez que durações mais curtas e potências mais baixas produzirão SiNWs mais longos.</li>
	<li>Adicione a suspensão do SiNWs em 5 mL de mídia cultural e semeeá-la no prato de cultura de tecido de 100 mm com MFs. Permita que os SiNWs internalizem por 4h e enxágue o excesso de SiNWs fora 5x com mídia. Permita que os SiNWs parcialmente internalizados completem a internalização, permitindo que eles se sentem por mais 1h antes de usar. NOTA: Diferentes tipos de células podem precisar de diferentes tempos de concentração e/ou internalização de SiNWs.</li>
	<li>Prepare a solução de revestimento de colágeno diluindo a solução de estoque de colágeno (3 mg/mL) com ácido acético estéril de 20 mM a uma razão de 1:50. Adicione a solução de revestimento de 0,5 mL a uma antena de fundo de vidro de 35 mm e deixe descansar por 1h em 37 °C. Retire a solução e enxágue o prato com PBS estéril.</li>
	<li>Colher os híbridos cell-SiNWs tratando as células com 3 mL de trippsina por 2 min a 37 °C. Adicione 10 mL de mídia cultural e enxágue os híbridos vigorosamente por pipetação. Centrifugar as células suavemente a 200 x g por 5 min para evitar danificar as células com os SiNWs internalizados. Remova o excesso de mídia, suspenda as células com mídia de 1 mL e semeie-as no prato de fundo de vidro tratado com colágeno. NOTA: Os híbridos podem ser semeados sozinhos, para investigar o acoplamento intracelular ou intercelular ou com CMs para investigar o acoplamento heterocelular in vitro.</li>
	<li>Realize uma verificação final da internalização do SiNW rotulando o citosol das células (calcein-AM, 4 μM) e membrana (marcador de membrana, 2 μM) por 30 min a 37 °C, e imagem da célula usando microscopia confocal. Como os SiNWs são altamente reflexivos, a luz refletida pode ser usada em vez de fluorescência para visualizá-los.</li>
</ol>2. Preparação de células para investigações intra e intercelulares
<ol><li>Prepare a solução de revestimento de colágeno como em 1.12</li>
	<li>Para estimulação elétrica intracelular, híbridos de cultura com baixas densidades de semeadura. Use um hemótmetro padrão para contar células da seção 1.11. e sementes 50.000 células em um prato de fundo de vidro de 35 mm na mídia cultural. Para investigações intercelulares, use densidades celulares mais altas (500.000 células por prato). Para o acoplamento intercelular entre CMs e MFs, co-cultura os híbridos com CMs recém-isolados.</li>
	<li>Permitir que as células se conectem durante a noite antes de realizar experimentos de estimulação óptica. Para investigações intercelulares, permita 48 h a 37 °C para que as células expressem junções intercelulares antes que o experimento seja realizado.</li>
	<li>Prepare a solução de estoque de corante sensível ao cálcio (pode ser mantida em -20 °C) adicionando 50 μL de DMSO a 50 μg Fluo-4 AM. Prepare a solução de coloração diluindo 1 μL de corante em 1 mL de DMEM.</li>
	<li>Aspire o meio de cultura das células e adicione 1 mL de solução de coloração. Deixe o corante internalizar nas células por 20-30 min a 37 °C. Aspire o corante e enxágue duas vezes com PBS estéril.</li>
	<li>Por fim, adicione 1 mL de DMEM Media livre de fenol-vermelho pré-aquecido e permita que o Fluo-4 intracelular se submeta à desestificação por 30 minutos em 37 °C.</li>
	<li>Transferir células para microscópio para imagem e estimulação.</li>
</ol>3. Imagem óptica e estimulação
<ol><li>Pré-aqueça um microincubador umidificado a 37 °C e a mistura de ar-CO2 bolha (95:5).</li>
	<li>Use um microscópio com uma linha laser colidida acoplada no caminho da luz para imagem de cálcio e estimulação óptica. NOTA: Um microscópio confocal de digitalização é a opção mais simples devido às suas capacidades de estimulação de ponto. No entanto, este procedimento pode ser feito usando qualquer microscópio de floresnce padrão acoplando um raio laser colidido no espaço infinito do caminho de luz usando um divisor de feixe. Qualquer objetivo de microscópio é projetado para que um laser colidido passou por ele será focado em um ponto laser limitado de difração no plano focal. O comprimento de onda laser deve estar próximo da luz de excitação, por isso será refletido pelo espelhodicróico e passado pelo filtro de excitação.</li>
	<li>Visualize os SiNWs e determine o local de estimulação usando microscopia de campo brilhante, luz transmitida ou luz reflexiva. Em seguida, reconfigure o caminho da luz para o modo fluorescência, mantendo o ponto de estimulação na localização predefinida do SiNW.</li>
	<li>Validar o poder de estimulação ideal e o comprimento do pulso para cada tamanho sinw e tipo de célula, para minimizar danos fototérmicos às células estimuladas. Para um protocolo típico de estimulação, realize um registro de linha de base de 2-10 da atividade de cálcio intracelular. Em seguida, aplique um único pulso laser de 1-10 mW de potência e 1-10 ms de duração (correspondente a 30-300 kW/mm2) para estimular o SiNW, e registrar a onda de cálcio resultante para outros 2-10 s. NOTA: É essencial otimizar a potência óptica e o comprimento do pulso para cada tamanho e células do SiNW. Isso é necessário para minimizar os danos fototérmicos às células estimuladas.</li>
	<li>Transfira os filmes gravados da estimulação óptica, se necessário, para análise posterior.</li>
</ol>4. Processamento de vídeo
<ol><li>Visualize alterações na fluorescência fluo-4 usando o macro "dF over F"17 disponível para ImageJ18, que calcula a mudança na contagem de fluorescência para cada pixel, e normaliza pelo valor médio da linha de base de repouso. Converta a saída (formato de ponto flutuante) em 8 bits para posterior processamento.</li>
	<li>Processe o filme dF/F ainda mais usando o filtro mediano seletivo "Remove outliers" disponível no ImageJ. Defina parâmetros para remover pixels onde seu valor é mais de 10 acima do valor médio em um raio de 2 pixels e substitua esse valor de pixel pela mediana.</li>
	<li>Calcule o fluxo óptico em cada quadro através do algoritmo Lucas-Kanade, conforme implementado na caixa de ferramentas Matlab Computer Vision. A saída desta função foi um campo vetorial contendo os componentes x e y do fluxo óptico em cada ponto de cada imagem (o código está disponível no Arquivo Suplementar 1). NOTA: O fluxo óptico médio dentro de uma célula, <ν>, corresponde ao desenvolvimento do fluxo de cálcio dentro de uma célula. O diferencial do fluxo óptico, Δ<ν> fornece o ponto de tempo em que a sinalização de cálcio foi ativada, identificando onde o sinal foi maximizado. Além disso, a magnitude de Δ<ν> no seu máximo está correlacionada com a taxa em que a frente de onda de cálcio progride através da célula.</li>
	<li>Calcule a velocidade intercelular da transmissão de cálcio de acordo com a seguinte equação. vCa2+ = rij / ( tmax,j − tmax,i ), onde tmax,j e tmax,i são os tempos de ativação para células j e i, respectivamente, e rij é a distância entre os centroides das células.</li>
</ol>

<ol><li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioelectric+controls+of+cell+proliferation%3A+ion+channels%2C+membrane+voltage+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li>
<li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+interactions%3A+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li>
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<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li>
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<li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li>
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<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339(2019).</li>
<li>Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229(2017).</li>
<li>Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li>
<li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte%3A+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li>
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<li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós demonstramos aqui uma maneira simples de realizar estimulação elétrica intracelular das células. Nesta demonstração, usamos MFs que foram pré-fabricados com SiNWs, depois co-cultivados com CMs. Em geral, a maioria das células que proliferam tem a tendência de internalizar SiNWs, o que permite o uso dessa metodologia com muitos outros tipos de células. Além disso, enquanto demonstramos a estimulação intracelular das células, os mesmos princípios podem ser usados para realizar estimulação extracelular das células. Isso...

Todos os organismos biológicos usam eletricidade, na forma de íons, para regular o comportamento celular. As membranas celulares contêm vários tipos de canais de íons específicos permitindo o transporte passivo e ativo de íons. Esses íons regem as funções das células excitáveis, como atividade neuronal e contratude muscular esquelética e cardíaca. No entanto, a bioeletricidade também desempenha um papel importante em células não excitáveis, regendo muitas funções celulares como a proliferação celular1, neuroimunidade2,3,4, e diferenciação de células-tronco5.
Nas últimas décadas, o campo da bioeletricidade tem atraído um nível crescente de interesse, o que tem contribuído para o desenvolvimento de inúmeras tecnologias para interfaces bioeletrônicas. Pipetas de patch de microeletrodo são o padrão ouro de gravação intracelular e estimulação6. Nesta metodologia, uma pipeta de vidro é puxada em condições específicas para formar uma borda afiada com um tamanho de poros de poucos mícrons. Esta pipeta é preenchida com um tampão e a pipeta permite o contato direto do buffer com o volume intracelular. Isso resulta em uma interface bioelétrica que produz relações de sinal a ruídos extremamente altas, controle preciso sobre a atividade elétrica celular e resolução temporal extremamente alta. Embora essa metodologia seja uma ferramenta extremamente poderosa, que recentemente foi desescalada para uma configuração de nano-pipeta7,está associada a várias limitações técnicas importantes. O efeito de diluição do citosol8,bem como vibrações mecânicas, limita sua utilidade a interrogatórios de curto prazo, e requer equipamentos especializados caros e um alto nível de habilidade técnica. Além disso, sua volumosidade limita o número de células que podem ser registradas ou estimuladas simultaneamente, e devido à sua invasividade, não pode ser reconfigurada ao longo de um experimento. Para superar essas limitações, foram desenvolvidas matrizes de microeletrodos, mas o tamanho dos eletrodos limita a resolução espacial, bem como o acesso intracelular. As matrizes nanoeletríndulas permitem gravação e estimulação intracelulares, mas requerem eletroporação abrasiva para acessar o citosol9,10. Além disso, todas essas metodologias são ligadas a substratos e, portanto, estão limitadas a culturas celulares in vitro, ou a células superficiais externas, sem acesso a células que estão dentro de um tecido tridimensional (3D).
A optogenética11 é amplamente utilizada para lidar com essas limitações 3D e in vivo. No entanto, os métodos optogenéticos são baseados nas perturbações dos canais de íons de membrana plasmática ativados pela luz que são distribuídos na membrana plasmática, limitando a resolução espacial 3D12 e as capacidades intracelulares.
Recentemente mostramos que os nanofios de silício (SiNWs) podem ser usados para realizar interrogatórios bioelétricos intracelulares com resolução espacial submicron com diferentes células não excitáveis, ou seja, miofibroblasts cardíacos e oligodenrócitos13. Além disso, usamos esses SiNWs para realizar interrogatórios específicos de células ex-vivo dentro de um tecido cardíaco 3D, para investigar como as células cardíacas se acoplam eletricamente in vivo14. Uma grande vantagem dessa metodologia é sua simplicidade; não requer qualquer modificação genética ou instrumentação volumosa. Muitas células internalizarão espontaneamente SiNWs foto-responsivos sem necessidade de sônica ou eletroporação15. Além disso, eles escaparão espontaneamente do encapsulamento endosomal e formarão uma integração perfeita com as organelas citosol e intracelular13,15. Esses compostos célula-SiNWs, denominados híbridos de silício celular, possuem a natureza dinâmica, suave e versátil da célula original, bem como as capacidades optoelétricas dos SiNWs. Após a hibridização, o híbrido celular-SiNW pode ser colhido utilizando técnicas padrão de cultura tecidual e usado para diversas aplicações, como estimulação bioelétrica intracelular; estudar o acoplamento bioelétrico intercelular in vitro; e para interrogatório específico de célula in vivo. Como uma estimulação eficaz requer a co-localização de altas densidades de energia óptica e SiNWs, pode-se alcançar alta resolução espacial tanto em 2D quanto em 3D. Neste protocolo descrevemos detalhadamente a metodologia, bem como como os resultados podem ser analisados. O foco é colocado na investigação intra e intercelular in vitro, mas a implementação in vivo dessa metodologia pode ser utilizada diretamente para muitos outros cenários biológicos.

<table><tbody><tr><td>35 mm Pratos de fundo de vidro</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr><tr><td>3i Marianas Spinning Disk Confocal</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Laranja Membrana de plasma Mancha</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, rabo de rato</td><td>Gibco</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Deluxe Diamond Scribing Pen</td><td>Ted Pella</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, piruvato, sem glutamina</td><td>Gibco</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Placas de</td> Cultura de Tecidos Padrão <td>Anidro Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Falcon</td><td></td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, certificado, inativado por calor,</td> <td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina Proteína Humana, Plasma</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB11201</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, célula permeável</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>OKO câmara de controle ambiental completa (constante temperatura, umidade e CO2)</td><td>OKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Kit de Isolamento de Cardiomiócitos</td><td>Primários Thermo Scientific</td><td>88281</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

nanofios de silício e estimulação Óptica para investigações de acoplamento elétrico intra e intercelular

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Myofibroblasts pode internalizar espontaneamente nanofios de silício (SiNWs), tornando-os um alvo atraente para aplicações bioeletrônicas. Esses híbridos de silício celular oferecem capacidades de modulação óptica sem chumbo com perturbação mínima ao comportamento celular normal. As capacidades ópticas são obtidas pelas propriedades fototérmicas e fotoelétricas dos SiNWs. Esses híbridos podem ser colhidos usando técnicas padrão de cultura tecidual e, em seguida, aplicados a diferentes cenários biológicos. Demonstramos aqui como esses híbridos podem ser usados para estudar o acoplamento elétrico das células cardíacas e comparar como os miofibroblasts se casam uns com os outros ou com cardiomiócitos. Este processo pode ser realizado sem equipamento especial além de um microscópio fluorescente com linha laser acoplada. Também é mostrado o uso de uma rotina MATLAB personalizada que permite a quantificação da propagação de cálcio dentro e entre as diferentes células da cultura. Myofibroblasts são mostrados ter uma resposta elétrica mais lenta do que a de cardiomiócitos. Além disso, a propagação intercelular myofibroblast mostra velocidades ligeiramente mais lentas, embora comparáveis às suas velocidades intracelulares, sugerindo propagação passiva através de junções de lacunas ou nanotubos. Essa técnica é altamente adaptável e pode ser facilmente aplicada a outras arenas celulares, tanto para investigações in vitro quanto in vivo ou ex vivo.

A capacidade dessa metodologia de permitir o acesso direto ao citosol intracelular depende da internalização espontânea do SiNW nas células. Embora os SiNWs sejam submetidos à internalização espontânea em muitos tipos de células15, algumas células, como cardiomiócitos e neurônios, precisarão que os SiNWs sejam tratados para permitir sua internalização19. Neste protocolo descrevemos o processo de internalização de P-i-n SiNWs com 200-300 nm de diâmetro e ~1-3 μm de comprimen...

Este protocolo descreve o uso de nanofios de silício para bio modulação óptica intracelular de células em um método simples e fácil de executar. A técnica é altamente adaptável a diversos tipos de células e pode ser usada para aplicações in vitro e in vivo.

Nanofios de Silício e Estimulação Óptica para Investigações de Acoplamento Elétrico Intra e Intercelular

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Esta técnica permite interrogatório bioelétrico intracelular com altíssima resolução espacial e especificidade celular usando apenas microscopia óptica padrão. Este método facilita a estimulação e interrogatório elétrico de células e locais específicos dentro das células e pode ser realizado in vitro, bem como em preparações de tecido ex vivo 3D. Essa técnica permite a investigação bioeletrônica de muitas arenas celulares, como células cardíacas ou cerebrais, bem como a comunicação elétrica entre todas as nossas células não excitáveis.Para isolar os miofibroblasts de uma suspensão de cardiomiócito miofibroblast, pré-plaquetas as células isoladas em um prato de cultura tecidual de 100 milímetros por uma hora, como cardiomiócitos precisam de uma superfície de pescoço de fibra e tratada para aderir. No final da incubação, colete o cardiomiócito enriquecido contendo supernaciante para co-cultura a jusante. Enxágüe os myofibroblasts com DMEM para eliminar quaisquer cardiomiócitos restantes e alimente as células com meio de cultura fresco antes de dois a quatro dias adicionais de incubação.Quando as células atingirem 80% de confluência, use um escriba de diamante para cortar um chip de três por três milímetros de um wafer com nanofios químicos de silício cultivados em vapor. E use fórceps afiados para enxaguar os chips em 70% de etanol. Depois de enxaguar, seque os chips por 30 minutos sob luz ultravioleta em um capô de fluxo laminar de biosegurança, antes de transferir os chips para um tubo de micro centrífuga estéril.Use uma lavagem completa da cultura celular para remover qualquer etanol restante, antes de sonicar os chips em um mililitro de meio de cultura fresca em um banho de sônica por um a 10 minutos. O supernaspe deve ficar nublado à medida que os nano fios são liberados. Misture a suspensão do nanofio de silício em cinco mililitros de cultura fresca média e semente a solução de nano fio no prato de myofibroblasts.Depois de quatro horas na incubadora de cultura celular, enxágue o prato cinco vezes com meio de cultura fresco para remover quaisquer nanofios não internizados e continuar a incubar as células por mais uma hora para permitir que quaisquer nanofios parcialmente internalizados sejam completamente incorporados. Em seguida, adicione 500 microliters de solução de revestimento de colágeno recém-preparada para um prato de fundo de vidro de 35 milímetros. Após uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius, enxágue o prato com PBS estéril e colher os híbridos de nanofio de silício myofibroblast, com três mililitros de trippsina, por dois minutos a 37 graus Celsius.Quando as células se separarem, pare a reação com 10 mililitros de cultura média, enxágue vigorosamente por pipetação e não centrífuga acima de 200 G para evitar danificar as células. Em seguida, suspenda novamente as pelotas híbridas em um mililitro de meio fresco, e semee as células no prato de fundo de vidro revestido de colágeno. Para verificar a internalização do fio nano, rotule as células com citoso fluorescentes e corantes de membrana, de acordo com os protocolos padrão, e use um microscópio confocal para a imagem das células.Como os nanofios de silício são altamente reflexivos, a luz refletida pode ser usada em vez de fluorescência para sua visualização. Para configurar uma co-cultura de cardiomioceto híbrido de nanofio de silício de silício, semeou o número apropriado de cada tipo de célula em um prato de fundo de vidro revestido de colágeno. E cultivar as células a 37 graus Celsius por 48 horas, para permitir que as células formem junções intercelulares.No dia do experimento, substitua a supernasa cultura por um mililitro de cultura de meio suplementado com corante sensível ao cálcio recém-preparado, para uma incubação de 20 a 30 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, lave a placa duas vezes com PBS estéril, antes de tratar as células com um mililitro de DMEM livre de fenol pré-aquecido. Em seguida, permita que o corante de cálcio intracelular se submeta à desestreificação por 30 minutos a 37 graus Celsius, antes de adquirir imagens de linha de base.Antes da imagem óptica e estimulação, pré-aqueça uma micro-incubadora umidificada em um microscópio com uma linha laser colidida acoplada no caminho da luz, para imagem de cálcio e estimulação óptica a 37 graus Celsius e uma mistura de dióxido de carbono da era da bolha de 5%. Quando o microscópio estiver pronto, coloque a co-cultura de cardiomiócito híbrido myofibroblast na micro incubadora e visualize os nanofios por microscopia de campo brilhante para localizar um local de estimulação apropriado. Quando um local for identificado, reconfigure o caminho da luz para o modo fluorescência, mantendo o ponto de estimulação na localização pré-definida do fio nano, e valide a potência de estimulação ideal e o comprimento do pulso, para cada tamanho de nanofio de silício e tipo de célula.Adquira uma gravação de dois a dez segundos da atividade de cálcio intracelular da linha de base, antes de estimular o nano fio com um único pulso laser de um a 10 melowatts de potência e uma duração de um a 10 milissegundos, registrando a onda de cálcio resultante por mais dois a dez segundos. No final do experimento transferir os filmes gravados da estimulação óptica para o programa de software apropriado, para análise adicional. Usando óptica de contraste de fase padrão, as células de confluência são facilmente vistas por microscopia leve.Os nanofios de silício, no entanto, são pouco visíveis, tornando suas localizações impossíveis de definir por este método. A super imposição de imagens de campo claro e escuro, no entanto, permite a visualização do arranjo nuclear perry dos nanofios de silício refletivos leves. A microscopia confocal pode ser usada para visualizar o marcador fluorescente manchado de citosol e membranas plasmáticas, tornando a localização intracelular dos nanofios de silício mais evidente.Usando microscopia padrão, uma imagem de campo brilhante pode ser obtida para identificar a localização do nanofio de silício a ser estimulado. Um pequeno vídeo de linha de base dos cardiomiócitos espontaneamente batendo e os myofibroblasts descansando pode então ser adquirido. Após a estimulação, a propagação do cálcio dentro da cocultura pode ser registrada.O momento em que as diferentes células ficam excitadas pode ser determinado pelo ponto em que a mudança no fluxo óptico médio atinge seu máximo. O fluxo óptico pode então ser calculado para auxiliar na identificação do tempo de ativação dentro de cada região celular. As velocidades intracelulares podem ser determinadas para cada célula usando gráficos khaimah, com a inclinação da linha representando o inverso da velocidade de propagação intracelular.Por exemplo, aqui, pode ser observado um resumo das diferentes velocidades inter e intracelulares medidas para as interações celulares dentro de uma única cocultura. Este método pode ser utilizado para estudos in vivo injetando os híbridos de silício celular diretamente no tecido e usando preparações ex vivo 3D para estudar a empresa elétrica in vivo.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este protocolo ilustra como sensíveis à voltagem corantes permitir a gravação ótica da atividade elétrica de redes neurais intactos, como os plexos do cobaia sistema nervoso entérico, com uma resolução ajustável que varia de single-células ganglionares para multi-circuitos.

A gravação óptica de atividade elétrica na Guiné-porco Networks Enteric usando Tensão sensível Corantes

Adulto-nascido neurônios expressando ChR2 pode ser manipulado em preparações fatia eletrofisiológicos, a fim de examinar sua contribuição para a função olfativa de circuitos neurais.

Acessível usando Arrays LED para Foto Estimulação de Neurônios

Descrevemos os métodos de larga escala de gravação de várias unidades e potencial de campo local, comportando roedores com sondas de silício. Unidade de fabricação, o apego sonda para a unidade e os processos de implantação de teste são ilustrados em detalhes suficientes para a replicação fácil.

Em larga escala de gravação de Neurônios por sondas de silicone móveis em Comportando Roedores

Este vídeo demonstra o uso de um chip microfluídico revestido com matriz extracelular para diferenciar células-tronco neurais e progenitoras ou NPCs por meio de estimulação elétrica. Após a semeadura e aderência à região revestida, os NPCs crescem e a aplicação de uma corrente contínua desencadeia sua diferenciação em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos.

Diferenciação induzida por estimulação elétrica de células-tronco neurais e progenitoras

A estimulação do nervo infravermelho tem sido proposto como uma alternativa para a estimulação eléctrica em uma variedade de tipos de nervos, incluindo os que estão associados ao sistema auditivo. Este protocolo descreve um método de patch clamp para estudar o mecanismo da estimulação do nervo no infravermelho de uma cultura de neurónios auditivos primários.

Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared

Este protocolo descreve como usar o aquecimento transitório associado à absorção óptica de nanobastões de ouro para estimular a diferenciação e a atividade intracelular de cálcio em células neuronais. Esses resultados potencialmente abrem novas aplicações em próteses neurais e estudos fundamentais em neurociência.

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Um método para estimulação da atividade elétrica de culturas de células in vitro com luz visível é descrito.

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

culturas neuronais são um bom modelo para o estudo de técnicas emergentes de estimulação do cérebro através de seus efeitos sobre os neurônios individuais ou uma população de neurônios. Aqui apresentados são diferentes métodos para a estimulação de culturas neuronais modeladas por um campo eléctrico produzido directamente por eléctrodos de banho ou induzida por um campo magnético variável no tempo.

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Aqui, apresentamos o método de fabricação de um sistema optrode com fibras ópticas para entrega de luz e uma matriz de eletrodos para gravação neural. Experimentos in vivo com camundongos transgênicos expressando channelrhodopsin-2 mostram a viabilidade do sistema para estimulação optogenética simultânea e gravação eletrofisiológica.

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Aprenda a usar nanofios de silício para bioestimulação óptica intracelular em células cardíacas e cerebrais. Este método versátil permite investigações bioeletrônicas com alta resolução espacial em preparações in vitro e ex vivo.

Nanofios de Silício e Estimulação Óptica para Investigações de Acoplamento Elétrico Intra e Intercelular

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