Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente

Nosso protocolo combina um método acessível para preparar lipossomas carregados com tesaglitazar com uma abordagem completa para avaliar a captação de lipossomas em nível celular. Essa técnica fornece um método imparcial para avaliar a captação de lipossomas marcados com fluorescência que são preparados usando baixas temperaturas e equipamentos fáceis de adquirir. Para preparar lipossomas marcados com fluorescência carregados com acetato de cálcio e tesaglitazar, primeiro use uma sonda de meia polegada para emulsionar uma solução de lípidos de clorofórmio de éter por sonicação por 30 segundos à temperatura ambiente, 20 kilohertz e 50% de potência.

Transfira imediatamente a solução homogeneizada de emulsão de água e óleo para um evaporador rotativo com um adaptador especial, medidor nanométrico e válvula reguladora de pressão e conecte o evaporador a uma linha de vácuo. Para remover os solventes orgânicos, defina a taxa de rotação para 100 rotações por minuto e o vácuo para 0,5 atmosferas. Depois que um gel se forma e desaparece, aumente o vácuo para 0,9 atmosferas e filtre a dispersão aquosa do lipossomo para frente e para trás através de um filtro de policarbonato de 200 nanômetros em uma extrusora de lipossomas equipada com duas seringas à prova de gás várias vezes.

Depois de verificar a distribuição de tamanho por espalhamento dinâmico de luz, use uma coluna de rotação de dois mililitros para remover qualquer tesaglitazar não aprisionado dos lipossomas e use um espectrofotômetro para determinar a concentração do medicamento aprisionado. Em seguida, adicione não mais do que 500 microlitros de amostra de lipossomas ao leito de gel de coluna seca. Para administrar os lipossomas por injeção retro-orbital, pressione suavemente a pele acima e abaixo do olho exposto para levantar o olho acima do plano da face.

Em seguida, insira cuidadosamente a ponta da agulha no canto frontal do olho, certificando-se de que a agulha esteja abaixo do orbe sem tocá-lo, e injete lentamente os lipossomas no espaço retro-orbital. Para colher a amostra de sangue, no ponto final experimental apropriado, faça cuidadosamente uma incisão na pele na borda da extremidade caudal da caixa torácica do camundongo e corte uma linha reta de um centímetro em direção à cabeça do animal até que os músculos peitorais estejam expostos. No local da incisão inicial, faça dois pequenos cortes perpendiculares à linha em direção à cabeça e corte cuidadosamente o músculo peitoral de um lado da caixa torácica na área exposta para permitir melhor acesso e visualização do local de inserção da agulha.

Insira a agulha entre a terceira e a quarta costelas, mantendo-a o mais próximo possível da linha central da caixa torácica e puxe suavemente a seringa para começar a coletar sangue. Quando o máximo de volume possível tiver sido coletado, transfira o sangue para um tubo de microcentrífuga contendo 10 microlitros de EDTA 0,5 molar no gelo. Para extrair a almofada pós-tecido inguinal de cada lado do camundongo, use um conjunto de pinças para segurar a membrana peritoneal no lado direito e o segundo conjunto de pinças para segurar a borda da pele acima da membrana peritoneal no outro.

Afaste suavemente a pele da membrana para separar as camadas umas das outras. Prenda a borda externa da pele para acessar melhor o depósito adiposo e localize o depósito de tecido adiposo inguinal ao longo da pele. E localize o linfonodo inguinal no centro do depósito adiposo usando fórceps e tesouras para remover o linfonodo conforme necessário.

Após a remoção do linfonodo, use a pinça para segurar cuidadosamente a extremidade do depósito adiposo mais próxima do ponto fixado e comece a fazer pequenos cortes na membrana conjuntiva entre o tecido adiposo e a pele. Levante o tecido adiposo da pele enquanto faz cortes para melhor acesso à membrana e coloque o depósito em um frasco de polietileno contendo tampão HEPES no gelo. Para extrair os depósitos adiposos do epidídimo da extremidade caudal da cavidade peritoneal, use uma pinça para puxar suavemente o primeiro depósito adiposo do epidídimo da extremidade dorsal do camundongo e localizar o epidídimo e o ducto deferente presos a esse depósito.

Em seguida, corte cuidadosamente entre o depósito adiposo e o epidídimo e o ducto deferente para separar o tecido adiposo dos outros tecidos e coloque o depo em um frasco de polietileno com tampão HEPES no gelo. Quando todos os tecidos tiverem sido colhidos, use uma a duas tesouras para picar as amostras de tecido adiposo em fragmentos de tecido de 0,5 milímetro. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tampão de colagenase de dois miligramas por mililitro aos frascos de pedaços de tecido adiposo e coloque os frascos em uma incubadora agitada a 37 graus Celsius e 150 rotações por minuto por 30 a 45 minutos.

Após 30 minutos, use uma pipeta de um mililitro para triturar as amostras várias vezes. Se os pedaços de tecido ainda forem muito grandes para facilitar a pipetagem, devolva as amostras à incubadora por mais 15 minutos. Uma vez que as amostras estejam totalmente digeridas, triture os fragmentos mais 10 vezes para garantir a criação de uma única suspensão celular e coe cada amostra através de filtros individuais de 70 micrômetros em um tubo de 50 mililitros por amostra.

Enxágue cada arquivo com cinco mililitros de tampão FACS para coletar as células restantes e filtre cada lavagem no frasco apropriado de amostra de célula no gelo. Quando todas as amostras tiverem sido filtradas, recolher as células por centrifugação e aspirar o sobrenadante de adipócitos das amostras. Em seguida, aspire cuidadosamente os sobrenadantes deixando os pellets da fração vascular estromal intactos e ressuspenda os pellets em um mililitro de tampão FACS por tubo.

Em seguida, transferir as suspensões para novos tubos de 1,5 ou 1,7 mililitros em gelo até à análise por citometria de fluxo por protocolos normalizados. O espalhamento dinâmico de luz revela um diâmetro médio de lipossomas de 163,2 nanômetros e um potencial zeta de menos 19,2 milivolts. A imagem de microscopia eletrônica criogênica revela lipossomas circulares com um desvio padrão relativamente pequeno obtido do diâmetro médio medido por espalhamento dinâmico de luz.

A análise por citometria de fluxo de amostras de camundongos tratados com PBS pode ser usada como uma fluorescência DiD menos um controle para criar portas positivas DiD. Conforme ilustrado nesta análise representativa, uma concentração de carga de lipossomas de 10 miligramas por mililitro de DiD é muito alta, superando a faixa quantificável do citômetro em todos os três tecidos testados. Uma concentração de 0,1 miligrama por mililitro demonstra algum sinal, mas uma população clara além das células tratadas com PBS não é observada.

Portanto, a concentração de um miligrama por mililitro, que demonstra uma clara distinção do controle PBS enquanto ainda pode ser lida pelo analisador, é recomendada para uso na preparação de lipossomas. Estratégias de gating ligeiramente diferentes são necessárias para cada tipo de tecido, mas a maioria dos mesmos tipos de células pode ser identificada em cada um. Uma vez identificadas populações específicas de interesse, o tamanho total de cada população celular e a frequência com que são positivas para DiD podem ser quantificados.

Preparar reagentes e equipamentos e antecipar os resultados de cada etapa é crucial. Resultados inesperados no início podem arruinar resultados futuros. Métodos histológicos podem ser usados para avaliar a localização de lipossomas em todo o tecido, enquanto a citometria de fluxo de imagem pode ser usada para verificar a internalização de lipossomas por célula.