Name: Triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprenda a realizar triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana. Este protocolo adaptável utiliza culturas de microarranjos e ensaios com antibióticos para identificar condições que impactam a persistência.

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Gostaríamos de agradecer aos membros do Laboratório Orman por suas valiosas contribuições durante este estudo. Este estudo foi financiado pelo prêmio nih/NIAID K22AI125468 de transição de carreira e uma bolsa de startup da Universidade de Houston.

1. Preparação de estoques médios de crescimento, solução de deloxacina e estoques de células E. coli
<ol><li>Meio regular luria-bertani (LB): Adicione 10 g/L de triptona, 10 g/L de cloreto de sódio (NaCl) e 5 g/L de extrato de levedura em água desionizada (DI). Esterilize o meio autoclavando.</li>
	<li>Placas de ágar LB: Adicione 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCl, 5 g/L de extrato de levedura e 15 g/L de ágar em água DI e esterilize o meio por autoclavagem. Na temperatura desejada (~55 °C), despeje ~30 mL de ágar médio em placas quadradas (10 x 10 cm). Seque as placas e armazene a 4 °C.</li>
	<li>Meio LB modificado: Adicione 10 g/L de triptona e 5 g/L de extrato de levedura em água DI. Esterilize o meio autoclavando.</li>
	<li>Meio LB modificado incluindo um osmólise: Misture 2x meio LB modificado com uma solução de osmólitos de 2x em volumes iguais. Para preparar 2x médio LB modificado, adicione 20 g/L de triptona e 10 g/L de extrato de levedura em água DI e esterilize por autoclavagem. Para preparar a solução de osmólise 2x, dissolva o osmólise de interesse (quantidade 2x) em água DI e, em seguida, o filtro esterilize a solução. NOTA: O osmólito de interesse e suas concentrações pode ser determinado a partir dos ensaios de triagem de Microarray do Fenótipo (ver Protocolo 4). No entanto, o osmólito testado e a concentração 2x associada podem ser ajustados dependendo da natureza da pesquisa. Por exemplo, para estudar o impacto do cloreto de sódio de 1 mM, uma solução de osmólito 2x seria uma solução de cloreto de sódio de 2 mM.</li>
	<li>Solução de estoque de ofloxacina (5 mg/mL): Adicione 5 mg de sal de ofloxacina (OFX) em 1 mL de água DI. Adicione 10 μL de hidróxido de sódio de 10 M para aumentar a solubilidade do OFX na água e, em seguida, o filtro esterilizar a solução. Prepare as alíquotas e armazene a -20 °C. NOTA: A ofloxacina é um antibiótico de quinolone que tem sido amplamente utilizado para células bacterianas em crescimento e não crescimento14,21. A concentração inibitória mínima (MIC) de OFX para células E. coli MG1655 está dentro da faixa de 0,039-0,078 μg/mL19,20. Observe também que outros antibióticos como ampicillina e kanamicina são comumente usados em pesquisas per persister. A escolha dos antibióticos depende da natureza do estudo.</li>
	<li>
E. coli Estoques de células MG1655: Inoculam 2 mL de meio LB normal com uma única colônia em um tubo de ensaio de 14 mL (snap-capped) e cultural as células em um agitador orbital a 250 rpm e 37 °C. Quando as células chegarem à fase estacionária, misture 500 μL da cultura celular com 500 μL de 50% de glicerol (estéril) em um frasco criogênico e armazene a -80 °C.</li>
</ol>2. Propagação de células para eliminar persisters pré-existentes
<ol><li>Para preparar uma cultura durante a noite, raspe uma pequena quantidade de células de um estoque de células congeladas com uma ponta de pipeta estéril (não descongele o estoque de células glicerol), e inocular as células em 2 mL de meio LB modificado em um tubo de ensaio com tampa de snap de 14 mL. Cultue as células em um agitador orbital a 250 rpm e 37 °C por 12 h.</li>
	<li>Primeira propagação<ol>
<li>Após 12 h, transfira 250 μL de cultura durante a noite para 25 mL de meio LB modificado fresco em um frasco de 250 mL perplexo coberto com uma folha de alumínio estéril.</li>
		<li>Cresça a cultura celular em um agitador orbital a 250 rpm e 37 °C até que as células atinjam a fase exponencial média (OD600 = 0,5).</li>
		<li>Meça a densidade óptica em 600 nm (OD600) usando um leitor de microplacas a cada 30 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segunda propagação<ol>
<li>Em OD600 = 0,5, dilui 250 μL de cultura celular do primeiro frasco em 25 mL de meio LB modificado fresco em um frasco de 250 mL perplexo.</li>
		<li>Cresça a segunda cultura celular em um agitador orbital a 250 rpm e 37 °C até OD600=0,5.</li>
		<li>Meça a densidade óptica a cada 30 minutos. NOTA: Uma cultura noturna pode ter uma quantidade significativa de células persistência4,5,22. O método de ciclo de diluição/crescimento5 descrito acima pode ser usado para eliminar esses persistências pré-existentes antes de transferir as células para microarrays. Sua eliminação pode ser validada quantificando níveis persistência de culturas noturnas com o ensaio descrito no Protocolo 3. Este método já foi validado em um estudo anterior19.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Validando a eliminação de células persisteres pré-existentes
<ol><li>Após a segunda propagação (ver passo 2.3), diluir 250 μL da cultura celular (OD600 = 0,5) em 25 mL de meio LB modificado fresco em um frasco de 250 mL perplexo. NOTA: Para controles, diluir 250 μL de cultura durante a noite (ver passo 2.1) em 25 mL de meio LB modificado fresco em um frasco de 250 mL perplexo. Antes de transferir as células para o frasco, a densidade celular da cultura overnight deve ser ajustada em meio LB modificado fresco para obter OD600 = 0,5.</li>
	<li>Adicione 25 μL de solução de estoque OFX (5 mg/mL) na suspensão celular e agite o frasco suavemente para tornar a cultura do ensaio homogênea. A concentração final de OFX é de 5 μg/mL na cultura de ensaio.</li>
	<li>Incubar a cultura do ensaio em um agitador orbital a 250 rpm e 37 °C.</li>
	<li>A cada hora durante o tratamento (incluindo 0h, o ponto de tempo antes de adicionar OFX na cultura de ensaio), transfira 1 mL da cultura de ensaio do frasco para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar a cultura de ensaio no tubo de microcentrifuuge a 17.000 x g por 3 min.</li>
	<li>Remova cuidadosamente 950 μL do supernatante sem perturbar a pelota celular.</li>
	<li>Adicione 950 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) no tubo de microcentrifuuge.</li>
	<li>Repita as etapas de lavagem 3,5-3,7 por 3x no total até que a concentração de antibióticos esteja abaixo da concentração inibitória mínima (MIC).</li>
	<li>Após a lavagem final, resuspenja a pelota celular em 100 μL de solução PBS, resultando em uma amostra concentrada de 10x.</li>
	<li>Tome 10 μL da suspensão da célula e dilua-se seis vezes em 90 μL de solução PBS usando uma placa inferior bem redonda de 96.</li>
	<li>Local 10 μL de suspensões de células diluídas em placas de ágar frescas sem antibióticos. Para aumentar o limite de detecção, aplaque os 90 μL restantes de suspensão celular em uma placa de ágar fresca.</li>
	<li>Incubar as placas de ágar a 37 °C por 16 h e, em seguida, contar as unidades formadoras de colônias (UFC). Conta as taxas de diluição enquanto calcula o número total de UFC em 1 mL de cultura de ensaio. As curvas de morte são geradas pelo plotagem dos valores da UFC logarítmica em relação à duração do tratamento com antibióticos. NOTA: Um tratamento OFX de 6 h é suficiente para obter uma curva de morte bifásica para células E. coli 19,20. O nível persistente de células propagadas (medida pela CFU em 6h) deve ser significativamente menor do que o da cultura da noite para o dia. Os procedimentos descritos nos Protocolos 2 e 3 podem ser realizados com LB regular, dependendo do desenho da pesquisa.</li>
</ol>4. Triagens de placas de microarray 
<ol><li>Preparando culturas de microarray-cell<ol>
<li>Transfira 250 μL de células de fase exponencial para 25 mL de meio LB modificado fresco em um tubo de centrífuga de 50 mL. Misture suavemente a suspensão da célula para torná-la homogênea. NOTA: As células de fase exponencial (OD600 = 0,5) são obtidas a partir da segunda etapa de propagação (ver passo 2.3).</li>
		<li>Transfira a suspensão da célula diluída para um reservatório estéril de 50 mL.</li>
		<li>Utilizando uma pipeta multicanal, transfira 150 μL da suspensão celular para cada poço de microarray, ou seja, uma placa de 96 poços contendo vários osmólises. NOTA: Poços que não possuem osmólises servem como controles.</li>
		<li>Cubra a microarray com uma membrana de vedação permeável a gás.</li>
		<li>Incubar a placa em um agitador orbital a 37 °C e 250 rpm por 24 h. NOTA: Nestes experimentos, foram utilizadas placas comercialmente disponíveis, como Phenotype Microarrays (PM-9 e PM-10) que incluem uma ampla gama de osmólises, tampões de pH e outros produtos químicos em estado seco em várias concentrações. Essas microarrays estão em formatos de placas de meia área 96. Os volumes de cultura devem ser ajustados dependendo do tipo de placas que estão sendo utilizadas. Microarrays também podem ser gerados manualmente (veja abaixo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação manual de placas de microarray<ol>
<li>Transfira 75 μL de soluções de osmólise 2x para os poços de uma placa de meio-campo 96.</li>
		<li>Transfira 500 μL de células de fase exponencial para 25 mL de meio LB modificado de 2x em um tubo centrífuga de 50 mL. Misture suavemente a suspensão da célula para torná-la homogênea. NOTA: A taxa de inoculação foi ajustada para ser consistente com o protocolo de triagem de microarray descrito em 4.1.</li>
		<li>Adicione 75 μL da suspensão da célula em cada poço da placa de meio-campo 96 bem contendo soluções de osmólito 2x.</li>
		<li>Incubar a placa em um agitador orbital a 37 °C e 250 rpm por 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparando placas de ensaio de periáscrito<ol>
<li>Prepare 25 mL de meio LB modificado contendo 5 μg/mL de OFX em um tubo de centrífuga de 50 mL e transfira este meio para um reservatório estéril.</li>
		<li>Transfira 190 μL de meio LB modificado com OFX do reservatório para cada poço de uma placa de poço de fundo plano genérico 96 (placa de ensaio persistente) usando uma pipeta multicanal.</li>
		<li>Remova a microarray do agitador (após a colheita por 24 h) e transfira 10 μL de culturas celulares da microarray para os poços da placa de ensaio persister, contendo meio LB modificado com OFX.</li>
		<li>Pegue 10 μL de suspensões celulares da placa de ensaio periculoso e dilua-se em série três vezes em 290 μL de solução PBS usando uma placa de poço de fundo redondo 96 e uma pipeta multicanal.</li>
		<li>Após a diluição seriada, local 10 μL de todas as suspensões celulares diluídas em série em placas de ágar fresco sem antibióticos usando uma pipeta multicanal.</li>
		<li>Incubar a placa de ensaio persister (preparada na etapa 4.3.3) em um agitador orbital a 37 °C e 250 rpm por 6h depois de cobrir a placa com uma membrana de vedação permeável a gás.</li>
		<li>Após a incubação de 6 h em um agitador, retire a placa de ensaio persister e repita os passos 4.3.4-4.3.5.</li>
		<li>Incubar as placas de ágar por 16 h a 37 °C e, em seguida, contar CFUs. Os níveis de UFC antes e 6 h após o tratamento antibiótico permitem calcular a fração persistência em cada poço. A CFU conta antes do tratamento OFX também ajudar a avaliar os efeitos dos osmólises e na viabilidade de E. coli.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Validação das condições identificadas
<ol><li>Transfira 250 μL das células de fase exponencial da Etapa 2.3 para 25 mL de meio LB modificado fresco contendo o osmólise identificado a partir da triagem de microarray (ver Protocolo 4).</li>
	<li>Incubar o frasco em um agitador orbital a 250 rpm e 37 °C por 24 h.</li>
	<li>Após 24 h, remova o frasco do agitador e transfira 250 μL da cultura celular para 25 mL de meio LB modificado fresco em um frasco de 250 mL perplexo.</li>
	<li>Adicione 25 μL de solução de estoque OFX (5 mg/mL) na suspensão celular e agite o frasco suavemente para tornar a cultura do ensaio homogênea. Incubar o frasco em um shaker a 37 °C e 250 rpm.</li>
	<li>A cada hora durante o tratamento, transfira 1 mL da cultura de ensaio do frasco para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar a cultura de ensaio no tubo de microcentrifuuge a 17.000 x g por 3 min.</li>
	<li>Remova 950 μL de supernascente e adicione 950 μL de PBS.</li>
	<li>Repita as etapas de lavagem 5.6 e 5.7 para 3x.</li>
	<li>Após a lavagem final, resuspenja a pelota de célula em 100 μL de solução PBS.</li>
	<li>Tome 10 μL da suspensão da célula e diluir em 6x em 90 μL de solução PBS usando uma placa inferior bem redonda de 96.</li>
	<li>Local 10 μL das suspensões celulares diluídas em uma placa de ágar fresca sem antibióticos. Para aumentar o limite de detecção, aplaque os 90 μL restantes de suspensão celular em uma placa de ágar fresca.</li>
	<li>Incubar a placa de ágar a 37 °C por 16 h e, em seguida, contar CFUs.</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O alto ensaio de persistência de rendimento descrito aqui foi desenvolvido para elucidar os efeitos de vários produtos químicos na persistência de E. coli. Além das placas comerciais da PM, as microarrays podem ser construídas manualmente conforme descrito na etapa 4.2. Além disso, o protocolo aqui apresentado é flexível e pode ser usado para tela de outras microarrays, como painéis de drogas e bibliotecas celulares, que estão em 96 formatos de placas de poço. As condições experimentais, incluindo a fase de cres...

Culturas bacterianas contêm uma pequena subpopulação de células persisteras que são temporariamente tolerantes a níveis extraordinariamente altos de antibióticos. As células persisteras são geneticamente idênticas aos seus parentes sensíveis a antibióticos, e sua sobrevivência tem sido atribuída à inibição transitória do crescimento1. Células persisteres foram descobertas pela primeira vez por Gladys Hobby2, mas o termo foi usado pela primeira vez por Joseph Bigger quando ele as identificou nas culturas Staphylococcus pyogenes tratadas com penicilina3. Um estudo seminal publicado por Balaban et al.4 descobriu dois tipos de persistência: variantes tipo I que são formadas principalmente por passagem através da fase estacionária, e variantes tipo II que são geradas continuamente durante o crescimento exponencial. Persisters são detectados por ensaios de sobrevivência clonogênico, nos quais amostras de cultura são colhidas em vários intervalos durante tratamentos com antibióticos, lavadas e banhadas em um meio de crescimento típico para contar as células sobreviventes que podem colonizar na ausência de antibióticos. A existência de persisters em uma cultura celular é avaliada por uma curva de morte bifásica4,5 onde a decadência exponencial inicial indica a morte de células sensíveis a antibióticos. No entanto, a tendência de morte diminui com o tempo, eventualmente levando a uma região platô que representa as células persisteres sobreviventes.
As células persisteres têm sido associadas a várias doenças como tuberculose6,fibrose cística7,candidíase8 e infecções do trato urinário9. Quase todos os microrganismos testados até agora foram encontrados para gerar fenótipos persisteres, incluindo mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 e Candida albicans8. Estudos recentes também fornecem evidências do surgimento de mutantes multidroga resistentes a subpopulaçõespersistentes 11,12. Esforços substanciais neste campo revelaram que os mecanismos de persistência são altamente complexos e diversos; tanto fatores estocásticos quanto determinísticos associados à resposta SOS13,14, espécies reativas de oxigênio (ROS)15,sistemas toxina/antitoxina (TA)16,autofagia ou auto-digestão17 e resposta rigorosa relacionada ao PPGPP18 são conhecidos por facilitar a formação de persister.
Apesar dos progressos significativos na compreensão do fenótipo persistência, os efeitos dos osmólises sobre a persistência bacteriana não foram totalmente compreendidos. Uma vez que a manutenção da pressão osmótica ideal é uma necessidade para o crescimento das células, o bom funcionamento e a sobrevivência, um estudo aprofundado dos osmólises poderia levar a potenciais alvos para estratégias anti-persistência. Embora a triagem laboriosa e de alto rendimento seja uma abordagem muito eficaz para identificar metabólitos e outros produtos químicos que desempenham um papel crucial no fenótipo de persistência19,20. Neste trabalho, discutiremos nosso método publicado19, onde usamos microarrays, ou seja, 96 placas de poço contendo vários osmólises (por exemplo, cloreto de sódio, ureia, nitrito de sódio, nitrato de sódio, cloreto de potássio), para identificar osmólitos que influenciam significativamente a persistência de E. coli.

<table><tbody><tr><td>Tubo de ensaio de 14 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>E. coli estirpe MG1655</td><td>Universidade</td><td></td> de Princeton <td>Obtido do laboratório de Brynildsen</td></tr><tr><td>Placa de fundo plano de 96 poços</td><td>USA Scientific</td><td>5665-5161</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de vedação permeável a gás</td><td>VWR</td><td>102097-058</td><td>Esterilizada por irradiação gama e isenta de citotoxinas</td></tr><tr><td>Meia área placa de fundo plano de 96 poços</td><td>VWR</td><td>82050-062</td><td></td></tr><tr><td>LB ágar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td>Genética molecular grau</td></tr><tr><td>Ofloxacina sal</td><td>VWR</td><td>103466-232</td><td>HPLC &ge; 97.5</td></tr><tr><td>Microarray de fenótipo (PM-9 e PM-10)</td><td>Biolog</td><td>N/A</td><td>As placas PM-9 e PM-10 continham vários osmólitos e tampões, respectivamente</td></tr><tr><td>Placa de fundo redondo de 96 poços</td><td>USA Scientific</td><td>5665-0161</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Certificado ACS grau</td></tr><tr><td>de nitrato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424345000</td><td>grau de reagente ACS</td></tr><tr><td>Nitrito de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA186680B</td><td>98% de pureza</td></tr><tr><td>Placa de Petri quadrada</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td>Grau de genética molecular</td></tr><tr><td>Varioskan lux leitor de microplacas multimodo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00D0</td><td>Usado para medição de densidade óptica a 600 nm</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-100</td><td>Grau de genética molecular</td></tr></tbody></table>

triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Persisters bacterianos são definidos como uma pequena subpopulação de variantes fenotípicas com a capacidade de tolerar altas concentrações de antibióticos. São uma importante preocupação para a saúde, pois têm sido associadas a infecções crônicas recorrentes. Embora a dinâmica estocástica e determinística dos mecanismos relacionados ao estresse seja conhecida por desempenhar um papel significativo na persistência, os mecanismos subjacentes à mudança fenotípica para/do estado de persistência não são completamente compreendidos. Embora os fatores de persistência desencadeados por sinais ambientais (por exemplo, esgotamento das fontes de carbono, nitrogênio e oxigênio) tenham sido extensivamente estudados, os impactos dos osmólises sobre a persistência ainda estão para ser determinados. Usando microarrays (ou seja, 96 placas de poço contendo vários produtos químicos), projetamos uma abordagem para elucidar os efeitos de vários osmólises na persistência de Escherichia coli de forma de alto rendimento. Essa abordagem é transformadora, pois pode ser prontamente adaptada para outras matrizes de triagem, como painéis de drogas e bibliotecas de genes knockout.

A Figura 1 descreve nosso protocolo experimental. Os experimentos do ciclo de diluição/crescimento (ver Protocolo 2) foram adaptados de um estudo conduzido por Keren et al.5 para eliminar os persisters originários das culturas noturnas. Figura 2A é uma imagem representativa das placas de ágar usadas para determinar os níveis de CFU de culturas celulares antes e depois do tratamento OFX. Nesses experimentos, as células foram cultivadas em ...

Neste artigo de método, apresentamos uma estratégia de triagem de alto rendimento para identificar compostos químicos, como osmolitos, que têm um impacto significativo na persistência bacteriana.

Triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

O protocolo aqui descrito permite identificar condições que podem impactar significativamente a persistência bacteriana de forma de alto rendimento. Este método é prontamente adaptável à tela para várias áreas, como painéis de drogas, bibliotecas genéticas e muito mais. Como o método inclui várias sub etapas, que devem ser conduzidas simultaneamente, a demonstração visual pode ajudar os pesquisadores a gerenciar seu tempo para obter resultados precisos.Comece preparando culturas de células de microarray. Transfira 250 microliters de células de fase exponencial para 25 mililitros de meio LB modificado fresco em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, misture suavemente a suspensão da célula para torná-la homogênea.Transfira a suspensão da célula diluída para um reservatório estéril de 50 mililitros. Usando uma pipeta multicanal, transfira 150 microliters da suspensão celular para cada poço de uma placa de microarray contendo vários produtos químicos. Microarrays também podem ser gerados manualmente seguindo o método descrito no manuscrito do texto.Cubra a placa de microarray com uma membrana de teto permeável a gás e incuba-a em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 250 RPM por 24 horas. Para fazer placas de ensaio persister, prepare 25 mililitros de meio LB modificado contendo cinco microgramas por mililitro de Ofloxacina em um tubo centrífuga de 50 mililitros e transfira este meio para um reservatório estéril. Transfira 190 microliters do meio LB modificado para cada poço de uma placa de fundo plana genérica 96.Após a incubação de 24 horas, remova a microarray do agitador e transfira 10 microlitadores de culturas celulares da microarray para os poços da placa de ensaio persistente contendo meio LB modificado com Ofloxacina. Pegue 10 microliters de suspensões celulares da placa de ensaio persister e dilua-a em série três vezes em 290 microliters de solução PBS usando uma placa de poço fundo redondo 96 e uma pipeta multicanal. Em seguida, local 10 microliters de todas as suspensões celulares diluídas em série em placas de ágar frescos sem antibióticos.Cubra a placa de ensaio persistente com uma membrana de teto permeável a gás e incuba-a em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 250 RPM por seis horas. Após a incubação de seis horas, repita a diluição serial e manchas em placas de ágar. Incubar as placas de ágar por 16 horas a 37 graus Celsius.Em seguida, conte as unidades formadoras da colônia ou CFUs. Use os níveis de UFC antes e seis horas após o tratamento com antibióticos para calcular a fração persistência em cada poço. A CFU conta antes do tratamento OFX também ajudar a avaliar os efeitos dos osmolitos na viabilidade e coli.Transfira 250 microliters de células de fase exponencial para 25 mililitros de meio LB modificado fresco contendo o osmolito identificado a partir da triagem de microarray. Incubar o frasco em um agitador orbital a 250 RPM e 37 graus Celsius por 24 horas. Após 24 horas, remova o frasco do agitador e transfira 250 microliters da cultura celular para 25 mililitros de meio LB modificado fresco em um frasco perplexo de 250 mililitros.Adicione 25 microliters de solução de estoque de Ofloxacina à suspensão celular e agite o frasco suavemente para tornar a cultura do ensaio homogênea. Incubar o frasco em um shaker a 37 graus Celsius e 250 RPM. A cada hora durante o tratamento, incluindo um ponto de tempo antes da adição de Ofloxacin, transfira um mililitro da cultura de ensaio do frasco para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro e centrifuá-lo a 17.000 vezes G por três minutos.Remova 950 microliters de supernascer e lave as células três vezes com 950 microliters de PBS. Após a lavagem final, suspenda a pelota de célula em 100 microliters de solução PBS. Pegue 10 microliters da suspensão celular e dilui-a em série seis vezes com 90 microliters de PBS dentro de uma placa inferior bem redonda de 96.Local 10 microliters das suspensões de células diluídas em uma placa de ágar livre de antibióticos. Para aumentar o limite de detecção, aplaque os 90 microliters restantes de suspensão celular em uma placa de ágar fresca. Incubar as placas a 37 graus Celsius durante 16 horas, depois contar CFUs.Uma imagem representativa das placas de ágar usada para determinar os níveis de CFU das culturas celulares antes e depois do tratamento OFX é mostrada aqui. A primeira coluna é o grupo de controle. A segunda coluna tem células que foram cultivadas em nitrato de sódio de 100 milimônios e a terceira coluna contém células que foram cultivadas em 60 milimilas de nitrato de sódio.Para simplificar, apenas dois osmólitos estão focados aqui. Uma representação gráfica dos dados da UFC a partir das placas e frações persisteras das culturas celulares testadas em 96 placas de poço são mostradas aqui. Para calcular as frações, as contagens persisteres foram normalizadas para a contagem celular obtida antes do tratamento com antibióticos.Para gerar curvas de morte porfásicas, as células foram cultivadas em 25 mililitros de meio LB modificado com os osmolitos indicados e frascos perplexos por 24 horas, depois transferidos para frascos de ensaio persistente para enumeração persistente. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que detectar as células na placa de ágar é trabalhoso e requer foco. Um erro durante a etapa pode levar à contaminação cruzada entre as condições que estão sendo testadas.Por isso, é importante praticar a 800 mlyetos simultaneamente antes do experimento. Seguindo este protocolo, painéis de drogas e bibliotecas de células mutantes podem ser examinados para estudar os impactos na persistência. Com essa triagem, identificamos uma série de osmolitos e condições de PS que têm um impacto significativo na persistência bacteriana.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Venkateswaran, S., et al. Identificação de alto rendimento de polímeros repelentes de bactérias para dispositivos médicos. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra um método de alto rendimento para identificar polímeros repelentes de bactérias usando uma lâmina de microarray exposta a culturas bacterianas mistas. A ligação bacteriana é avaliada por fluorescência DAPI, onde o sinal reduzido indica polímeros com fixação mínima na superfície.

Identificação de alto rendimento de polímeros repelentes de bactérias por meio de triagem de microarray

Neste vídeo, demonstramos um método para avaliar o efeito dos osmólitos na formação de persistentes bacterianos. As células bacterianas são primeiro expostas a osmólitos para induzir estresse osmótico, desencadeando a formação de persistentes, depois tratadas com antibióticos para enumerar os persistentes.

Ensaio de persistência in vitro: um método para avaliar o efeito de osmólitos na persistência bacteriana

Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Este artigo descreve o ensaio de elevado débito que foi estabelecida com sucesso para o rastreio de grandes bibliotecas de moléculas pequenas para a sua potencial capacidade de manipular os níveis celulares de cíclica di-GMP em Pseudomonas aeruginosa, proporcionando uma nova ferramenta poderosa para a descoberta de drogas anti-bacteriano e os testes de compostos.

Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

O charcoal agar resazurin assay (CARA) é um método semiquantitativo de médio rendimento para avaliar a atividade de agentes de teste contra micobactérias que são replicantes, não replicantes ou ambas.  O CARA permite uma avaliação rápida da atividade dependente do tempo e da concentração e identifica os parâmetros a serem seguidos pelos ensaios de unidade formadora de colônias (UFC).

Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Aqui descrevemos um protocolo que é um anfitrião inteiro, adaptável, ferramenta de triagem de alto teor que pode ser utilizada para estudar interações patógeno-hospedeiro e ser usado para a descoberta de medicamentos.

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

Os ensaios de interação cocultura apresentados neste protocolo são de baixo custo, alta taxa de transferência e simples. Esses ensaios podem ser usados para observar interações microbianas na cocultura, identificar padrões de interação e caracterizar o potencial inibitório de uma cepa microbiana de interesse contra patógenos humanos e ambientais.

Ensaios de co-cultura de alta produtividade para a investigação de interações microbianas

A persistência de antibióticos descreve a capacidade de pequenas subpopulações dentro de uma população isogênica sensível de tolerar transitoriamente altas doses de antibióticos bactericidas. O presente protocolo combina abordagens para caracterizar o fenótipo de persistência do antibiótico em nível molecular e celular após exposição de Escherichia coli a doses letais de ofloxacina.

Análise Populacional e Unicelular da Persistência de Antibióticos em Escherichia coli

Este estudo desenvolveu um ensaio para triagem de alto rendimento contra Mycobacterium abscessus com uma cepa repórter dupla recém-criada, usando fluorescência e luminescência para avaliar a viabilidade bacteriana rapidamente. Este protocolo será relevante para pesquisadores que pretendem rastrear novos medicamentos contra essa bactéria resistente a medicamentos.

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Aprenda a realizar triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana. Este protocolo adaptável utiliza culturas de microarranjos e ensaios com antibióticos para identificar condições que impactam a persistência.

Triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana

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