Name: Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprenda a preparar lipossomas marcados com corante fluorescente e avaliar sua captação celular in vivo por citometria de fluxo. Este método reprodutível utiliza temperaturas baixas e equipamento acessível para estudos de biologia celular e entrega de fármacos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a Michael Solga e ao resto da equipe do Núcleo de Citometria de Fluxo por fornecer treinamento e serviços de citometria de fluxo. Os autores também gostariam de agradecer a Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye e Prasad Srikakulapu por sua assistência com a preparação de lipossomas (SSKD, DKB), colheitas de tecidos (MAM, JCG) e coloração por citometria de fluxo e aquisição de amostras (AU, PS, CM). Este trabalho foi apoiado por AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 e R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 e T32 HL007284 subvenções.

<ol><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+from+concept+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).</li>
<li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 286(2015).</li>
<li>Osinski, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liposomal+delivery+of+PPAR%CE%B1%2F%CE%B3+dual+agonist+tesaglitazar+in+a+model+of+obesity+enriches+macrophage+targeting+and+limits+liver+and+kidney+drug+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">In vivo liposomal delivery of PPARα/γ dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects.</a> Theranostics. 10 (2), (2020).</li>
<li>Bauknight, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+thorough+tissue+and+cellular+level+characterization+of+targeted+drugs+in+the+evaluation+of+pharmacodynamic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects.</a> PLoS ONE. 14 (11), (2019).</li>
<li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+A+Fundamental+Process+in+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity.</a> BioMed Research International. , (2017).</li>
<li>He, H., Ghosh, S., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicines+for+dysfunctional+macrophage-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases.</a> Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).</li>
<li>Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+the+mononuclear+phagocyte+system%3A+pharmacokinetics+and+applications+for+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases.</a> Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).</li>
<li>Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liposome+size+on+the+circulation+time+and+intraorgan+distribution+of+amphipathic+poly%28ethylene+glycol%29-containing+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes.</a> BBA - Biomembranes. , (1994).</li>
<li>Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+investigating+in+vivo+fate+of+nanoliposomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).</li>
<li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+whole+body+biodistribution+of+fluorescent-labeled+agents+by+non-invasive+tomographic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging.</a> PLoS One. 6 (6), 20594(2011).</li>
<li>Larmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence-mediated+tomography+for+quantification+of+urokinase+receptor-dependent+leukocyte+trafficking+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation.</a> Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clodronate+liposomes+improve+metabolic+profile+and+reduce+visceral+adipose+macrophage+content+in+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice.</a> PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).</li>
<li>Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+clodronate+liposomes+eliminates+visceral+adipose+macrophages+and+blocks+high-fat+diet-induced+weight+gain+and+development+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance.</a> The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).</li>
<li>Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-obesity+and+anti-inflammatory+effects+of+macrophage-targeted+interleukin-10-conjugated+liposomes+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice.</a> Biomaterials. 110, 81-88 (2016).</li>
<li>Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+an+active+and+passive+targeting+to+tumor+and+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Nakhlband, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combating+atherosclerosis+with+targeted+nanomedicines%3A+Recent+advances+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22BioImpacts%22%5BJournal%5D)">Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective.</a> BioImpacts. , (2018).</li>
<li>Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+targeted+nanotherapeutic+approach+for+obesity+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment.</a> International Journal of Nanomedicine. , (2018).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> Journal of Cell Biology. , (1986).</li>
<li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarren%2C+JSA+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22">Journal of visualized experiments : JoVE</a>. , (2019).</li>
<li>Dasa, S. S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plectin-targeted+liposomes+enhance+the+therapeutic+efficacy+of+a+PARP+inhibitor+in+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer.</a> Theranostics. , (2018).</li>
<li>Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-mediated+recruitment+of+NK+cells+is+a+critical+host+defense+mechanism+in+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2003).</li>
<li>Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jirón Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digestion+of+the+murine+liver+for+a+flow+cytometric+analysis+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e58621(2019).</li>
<li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation research. , (2019).</li>
<li>O'Brien, C. A., Harris, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui descrevemos um protocolo de três partes para (i) preparar lipossomas que são marcados com um corante lipídico fluorescente e carregados com um composto antidiabético, tesaglitazar, (ii) administrar lipossomas a um camundongo via injeção retro-orbital e (iii) coletar, processar e corar tecidos para detectar a captação de lipossomas em nível celular por citometria de fluxo. Este protocolo revisa o preparo de lipossomas de aproximadamente 150 μm e a avaliação da captação no tecido adiposo, no sangue e no baço. A preparação dos lipossomas é escalável, realizada principalmente à temperatura ambiente, e utiliza evaporação em fase reversa para maximizar a carga de fármacos e remoção de solventes orgânicos. Usando este protocolo, até 2 mg/mL de tesaglitazar pode ser alcançado na amostra de lipossomas purificada. Os lipossomas preparados podem ser armazenados em tampão HEPES a 4 °C por mais de um ano. Em nossa experiência, eles demonstraram variação mínima do tamanho médio das partículas. Menos de 10% de perda de conteúdo do fármaco foi demonstrada espectrofotometricamente, após separação por ultrafiltração dos lipossomas do fármaco externo com filtro centrífugo de 10 kDa.
Durante a preparação do lipossoma, existem algumas etapas e fatores críticos a serem considerados. Primeiramente, a ordem das etapas do protocolo é importante e deve ser respeitada. Em segundo lugar, o pH da solução utilizada durante o carregamento do tesaglitazar deve ser mantido em 7,4 para maximizar a solubilidade e o carregamento eficaz. Terceiro, a montagem adequada de equipamentos e filtros garante que a saída de cada etapa seja do tamanho e pureza adequados. Por exemplo, se os filtros de 100 e 200 nm não forem montados corretamente, um lote mais heterogêneo e de tamanho inadequado de lipossomas pode resultar. Quarto, a remoção completa do acetato de Ca-antes do carregamento da droga é necessária para maximizar a transferência de tesaglitazar para os lipossomas. Para testar a remoção completa de Ca-acetato, use sedimentação de alta velocidade para remover os lipossomas e, em seguida, medir os níveis de Ca-acetato na solução não lipossomal. Em quinto lugar, é importante pesar e registrar a massa de todos os materiais adicionados ao preparo dos lipossomas em cada etapa. Isso garante que as concentrações adequadas possam ser calculadas e as proporções necessárias de materiais sejam mantidas. Finalmente, se a técnica não for executada adequadamente, pode haver um nível indesejável de heterogeneidade. É importante verificar minuciosamente este parâmetro usando DLS e outras abordagens, como a microscopia eletrônica. Para melhorar a homogeneidade, considere ajustar o tamanho do filtro selecionado ou empilhar dois filtros.
Além disso, é fundamental que os controles e um painel de anticorpos para citometria de fluxo sejam planejados e otimizados antes da realização completa desse protocolo (Tabela 1, Tabela 3). Os anticorpos devem ser testados para garantir que concentrações adequadas sejam usadas para coloração e que a sobreposição entre os fluoróforos seja mínima. A excitação e emissão do corante usado durante a preparação dos lipossomas também devem ser levadas em consideração no planejamento do painel. Em nossos resultados, utilizamos o DiD, que tem excitação e emissão semelhantes a fluoróforos como Aloficocianina (APC) e AlexaFluor 647. Assim, não selecionamos anticorpos conjugados a esses fluoróforos em nosso painel de anticorpos. Além disso, controles isotípicos não estão incluídos neste protocolo. Isso ocorre porque os anticorpos selecionados para esse protocolo são anticorpos bem validados e disponíveis comercialmente. No entanto, se estiver interessado em usar um anticorpo que não tenha sido otimizado anteriormente, considere testar o anticorpo contra um controle de isótipo nos tecidos de interesse antes de realizar o experimento completo.
Embora este protocolo demonstre como extrair e processar o sangue, baço, tecido adiposo inguinal e tecido adiposo epididimal do camundongo pós-tratamento, esta abordagem geral pode ser aplicada a outros tecidos. Dependendo do tecido de interesse, os protocolos de processamento e digestão podem precisar ser alterados, como é publicado para os seguintes tecidos: pulmão 21, fígado22, cavidade peritoneal 3, medula óssea3,23, cérebro 24.
Uma limitação importante deste método a considerar é que a captação só pode ser avaliada em um momento por animal. Assim, pode ser vantajoso acoplar este protocolo a outras técnicas de imagem não invasivas ou planejar adequadamente para garantir recursos suficientes para a realização da avaliação. O tempo de captação celular e o turnover celular são fatores importantes a serem considerados: os lipossomas circularão por todo o corpo nas primeiras 24 h e, dependendo da vida útil das células que absorvem lipossomas ou como eles respondem à captação, pode ocorrer morte celular ou fagocitose adicional. Nosso estudo anterior demonstrou mudanças nas características populacionais de populações DiD+ em diferentes momentos3. Por essa razão, é importante avaliar a captação em momentos anteriores ou em momentos mais relevantes para a biologia do mecanismo de interesse. Além disso, embora a quantificação da captação celular em todo o tecido possa ser realizada com esse protocolo, a citometria de fluxo não pode revelar a localização tecidual. O acoplamento dessa abordagem com métodos histológicos pode ajudar a resolver essa limitação.
Em geral, esse protocolo complementa a metodologia existente, como a histologia e a imagem de fluorescência de corpo inteiro. Com os avanços contínuos nas ferramentas e métodos de citometria de fluxo, o desenvolvimento de painéis maiores para populações celulares cada vez mais específicas se tornará possível. Sugerimos que este protocolo seja utilizado em adição aos métodos supracitados, pois melhorará a avaliação da captação celular e também proporcionará a oportunidade de validar os resultados observados por citometria de fluxo. Por exemplo, caso se verifique que a maioria das partículas no tecido adiposo foi absorvida por macrófagos por citometria de fluxo. A imunofluorescência de uma alíquota adicional do mesmo tecido adiposo poderia ser salva, fixada, seccionada e corada para marcadores de macrófagos para verificar se o tipo celular realmente absorve lipossomas. Essa abordagem deve adicionar rigor aos ensaios de biodistribuição de nanopartículas realizados: validação de alvos específicos para células, quantificação da captação celular, identificação de captação fora do alvo e, esperançosamente, fornecer informações para gerar hipóteses mecanicistas para os resultados terapêuticos observados. Este protocolo também pode ser adaptado para estudos futuros utilizando diferentes lipossomas, investigando a captação em outros tecidos e testando novos compostos no contexto de obesidade e dismetabolismo ou qualquer outra doença em que a liberação de nanopartículas seja uma opção terapêutica viável.

À medida que cresce o interesse no desenvolvimento de terapias utilizando nanopartículas para liberação de fármacos, os métodos para preparar e avaliar a distribuição e absorção de partículas devem continuar avançando, expandindo-se e sendo acessíveis à comunidade de pesquisa 1,2. Esse protocolo foi desenvolvido para avaliar os tipos celulares exatos que absorveram lipossomas in vivo após um tratamento com lipossomas marcados com DiD carregados com tesaglitazar, um agonista do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma (PPAR)-α/γ 3,4. Nesses estudos, pudemos avaliar quais tipos celulares foram diretamente impactados pelo tratamento com tesaglitazar lipossomal, a eficácia de direcionar metades e gerar hipóteses para explicar os resultados do tratamento observados. Além disso, funções biológicas estabelecidas em uma variedade de tipos celulares sugerem que células fagocíticas como macrófagos, células dendríticas e células de Kupffer hepatoespecíficas absorvem a maioria dos lipossomas 5,6,7. Utilizando este protocolo, demonstramos que fagócitos não clássicos também poderiam absorver lipossomas 3,4.
Este protocolo apresenta um método otimizado para solubilização do tesaglitazar, preparo de lipossomas por evaporação em fase reversa e uso de acetato de cálcio como atrativo para carregamento remoto de fármacos. Os métodos apresentados são acessíveis a muitos laboratórios e carecem de materiais de difícil aquisição e etapas que exigem altas temperaturas. O protocolo produz lipossomas de tamanhos ideais para o aumento da circulação invivo8. Além disso, como resumido por Su et al., até o momento, métodos para avaliar in vivo a distribuição de lipossomas e a captação tecidual têm sido estudados e testados emprofundidade9. Os métodos de tomografia por emissão de pósitrons (PET), ressonância magnética (RM) e tomografia molecular de fluorescência (FMT) são aplicados para quantificar a biodistribuição e captação tecido-específica9,10,11. Embora esses métodos tenham sido otimizados para maximizar a detecção in vivo, eles ainda não têm a capacidade de quantificar a captação de lipossomas in vivo na resolução celular. O protocolo aqui apresentado visa suprir essa necessidade por meio do uso da citometria de fluxo. Finalmente, para esse protocolo, a captação celular foi reduzida a alguns tecidos, incluindo o tecido adiposo. Há uma crescente literatura investigando o potencial do uso de nanopartículas para administrar terapias no contexto de obesidade, dismetabolismo e inflamação 12,13,14,15,16,17. Como tal, sentimos que era importante partilhar um protocolo com métodos eficazes para processar e analisar o tecido adiposo – um dos tecidos que desempenha um papel importante nestas patologias.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>agulha de calibre 25, estéril para injeção retro-orbital</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>agulha de calibre 27, estéril para injeção retro-orbital</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-rato CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Clone AFS98</td></tr><tr><td>Anti-rato CD11b PerCP Cy5.5 anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Anti-rato CD11c APC ef780 anticorpo</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti-rato CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Clone 1D3</td></tr><tr><td>Anti-rato CD3 FITC anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Clone 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-rato CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Clone 390</td></tr><tr><td>Anti-rato CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-rato F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Dessalinização spin-coluna</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Coluna giratória Zeba</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Espalhamento de luz dinâmico, Sistema de dimensionamento de partículas Nicomp 370</td><td>, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX & Kit de permeabilização de células PERM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gaze</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Extrusora de lipossomas</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Vivo/morto Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante oftálmico</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz Paraformaldeído Estéril</td></tr><tr><td>, 16% p/v aq. soln., sem metanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de polietileno para picar</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>Bomba e almofada de terapia de calor</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de policarbonato gravadas em esteira</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, membranas hidrofílicas de policarbonato Nuclepore</td></tr><tr><td>Sistema ZetaSizer/DLS-ELS</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação, administração e avaliação da captação celular tecido-específica in vivo de lipossomas marcados com corante fluorescente

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Há um interesse crescente no uso de lipossomas para entregar compostos in vivo, particularmente para abordagens de tratamento direcionadas. Dependendo da formulação do lipossoma, os lipossomas podem ser preferencialmente absorvidos por diferentes tipos de células no corpo. Isso pode influenciar a eficácia da partícula terapêutica, uma vez que a progressão de diferentes doenças é específica do tipo tecidual e celular. Neste protocolo, apresentamos um método para síntese e marcação fluorescente de lipossomas usando DSPC, colesterol e DSPE PEG-2000 e o corante lipídico DiD como marcador fluorescente. Este protocolo também apresenta uma abordagem para a administração de lipossomas in vivo e avaliação da captação célula-específica de lipossomas usando citometria de fluxo. Esta abordagem pode ser usada para determinar os tipos de células que absorvem lipossomas e quantificar a distribuição e proporção de captação de lipossomas entre tipos celulares e tecidos. Embora não mencionados neste protocolo, ensaios adicionais, como imunofluorescência e imagem de fluorescência de célula única em um citômetro, fortalecerão quaisquer achados ou conclusões feitas, pois permitem a avaliação da coloração intracelular. Os protocolos também podem precisar ser adaptados dependendo do(s) tecido(s) de interesse.

Produção de Lipossomas
Os resultados aqui publicados são semelhantes aos de nosso trabalho publicado anteriormente 3,4,20. Utilizando o protocolo aqui apresentado, esperamos produzir lipossomas de aproximadamente 150\u2012160 nm de tamanho. A DLS revela diâmetro médio dos lipossomas de 163,2 nm e potencial zeta de -19,2 mV (Figura 1A). A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) revela lipossomas circulares (Figura 1B) e o diagrama DLS revela um desvio padrão relativamente pequeno do diâmetro médio (Figura 1C).
A ligação positiva aos lipossomas requer um controle tratado com PBS
Estudos anteriores de nosso grupo empregando esse protocolo investigaram quais subtipos celulares em FVS, baço e sangue adiposos se ligavam a lipossomas após uma semana de administração in vivo 3,4. Usando um camundongo tratado com PBS, as células da cavidade peritoneal e do baço foram coradas com o mesmo painel de anticorpos usado em amostras de camundongos tratados com lipossomas. Os tecidos foram colhidos após uma semana de tratamentos (Figura 2A). As amostras do camundongo tratado com PBS serviram como um FMO DiD com o qual criar portas DiD positivas (Figura 2B,C). Uma porta positiva pode ser criada usando o sinal DiD-positivo, mas amostras sem sinal DiD também devem ser usadas para verificar se a porta positiva não inclui amostras DiD-negativas.
Titulações são necessárias para otimizar sinais de fluorescência
Antes de executar um experimento completo, várias condições, incluindo a concentração de anticorpos fluorescentemente conjugados usados durante a coloração celular e de corante lipídico usado durante a preparação de lipossomas, devem ser otimizadas. Os citômetros de fluxo têm um limite superior de detecção para intensidade de fluorescência, então muito corante incorporado nos lipossomas levará a níveis não quantificáveis de sinal DiD em amostras que passam pelo citômetro. Além disso, muito DiD nos lipossomas pode levar a altos níveis de transferência de corante inespecífico, o que poderia distorcer os resultados de captação celular. A Figura 3 relata os resultados de um experimento em que as concentrações de corante lipídico foram tituladas para identificar a concentração que produziria um sinal ótimo dentro da faixa de detecção do citômetro de fluxo utilizado. Este foi realizado nos tecidos de interesse para o experimento final: sangue (Figura 3A), FVS adiposa inguinal (Figura 3B) e FVS adiposa epididimal (Figura 3C). As concentrações selecionadas para teste foram 10 mg de DiD (Alto, vermelho), 1 mg de DiD (Médio, azul) ou 0,1 mg de DiD (Baixo, cinza) por 1 mL de lipossomas. A maior concentração utilizada nos lipossomas foi muito alta e ultrapassou a faixa quantificável do citômetro nos três tecidos (Figura 3A\u2012C, vermelho). A menor concentração de DiD mostrou algum sinal (Figura 3 A\u2012C, cinza), mas uma população clara além das células tratadas com PBS (Figura 3A\u2012C, preto) não foi observada. Quando quantificada, a média aritmética da IFM DiD para cada tecido e concentração demonstrou uma clara distinção entre os controles PBS e a concentração média de DiD (Figura 3D). Assim, conforme indicado no protocolo, selecionamos a concentração média (Figura 3, azul) para utilizar em nosso preparo lipossomo.
O uso do painel de múltiplos anticorpos permite a identificação da captação de lipossomas por diferentes subgrupos celulares
Utilizando o painel delineado na Tabela 3, as células foram coradas com anticorpos contra marcadores para macrófagos A, células B, células T, células dendríticas, monócitos e células endoteliais (Figura 4). Estratégias de gating ligeiramente diferentes são necessárias para cada tipo de tecido, mas a maioria dos mesmos tipos celulares pode ser identificada em cada um. Algumas exceções incluem células endoteliais, que normalmente não são encontradas no sangue, e monócitos, que normalmente estão em maior frequência no sangue do que outros tecidos. Uma vez identificadas as populações, pode-se quantificar o tamanho total de cada célula e a frequência com que são DiD+. Cálculos adicionais podem ser realizados para caracterizar a população DiD+: qual porcentagem de células DiD+ são macrófagos, células endoteliais, etc. Por favor, note que estas são estratégias de gating exemplo, mas não a única maneira de analisar as amostras. A análise será ditada pelo painel selecionado e citômetro(s) de fluxo disponíveis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Figura 1: Exemplo de características dos lipossomas preparados. (A) O tamanho e o potencial zeta foram medidos como descrito acima e foram relatados em forma de tabela. Cada parâmetro é apresentado como média ± desvio padrão. (B) Crio-ME foi utilizada para obtenção de imagens dos lipossomas preparados. A barra de escala branca tem 50 nm de comprimento. (C) A DLS foi utilizada para gerar um histograma do diâmetro dos lipossomas nessa preparação. Esta figura é adaptada de Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Figura 2: Coloração DiD representativa de camundongos tratados com PBS ou Lipossoma. (A) Esquema experimental para PBS e tratamentos com lipossomas. PBS ou lipossomas foram injetados três vezes ao longo de uma semana. Os tecidos foram colhidos no 8º dia de tratamento. (B, C) Fluxogramas representativos revelam coloração DiD positiva em camundongos tratados com lipossomas (C), mas não tratados com PBS (B). FSC, dispersão para a frente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Figura 3: Titulação de DiD em lipossomas. Lipossomas foram preparados com três diferentes concentrações de DiD e injetados em camundongos. O cinza indica a baixa concentração em 0,1 mg de DiD por 1 mL de lipossomas, o azul indica a concentração média em 1 mg de DiD/mL de lipossomas e o vermelho indica a alta concentração em 10 mg de DiD/mL de lipossomas. Um camundongo tratado com PBS foi usado como controle negativo (preto). Sangue (A, círculo), adiposo inguinal (B, triango) e adiposo epididimal (C, quadrado) foram colhidos 24 h após a injeção e processados para isolar uma suspensão unicelular. Essas amostras foram executadas em citômetro de fluxo até o nível de DiD detectável. Histogramas tecido-específicos com sobreposições de cada grupo de tratamento são apresentados para demonstrar a intensidade de fluorescência por concentração (A\u2012C). A média aritmética do DiD também foi quantificada para cada tecido e concentração e plotada (D). SSC = dispersão lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Figura 4: Análise representativa da citometria de fluxo dos subgrupos celulares em FVS adiposa, sangue e baço. (A\u2012C) Representação esquemática da estratégia de gating para identificar subgrupos celulares e células DiD+ em FVA adiposa (A), baço (B) e sangue (C). Abreviações: FSC = forward scatter; DL = vivos/mortos; L-DCs = células dendríticas linfoides; M-DCs = células dendríticas mieloides; SSC = dispersão lateral. Esta figura é adaptada de Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Controle</td>
			<td>Propósito</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Camundongo tratado com PBS ou soro fisiológico</td>
			<td>Use as células deste mouse para os seguintes controles de citometria de fluxo:</td>
		</tr><tr><td>1. Células não coradas</td>
		</tr><tr><td>2. Mancha única viva/morta</td>
		</tr><tr><td>3. Células coradas com o painel completo, mas sem fluorescência lipossomal para determinar o sinal positivo do lipossomo durante a análise</td>
		</tr><tr><td>Este/estes ratinhos/ratinhos também serão utilizados para determinar se os lipossomas têm efeitos in vivo, uma vez que terá um controlo não lipossomal na sua experiência.</td>
		</tr><tr><td>Lipossomas descarregados</td>
			<td>Se você estiver carregando um composto em seus lipossomas, uma parte do seu lote de lipossomas deve ser sintetizada sem o composto. Isso explica quaisquer efeitos in vivo dos lipossomas sozinhos.</td>
		</tr><tr><td>DiD sozinho</td>
			<td>Uma vez que o DiD também pode ser absorvido pelas membranas celulares, alocar alguns ratos para receber corante livre em uma quantidade igual à encontrada nos lipossomas ajudará a explicar qualquer coloração de membrana de fundo.</td>
		</tr><tr><td>Controles de fluorescência-menos-um (FMO)</td>
			<td>Estas são células coradas com todos os anticorpos, exceto um, em seu painel. Como #3 na caixa acima, isso ajuda a determinar o verdadeiro sinal positivo para esse anticorpo durante a análise</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Controles a serem usados neste protocolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Solução</td>
			<td>Componentes</td>
			<td>Volume aproximado necessário por lote/mouse</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Preparação de lipossomas</td>
		</tr><tr><td>Acetato de cálcio</td>
			<td>1 M de acetato de cálcio em H2O</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampão HEPES</td>
			<td>10 mM HEPES em A2O, pH 7,4</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar em HEPES</td>
			<td>em 10 mM HEPES</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Colheita, processamento e coloração de tecidos</td>
		</tr><tr><td>Solução tamponada com fosfato (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO4 em destilado H2O</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>PBS-Heparina</td>
			<td>Heparina 0,1 mM em PBS</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampão HEPES</td>
			<td>20 mM HEPES em PBS</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Tampão de digestão</td>
			<td>2 mg/mL de colagenase Tipo I em tampão HEPES</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Buffer de lise AKC</td>
			<td>0,158 M NH 3 Cl,10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA em ddH 2 O, pH7,2</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>Buffer FACS</td>
			<td>1% BSA, 0,05% NaN3 em PBS</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>Bloco Fc (diluído)</td>
			<td>Bloco Fc 1:50 no buffer FACS</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Buffer de Fixação</td>
			<td>Paraformaldeído a 2% em PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Soluções a serem preparadas.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Um</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloração extracelular (2x mistura de anticorpos)</td>
		</tr><tr><td>Antígeno</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Volume ab por teste de 100 μL</td>
			<td>Volume total necessário:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Coluna C x 1,2 x Total # amostras</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5,5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μL/teste) x (1,2) x (# amostras)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/teste) x (1,2) x (# amostras)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/teste) x (1,2) x (# amostras)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/teste) x (1,2) x (# amostras)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>etc...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Para criar sua mistura de anticorpos, combine os anticorpos calculados na coluna D com o tampão FACS ou o Brilliant Violet Staining Buffer* para um volume final de (50 μL x 1,2 x Total # amostras)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloração viva/morta (1x)</td>
		</tr><tr><td>Vivo/Morto</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Volume L/D por teste de 200 uL</td>
			<td>Volume total necessário:</td>
		</tr><tr><td>Vivo/Morto</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Coluna C x 1,2 x Total # amostras</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Coloração Intracelular (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antígeno</td>
			<td>Fluoróforo</td>
			<td>Volume Ab por teste de 50 μL</td>
			<td>Volume total necessário:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Coluna C x 1,2 x Total # amostras</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Brilliant Violet Staining Buffer deve ser usado se mais de um anticorpo conjugado a um fluoróforo Brilliant Violet estiver sendo usado em seu painel.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: Exemplo de painel de anticorpos e cálculos de misturas de coloração a serem utilizadas para coloração de fluxo.

O objetivo deste protocolo é sintetizar lipossomas fluorescentemente marcados e usar citometria de fluxo para identificar a localização in vivo de lipossomas em nível celular.

Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Nosso protocolo combina um método acessível para preparar lipossomas carregados com tesaglitazar com uma abordagem completa para avaliar a captação de lipossomas em nível celular. Essa técnica fornece um método imparcial para avaliar a captação de lipossomas marcados com fluorescência que são preparados usando baixas temperaturas e equipamentos fáceis de adquirir. Para preparar lipossomas marcados com fluorescência carregados com acetato de cálcio e tesaglitazar, primeiro use uma sonda de meia polegada para emulsionar uma solução de lípidos de clorofórmio de éter por sonicação por 30 segundos à temperatura ambiente, 20 kilohertz e 50% de potência.Transfira imediatamente a solução homogeneizada de emulsão de água e óleo para um evaporador rotativo com um adaptador especial, medidor nanométrico e válvula reguladora de pressão e conecte o evaporador a uma linha de vácuo. Para remover os solventes orgânicos, defina a taxa de rotação para 100 rotações por minuto e o vácuo para 0,5 atmosferas. Depois que um gel se forma e desaparece, aumente o vácuo para 0,9 atmosferas e filtre a dispersão aquosa do lipossomo para frente e para trás através de um filtro de policarbonato de 200 nanômetros em uma extrusora de lipossomas equipada com duas seringas à prova de gás várias vezes.Depois de verificar a distribuição de tamanho por espalhamento dinâmico de luz, use uma coluna de rotação de dois mililitros para remover qualquer tesaglitazar não aprisionado dos lipossomas e use um espectrofotômetro para determinar a concentração do medicamento aprisionado. Em seguida, adicione não mais do que 500 microlitros de amostra de lipossomas ao leito de gel de coluna seca. Para administrar os lipossomas por injeção retro-orbital, pressione suavemente a pele acima e abaixo do olho exposto para levantar o olho acima do plano da face.Em seguida, insira cuidadosamente a ponta da agulha no canto frontal do olho, certificando-se de que a agulha esteja abaixo do orbe sem tocá-lo, e injete lentamente os lipossomas no espaço retro-orbital. Para colher a amostra de sangue, no ponto final experimental apropriado, faça cuidadosamente uma incisão na pele na borda da extremidade caudal da caixa torácica do camundongo e corte uma linha reta de um centímetro em direção à cabeça do animal até que os músculos peitorais estejam expostos. No local da incisão inicial, faça dois pequenos cortes perpendiculares à linha em direção à cabeça e corte cuidadosamente o músculo peitoral de um lado da caixa torácica na área exposta para permitir melhor acesso e visualização do local de inserção da agulha.Insira a agulha entre a terceira e a quarta costelas, mantendo-a o mais próximo possível da linha central da caixa torácica e puxe suavemente a seringa para começar a coletar sangue. Quando o máximo de volume possível tiver sido coletado, transfira o sangue para um tubo de microcentrífuga contendo 10 microlitros de EDTA 0,5 molar no gelo. Para extrair a almofada pós-tecido inguinal de cada lado do camundongo, use um conjunto de pinças para segurar a membrana peritoneal no lado direito e o segundo conjunto de pinças para segurar a borda da pele acima da membrana peritoneal no outro.Afaste suavemente a pele da membrana para separar as camadas umas das outras. Prenda a borda externa da pele para acessar melhor o depósito adiposo e localize o depósito de tecido adiposo inguinal ao longo da pele. E localize o linfonodo inguinal no centro do depósito adiposo usando fórceps e tesouras para remover o linfonodo conforme necessário.Após a remoção do linfonodo, use a pinça para segurar cuidadosamente a extremidade do depósito adiposo mais próxima do ponto fixado e comece a fazer pequenos cortes na membrana conjuntiva entre o tecido adiposo e a pele. Levante o tecido adiposo da pele enquanto faz cortes para melhor acesso à membrana e coloque o depósito em um frasco de polietileno contendo tampão HEPES no gelo. Para extrair os depósitos adiposos do epidídimo da extremidade caudal da cavidade peritoneal, use uma pinça para puxar suavemente o primeiro depósito adiposo do epidídimo da extremidade dorsal do camundongo e localizar o epidídimo e o ducto deferente presos a esse depósito.Em seguida, corte cuidadosamente entre o depósito adiposo e o epidídimo e o ducto deferente para separar o tecido adiposo dos outros tecidos e coloque o depo em um frasco de polietileno com tampão HEPES no gelo. Quando todos os tecidos tiverem sido colhidos, use uma a duas tesouras para picar as amostras de tecido adiposo em fragmentos de tecido de 0,5 milímetro. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tampão de colagenase de dois miligramas por mililitro aos frascos de pedaços de tecido adiposo e coloque os frascos em uma incubadora agitada a 37 graus Celsius e 150 rotações por minuto por 30 a 45 minutos.Após 30 minutos, use uma pipeta de um mililitro para triturar as amostras várias vezes. Se os pedaços de tecido ainda forem muito grandes para facilitar a pipetagem, devolva as amostras à incubadora por mais 15 minutos. Uma vez que as amostras estejam totalmente digeridas, triture os fragmentos mais 10 vezes para garantir a criação de uma única suspensão celular e coe cada amostra através de filtros individuais de 70 micrômetros em um tubo de 50 mililitros por amostra.Enxágue cada arquivo com cinco mililitros de tampão FACS para coletar as células restantes e filtre cada lavagem no frasco apropriado de amostra de célula no gelo. Quando todas as amostras tiverem sido filtradas, recolher as células por centrifugação e aspirar o sobrenadante de adipócitos das amostras. Em seguida, aspire cuidadosamente os sobrenadantes deixando os pellets da fração vascular estromal intactos e ressuspenda os pellets em um mililitro de tampão FACS por tubo.Em seguida, transferir as suspensões para novos tubos de 1,5 ou 1,7 mililitros em gelo até à análise por citometria de fluxo por protocolos normalizados. O espalhamento dinâmico de luz revela um diâmetro médio de lipossomas de 163,2 nanômetros e um potencial zeta de menos 19,2 milivolts. A imagem de microscopia eletrônica criogênica revela lipossomas circulares com um desvio padrão relativamente pequeno obtido do diâmetro médio medido por espalhamento dinâmico de luz.A análise por citometria de fluxo de amostras de camundongos tratados com PBS pode ser usada como uma fluorescência DiD menos um controle para criar portas positivas DiD. Conforme ilustrado nesta análise representativa, uma concentração de carga de lipossomas de 10 miligramas por mililitro de DiD é muito alta, superando a faixa quantificável do citômetro em todos os três tecidos testados. Uma concentração de 0,1 miligrama por mililitro demonstra algum sinal, mas uma população clara além das células tratadas com PBS não é observada.Portanto, a concentração de um miligrama por mililitro, que demonstra uma clara distinção do controle PBS enquanto ainda pode ser lida pelo analisador, é recomendada para uso na preparação de lipossomas. Estratégias de gating ligeiramente diferentes são necessárias para cada tipo de tecido, mas a maioria dos mesmos tipos de células pode ser identificada em cada um. Uma vez identificadas populações específicas de interesse, o tamanho total de cada população celular e a frequência com que são positivas para DiD podem ser quantificados.Preparar reagentes e equipamentos e antecipar os resultados de cada etapa é crucial. Resultados inesperados no início podem arruinar resultados futuros. Métodos histológicos podem ser usados para avaliar a localização de lipossomas em todo o tecido, enquanto a citometria de fluxo de imagem pode ser usada para verificar a internalização de lipossomas por célula.

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nanopartículas de plantas virais (VNPs) são promissoras plataformas para aplicações em biomedicina. Aqui, descrevemos os procedimentos para a propagação de plantas VNP, purificação, caracterização e bioconjugação. Por fim, mostramos a aplicação de VNPs para homing tumor e de imagem usando um modelo de xenoenxerto mouse e imagens de fluorescência.

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

Este vídeo discute o ensaio de vazamento de fluorescência para estudar as interações de peptídeos que penetram nas células com as membranas celulares usando imitadores de membrana celular - grandes vesículas unilamelares, ou LUVs, encapsuladas com um corante fluorescente e um atenuador.

Ensaio de vazamento de fluorescência para estudar a interação do peptídeo que penetra nas células com a membrana

A distribuição espacial e a dinâmica temporal das proteínas e lipídios da membrana plasmática são um tema quente na biologia. Aqui, esse problema é abordado por uma análise de flutuação de imagem espaço-temporal que fornece conceitualmente as mesmas quantidades físicas de rastreamento de partícula única, mas usa pequenos rótulos moleculares e configurações de microscopia padrão.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

O uso de fluoróforos para imagens in vivo pode ser bastante limitado por opsonização, depuração rápida, baixa sensibilidade de detecção e efeitos citotóxicos no hospedeiro. O encapsulamento de fluoróforos em lipossomas por hidratação e extrusão de filme leva à extinção e proteção de fluorescência, o que permite imagens in vivo com alta sensibilidade de detecção.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para In Vivo Imageamento óptico

O acúmulo intratumoral heterogêneo de lipossomas tem sido associado a um microambiente tumoral anormal. Aqui são apresentados métodos para medir a microcirculação tumoral por imagem de perfusão e pressão elevada do fluido intersticial (IFP) usando um sistema robótico guiado por imagem. As medições são comparadas ao acúmulo intratumoral de lipossomas, determinado por meio de microtomografia computadorizada volumétrica.

Medidas espaciais de Perfusão, intersticial pressão do produto e lipossomas Acumulação em tumores sólidos

Ex vivo de imagens de órgãos todo é um método rápido para a determinação das concentrações relativas dos compostos marcados com fluorescência no interior e entre os tecidos ou os grupos de tratamento. Por outro lado, a histologia quantitativa de fluorescência, enquanto que mais trabalho intensivo, permite a quantificação dos níveis absolutos de tecido de moléculas marcadas.

O uso de Ex Vivo Imagem de órgãos inteiros e Histologia Tissue quantitativa para determinar o Bio-distribuição das moléculas fluorescente etiquetado

A má compreensão do desempenho in vivo dos nanomedicamentos impede sua tradução clínica. Procedimentos para avaliar o comportamento in vivo de nanomedicamentos contra o câncer em níveis sistêmicos, teciduais, unicelulares e subcelulares em camundongos imunocompetentes portadores de tumor são descritos aqui. Essa abordagem pode ajudar os pesquisadores a identificar nanomedicamentos promissores contra o câncer para tradução clínica.

Um método completo para avaliar o<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance of Cancer Nanomedicinas

Imagem latente da viver-pilha é uma poderosa ferramenta para visualizar processos dinâmicos. O exame das células fixos fornece apenas imagens estáticas, que podem levar a má interpretação e confusão sobre o processo. Este trabalho apresenta um método para estudar a absorção, liberação de drogas e localização intracelular de nanopartículas lipossomas em pilhas vivas.

Usando em Vitro viver-pilha de imagem para explorar Chemotherapeutics entregues por nanopartículas de lipídios-baseado

Este protocolo descreve a fabricação de lipossomas e como estes podem ser imobilizados em uma superfície e imagemindividualmente de uma forma paralela maciça usando microscopia de fluorescência. Isso permite a quantificação do tamanho e inhomogeneidade composicional entre os lipossomos únicos da população.

Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

Descrevemos protocolos para avaliar o grau de transdução por peptídeos penetrantes por células utilizando sistemas de imagem ex vivo seguidos de incorporação de parafina, secção e microscopia fluorescente confocal usando peptídeos cardíacos como exemplo. Em nosso protocolo, um único animal pode ser usado para adquirir ambos os tipos de avaliação de imagem dos mesmos órgãos, reduzindo o número de animais necessários para estudos pela metade.

In Vivo Imagem de Eficiências de Transdução de Peptídeo de Direcionamento Cardíaco

Apresentamos um protocolo para o uso de microendoscopia a laser confocal (CLM) para estudar não invasivamente a distribuição espátula-temporal de lipossomos no olho após injeção subconjunta.

Espólio-Temporal Em Vivo Imagem de Sistemas de Entrega de Drogas Oculares usando Microendoscopia a laser confocal de fibra óptica

Aprenda a preparar lipossomas marcados com corante fluorescente e avaliar sua captação celular in vivo por citometria de fluxo. Este método reprodutível utiliza temperaturas baixas e equipamento acessível para estudos de biologia celular e entrega de fármacos.

Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente

Explorar mais vídeos