Construindo Mutantes na Cepa 519/43 do Streptococcus pneumoniae do Serotipo 1

Este protocolo é significativo porque permite a modificação genética de um sorotipo anteriormente não tratável, possibilitando a pesquisa e a compreensão do sorotipo. Isso abre caminhos para o trabalho biológico, como o desenvolvimento de vacinas. Demonstrando o procedimento estará Vanessa S.Terra, professora assistente da Escola de Higiene e Medicina Tropical de Londres.

Para começar, gere o plasmídeo pSD1 realizando uma ligação seguindo as instruções do fabricante do pGEM-T Easy System I. Incube a reação durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transforme E.coli Dh5-alfa quimicamente competente com pSD1, incubando 50 microlitros das células com três microlitros de reação de ligação pSD1 por 15 minutos no gelo, depois exponha as células ao choque térmico e coloque as células no gelo por dois minutos.

Remova as células do gelo e adicione 350 microlitros de meio SOC e incube a cultura por duas horas a 37 graus Celsius e 120 RPM. Placa a transformação em ágar Luria-Bertani suplementado com IPTG 0,4 milimolar, 0,24 miligramas por mililitro X-Gal para seleção azul-branca e 100 microgramas por mililitro de ampicilina para garantir que todas as colônias que crescem na placa tenham a espinha dorsal do plasmídeo. Escolha três colônias brancas que contenham pSD1 e estabeleça crescimentos noturnos em 10 mililitros de L-B suplementados com 100 microgramas por mililitro de ampicilina.

Incube as culturas durante a noite a 37 graus Celsius com agitação. No dia seguinte, centrifugar as culturas a 3 082 G e utilizar o sedimento para a extracção do plasmídeo. Depois de extrair o DNA do plasmídeo, configure uma digestão de restrição BamH1 para o plasmídeo pSD1 e o de espectinomicina.

Incube as reações de digestão de restrição e controles a 37 graus Celsius por três horas. Quando a restrição terminar, analise os produtos por eletroforese, excise a banda correta e purifique-a usando um kit comercial. Em seguida, execute uma reação de ligação usando o pSD1 digerido por BamH1 e a espectinomicina.

Isso gerará o plasmídeo pSD2. Transforme o pSD2 em E.coli DH5-alfa quimicamente competente, conforme descrito anteriormente. Em seguida, selecione os transformantes que transportam o plasmídeo pSD2 com base em sua capacidade de crescer em LBA suplementado com 100 microgramas por mililitro de espectinomicina e ampicilina e extraia o DNA do plasmídeo.

Prepare uma cultura noturna de S.pneumoniae 519/43 em BHI e deixe-a crescer estaticamente a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, diluir as culturas 1:50 e 1:100 em 10 mililitros de caldo BHI fresco. Incube a cultura estaticamente a 37 graus Celsius até que o OD a 595 nanômetros esteja entre 0,05 e 0,1.

Assim que o OD apropriado for atingido, pegue 860 microlitros de cultura e transfira-os para um tubo de microcentrífuga. Adicione 100 microlitros de hidróxido de sódio 100 milimolares, 10 microlitros de 20% BSA, 10 microlitros de cloreto de cálcio 100 milimolares, dois microlitros de 50 nanogramas por mililitro CSP1 e 500 nanogramas de pSD2. Incube a reação estaticamente a 37 graus Celsius por três horas.

Em seguida, coloque 330 microlitros em placas de ágar sangue a 5% suplementadas com 100 microgramas por mililitro de espectinomicina a cada hora durante um período de incubação de três horas. Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Colocar colônias resistentes à espectinomicina em outra placa de ágar sangue suplementada com 100 microgramas por mililitro de espectinomicina e em placas de ágar sangue suplementadas com 100 microgramas por mililitro de ampicilina, que testa a presença da estrutura do plasmídeo.

Incube os dois conjuntos de placas durante a noite. A montagem correta de pSD2 foi confirmada por digestão por restrição. O pSD2 foi então usado para transformar 519,43 células do tipo selvagem.

As colônias que cresceram em espectinomicina após uma incubação noturna foram consideradas transformantes positivas. A confirmação fenotípica da mutação da pneumolisina foi realizada avaliando a atividade hemolítica para D39, 519/43 tipo selvagem e 519/43 mutante delta ply. Isso foi comparado à hemólise de glóbulos vermelhos por 0,5% de saponina, que é considerada 100% O mutante perdeu sua capacidade de lisar glóbulos vermelhos.

Todas as colônias positivas foram confirmadas por sequenciamento para avaliar a localização da inserção. Foram utilizados primers com sítios de ligação fora da região de homologia. Ao realizar a reação de transformação, é importante adicionar os reagentes na ordem correta.