Construindo Mutantes na Cepa 519/43 do Streptococcus pneumoniae do Serotipo 1
11 de setembro de 2020
Aqui, descrevemos uma cepa 519/43 do sorotipo 1 de S. pneumoniae que pode ser geneticamente modificada usando sua capacidade de adquirir naturalmente DNA e um plasmídeo suicida. Como prova de princípio, um mutante isogênico no gene da pneumolisina (plys) foi feito.
Este protocolo é significativo porque permite a modificação genética de um sorotipo anteriormente não tratável, possibilitando a pesquisa e a compreensão do sorotipo. Isso abre caminhos para o trabalho biológico, como o desenvolvimento de vacinas. Demonstrando o procedimento estará Vanessa S.Terra, professora assistente da Escola de Higiene e Medicina Tropical de Londres.
Para começar, gere o plasmídeo pSD1 realizando uma ligação seguindo as instruções do fabricante do pGEM-T Easy System I. Incube a reação durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transforme E.coli Dh5-alfa quimicamente competente com pSD1, incubando 50 microlitros das células com três microlitros de reação de ligação pSD1 por 15 minutos no gelo, depois exponha as células ao choque térmico e coloque as células no gelo por dois minutos.
Remova as células do gelo e adicione 350 microlitros de meio SOC e incube a cultura por duas horas a 37 graus Celsius e 120 RPM. Placa a transformação em ágar Luria-Bertani suplementado com IPTG 0,4 milimolar, 0,24 miligramas por mililitro X-Gal para seleção azul-branca e 100 microgramas por mililitro de ampicilina para garantir que todas as colônias que crescem na placa tenham a espinha dorsal do plasmídeo. Escolha três colônias brancas que contenham pSD1 e estabeleça crescimentos noturnos em 10 mililitros de L-B suplementados com 100 microgramas por mililitro de ampicilina.
Incube as culturas durante a noite a 37 graus Celsius com agitação. No dia seguinte, centrifugar as culturas a 3 082 G e utilizar o sedimento para a extracção do plasmídeo. Depois de extrair o DNA do plasmídeo, configure uma digestão de restrição BamH1 para o plasmídeo pSD1 e o de espectinomicina.
Incube as reações de digestão de restrição e controles a 37 graus Celsius por três horas. Quando a restrição terminar, analise os produtos por eletroforese, excise a banda correta e purifique-a usando um kit comercial. Em seguida, execute uma reação de ligação usando o pSD1 digerido por BamH1 e a espectinomicina.
Isso gerará o plasmídeo pSD2. Transforme o pSD2 em E.coli DH5-alfa quimicamente competente, conforme descrito anteriormente. Em seguida, selecione os transformantes que transportam o plasmídeo pSD2 com base em sua capacidade de crescer em LBA suplementado com 100 microgramas por mililitro de espectinomicina e ampicilina e extraia o DNA do plasmídeo.
Prepare uma cultura noturna de S.pneumoniae 519/43 em BHI e deixe-a crescer estaticamente a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, diluir as culturas 1:50 e 1:100 em 10 mililitros de caldo BHI fresco. Incube a cultura estaticamente a 37 graus Celsius até que o OD a 595 nanômetros esteja entre 0,05 e 0,1.
Assim que o OD apropriado for atingido, pegue 860 microlitros de cultura e transfira-os para um tubo de microcentrífuga. Adicione 100 microlitros de hidróxido de sódio 100 milimolares, 10 microlitros de 20% BSA, 10 microlitros de cloreto de cálcio 100 milimolares, dois microlitros de 50 nanogramas por mililitro CSP1 e 500 nanogramas de pSD2. Incube a reação estaticamente a 37 graus Celsius por três horas.
Em seguida, coloque 330 microlitros em placas de ágar sangue a 5% suplementadas com 100 microgramas por mililitro de espectinomicina a cada hora durante um período de incubação de três horas. Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Colocar colônias resistentes à espectinomicina em outra placa de ágar sangue suplementada com 100 microgramas por mililitro de espectinomicina e em placas de ágar sangue suplementadas com 100 microgramas por mililitro de ampicilina, que testa a presença da estrutura do plasmídeo.
Incube os dois conjuntos de placas durante a noite. A montagem correta de pSD2 foi confirmada por digestão por restrição. O pSD2 foi então usado para transformar 519,43 células do tipo selvagem.
As colônias que cresceram em espectinomicina após uma incubação noturna foram consideradas transformantes positivas. A confirmação fenotípica da mutação da pneumolisina foi realizada avaliando a atividade hemolítica para D39, 519/43 tipo selvagem e 519/43 mutante delta ply. Isso foi comparado à hemólise de glóbulos vermelhos por 0,5% de saponina, que é considerada 100% O mutante perdeu sua capacidade de lisar glóbulos vermelhos.
Todas as colônias positivas foram confirmadas por sequenciamento para avaliar a localização da inserção. Foram utilizados primers com sítios de ligação fora da região de homologia. Ao realizar a reação de transformação, é importante adicionar os reagentes na ordem correta.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para modificar geneticamente uma cepa do sorotipo 1 de S. pneumoniae, 519/43, utilizando sua capacidade natural de adquirir DNA. O estudo demonstra a criação de um mutante isogênico no gene da pneumolisina (ply), abrindo caminho para pesquisas futuras.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Engenharia Genética
- Pesquisa com Patógenos
Antecedentes
- Streptococcus pneumoniae é um patógeno humano significativo.
- A modificação genética deste sorotipo tem sido desafiadora.
- Compreender sua genética pode auxiliar no desenvolvimento de vacinas.
- Este estudo apresenta uma abordagem inovadora para manipulação genética.
Objetivo do Estudo
- Permitir a modificação genética do sorotipo 1 de S. pneumoniae.
- Criar uma linhagem mutante para fins de pesquisa.
- Facilitar estudos sobre a pneumolisina e seu papel na patogênese.
Métodos Utilizados
- Geração do plasmídeo pSD1 utilizando o Sistema pGEM-T Easy I.
- Transformação de E. coli Dh5-alpha com a reação de ligação.
- Procedimentos de incubação e choque térmico para células competentes.
- Verificação das modificações genéticas por meio de técnicas moleculares padrão.
Resultados Principais
- Criação bem-sucedida de um mutante isogênico no gene ply.
- Demonstração da eficácia do protocolo para modificação genética.
- Implicações potenciais para pesquisa e desenvolvimento de vacinas.
- Estabelecimento de um novo modelo para o estudo de S. pneumoniae.
Conclusões
- O método permite a manipulação genética de um sorotipo previamente difícil.
- Isso abre novas possibilidades para a pesquisa biológica.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para o desenvolvimento de vacinas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A modificação genética do sorotipo 1 de Streptococcus pneumoniae tem sido uma barreira duradoura na pesquisa de doenças infecciosas, particularmente para a validação de vacinas e alvos terapêuticos em regiões de alta carga. Este protocolo viabiliza a genômica funcional em uma linhagem clinicamente relevante, apoiando a desmistificação mecanicista de fatores de virulência como a pneumolisina. Ao estabelecer um sistema confiável de mutagênese, melhora-se a confiança preditiva na seleção de alvos e acelera-se os fluxos de avaliação pré-clínica.
Aplicações Estratégicas na P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da construção de mutantes isogênicos em um sorotipo clinicamente relevante.
- Valor Operacional: Fornece um sistema reprodutível para a validação funcional de genes de virulência, como o ply.
- Valor Estratégico: Apoia a redução de riscos de alvos ao associar genótipo a fenótipo em modelos de infecção.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera linhagens mutantes definidas para ensaios fenotípicos padronizados, incluindo hemólise e modelos de infecção.
- Valor Operacional: Estabelece um fluxo de trabalho para gerar controles isogênicos essenciais para a reprodutibilidade de ensaios.
- Valor Estratégico: Permite triagem em larga escala de variantes genéticas utilizando marcadores selecionáveis e contra-seleção.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a correlação fenótipo-genótipo in vivo utilizando modelos de desafio intraperitoneal e intranasal.
- Valor Operacional: Produz estoques de mutantes validados para testes de eficácia e segurança posteriores.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir ao revelar mecanismos patogênicos específicos de sorotipos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase de biologia de descoberta, permitindo a validação do alvo por meio de manipulação genética antes dos esforços de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a eliminação direcionada de genes com base em hipóteses para esclarecer o envolvimento de vias na patogênese.
- Triagem: Gera painéis de mutantes isogênicos para triagem fenotípica comparativa em modelos celulares e animais.
- Análises: Permite a medição quantitativa de variáveis dependentes, como atividade hemolítica e carga bacteriana em tecidos.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas moleculares a resultados pré-clínicos por meio da comparação de fenótipos de infecção entre sorotipos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma para mutagênese serial aplicável a outros antígenos candidatos a vacinas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao reduzir a ambiguidade mecanicista na patogênese específica de sorotipos.
- Valor Operacional: Oferece um método padronizado e reprodutível para gerar mutantes genéticos definidos em S. pneumoniae.
- Valor Estratégico: Melhora a priorização da carteira ao permitir a avaliação precoce da essencialidade do alvo e da sua contribuição para a virulência.
- Impacto na Carteira: Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer dados funcionais sobre fatores de virulência antes de investimentos pré-clínicos onerosos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em clonagem molecular, transformação bacteriana e técnicas de troca alélica.
- Depende do acesso a sistemas de eletroporação ou transformação química para E. coli e S. pneumoniae.
- Necessita de protocolos padronizados para preparação de DNA, digestão com enzimas de restrição e ligação, a fim de garantir a integridade do plasmídeo.
- Requer contenção em nível biosseguro 2 para o manuseio de cepas patogênicas de S. pneumoniae.
- O sucesso depende da otimização das condições indutoras de competência, incluindo a concentração de CSP1 e os níveis de cloreto de cálcio.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Generation of Plasmid pSD1 and Chemical Transformation of E. coli Dh5α
2:03
Plasmid DNA Extraction, Restriction Digestion of pSD1 and Spectinomycin Gene, and Assembly of pSD2
3:03
Transformation of S. pneumoniae Strain 519/43
4:46
Results: Confirmation of Mutagenesis
5:43
Conclusion
