Name: Um modelo de imagem neonatal de sepse bacteriana gram-negativa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a modelar sepse neonatal em camundongos usando E. coli bioluminescente para rastreamento em tempo real da disseminação bacteriana. Este protocolo permite análise longitudinal da dinâmica da infecção e testes pré-clínicos de intervenções.

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Este trabalho foi apoiado por fundos institucionais para c.M.R.

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Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Nosso modelo de infecção subscapular para induzir a sepse bacteriana em camundongos neonatais é um novo método para estudar a disseminação longitudinal de patógenos bacterianos em tempo real. A imagem intravital oferece a oportunidade de explorar a disseminação bacteriana em tempo real em recém-nascidos. Isso é fundamental para entender a cinética da disseminação bacteriana e estudar melhor a resposta e os danos do hospedeiro na fase apropriada da doença. Filhotes de rato são administrados uma injeção subcutânea e subsca...

A sepse bacteriana é uma preocupação significativa para os recém-nascidos que exibem um perfil imunológico único nos primeiros dias de vida que não fornece proteção adequada contra infecção1. A sepse neonatal continua a ser um problema significativo de saúde nos EUA, representando mais de 75.000 casos anualmente apenas nos EUA2. Para estudar essas infecções em profundidade, novos modelos animais que recapitulam aspectos da doença humana são necessários. Estabelecemos um modelo de infecção por camundongos neonatais usando Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli é a segunda principal causa de sepse neonatal nos EUA, mas responsável pela maioria da mortalidade associada à sepse4,5. No entanto, é a principal causa quando os bebês pré-termo e muito baixo peso ao nascer (VLBW) são considerados independentemente5. O sorotipo K1 é mais frequentemente associado com infecções invasivas da corrente sanguínea e meningite em recém-nascidos6,7. Atualmente, não há outras opções de tratamento além de antibióticos e cuidados de apoio. Enquanto isso, as taxas de resistência a antibióticos continuam a aumentar para muitas bactérias patogênicas, com algumas cepas de E. coli resistentes a uma infinidade de antibióticos comumente usados no tratamento8. Assim, é imprescindível que continuemos a gerar métodos para estudar os mecanismos da sepse e a resposta do hospedeiro em recém-nascidos. Esses resultados podem ajudar a melhorar os tratamentos atuais e os desfechos de infecção.
O estado imunológico dos recém-nascidos é caracterizado por diferenças fenotípicas e funcionais em comparação com os adultos. Por exemplo, níveis elevados de citocinas anti-inflamatórias e regulatórias, como a interleucina (IL)-10 e IL-27, mostraram-se produzidas por macrófagos derivados do sangue do cordão umbilical e estão presentes em níveis maiores no soro dos recém-nascidos murinos9,10,11. Isso é consistente com níveis mais baixos de IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 e TNF-α que são frequentemente relatados a partir de células neonatais em comparação com as contrapartes adultas10. Além disso, o sistema imunológico neonatal é inclinado para uma resposta celular T Th2 e regulamentar em comparação com adultos12. Números elevados de neutrófilos, células T, células B, células NK e monócitos também estão presentes em recém-nascidos, mas com prejuízos funcionais significativos. Isso inclui defeitos na expressão de marcadores de superfície celular e apresentação de antígeno que sugerem imaturidade13,14,15. Além disso, os neutrófilos neonatais são significativamente deficientes em sua capacidade de migrar para fatores quimotacticos16. As células supressoras derivadas de meloides (MDSCs) também são encontradas em níveis elevados em recém-nascidos e recentemente mostradas como fonte de IL-2711. Os MDSCs são altamente supressivos em relação às célulasT 17. Coletivamente, esses dados demonstram limitações na imunidade neonatal que dão ao aumento da suscetibilidade à infecção.
Para estudar a progressão da carga bacteriana e dissecar as respostas imunes protetoras durante a sepse neonatal, desenvolvemos um novo modelo de infecção. Camundongos neonatais nos dias 3-4 da vida são difíceis de injetar no espaço intraperitoneal ou veia da cauda. Em nosso modelo, dia 3 ou 4 filhotes são administrados o inóculo bacteriano ou PBS subcutâneamente na região escárcula. Uma infecção sistêmica desenvolve-se e utilizando e. coli luminescente O1:K1:H7, podemos imagem longitudinalmente de camundongos neonatais individuais para seguir a carga bacteriana disseminada em tecidos periféricos. Este é o primeiro modelo relatado para utilizar imagens intravitais para entender a cinética da disseminação de bactérias durante a sepse em recém-nascidos murinos3.
Aqui, descrevemos um protocolo para induzir infecções sépticas de E. coli em camundongos neonatais3. Descrevemos como preparar o inóculo bacteriano para injeção, e como colher tecido para avaliação da patologia, medição de marcadores inflamatórios por análise de expressão genética e enumeração da carga bacteriana. Além disso, também é descrito o uso de E. coli luminescente para imagens intravitais de recém-nascidos infectados e quantificação da matança bacteriana por células imunes neonatais. Esses protocolos também podem ser adaptados para estudar outras infecções bacterianas importantes em recém-nascidos. Os dados aqui apresentados representam uma nova abordagem geral para a compreensão da dinâmica da infecção em um modelo de sepse neonatal traduzível.

<table><tbody><tr><td>1 mL de seringa de insulina</td><td>Coviden</td><td>1188128012</td><td>Inóculo ou injeção de PBS</td></tr><tr><td>10% de formalina tamponada neutra</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td>Histopatologia</td></tr><tr><td>ACK Lise Buffer</td><td>Gibco</td><td>LSA1049201</td><td>Ensaio de depuração bacteriana</td></tr><tr><td>Pasta de tinta de tatuagem animal</td><td>Ketchum</td><td>KI1482039</td><td>Identificação de animais</td></tr><tr><td>Tinta de tatuagem animal Pasta verde</td><td>Ketchum</td><td>KI1471039</td><td>Identificação animal</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6B.2 Microesferas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-781</td><td>Isolamento celular</td></tr><tr><td>Escherichia coli O1:K1:H7</td><td>ATCC</td><td>11775</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expressa luciferase)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Construído internamente na WVU</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. HP Kit de RNA de Extração Total</td><td>Omega Bio-tek</td><td>R6812</td><td>Extração de</td></tr><tr><td>RNA DPBS, 1X</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Difco Ágar Tripta de Soja</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>236950</td><td>Crescimento bacteriano</td></tr><tr><td>IL-1 beta Primer/Sonda (Mm00434228)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Expressão de citocinas qPCR</td></tr><tr><td>IL-6 Primer/Sonda (Mm00446190)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Expressão de citocinas qPCR</td></tr><tr><td>iQ Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708860</td><td>PCR quantitativo em tempo real</td></tr><tr><td>Kit de síntese de cDNA iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>síntese de cDNA</td></tr><tr><td>Tampão de isolamento</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>Ensaio de depuração bacteriana</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum CT e Living Image 4.5 Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td>Intravital imaging</td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td>Crescimento bacteriano</td></tr><tr><td>EASYstrainer (Nylon Basket)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542 040</td><td>Cell strainer</td></tr><tr><td>SpectraMax iD3</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Leitor de placas</td></tr><tr><td>Pellet Pestle Motor</td><td>Grainger</td><td>6HAZ6</td><td>Homogeneização de tecidos</td></tr><tr><td>Pellet de polipropileno Pestles</td><td>Grainger</td><td>6HAY5</td><td>Homogeneização de tecidos</td></tr><tr><td>Prime Thermal Cycler</td><td>Techne</td><td>3PRIMEBASE/02</td><td>síntese de cDNA</td></tr><tr><td>TNF-alfa Primer/Sonda (Mm00443258)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Expressão de citocinas qPCR</td></tr><tr><td>TriReagent (GTCP)</td><td>Centro de Pesquisa Molecular</td><td>TR 118</td><td>Extração de RNA</td></tr></tbody></table>

um modelo de imagem neonatal de sepse bacteriana gram-negativa

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Os recém-nascidos têm um risco aumentado de sepse bacteriana devido ao perfil imunológico único que apresentam nos primeiros meses de vida. Estabelecemos um protocolo para estudar a patogênese de E. coli O1:K1:H7, um sorotipo responsável pelas altas taxas de mortalidade em recém-nascidos. Nosso método utiliza imagens intravitais de filhotes neonatais em diferentes momentos durante a progressão da infecção. Essa imagem, paralelamente pela medição de bactérias no sangue, perfil inflamatório e histopatologia tecidual, significa uma abordagem rigorosa para entender a dinâmica da infecção durante a sepse. No relatório atual, modelamos dois inóculos infecciosos para comparação de cargas bacterianas e gravidade da doença. Descobrimos que a infecção subescapular leva à infecção disseminada por 10h após a infecção. Às 24 horas, a infecção da E. coli luminescente era abundante no sangue, pulmões e outros tecidos periféricos. A expressão de citocinas inflamatórias nos pulmões é significativa às 24h, sendo seguida por infiltração celular e evidência de danos teciduais que aumentam com a dose infecciosa. A imagem intravital tem algumas limitações. Isso inclui um limiar de sinal luminescente e algumas complicações que podem surgir com recém-nascidos durante a anestesia. Apesar de algumas limitações, descobrimos que nosso modelo de infecção oferece uma visão para entender a dinâmica da infecção longitudinal durante a sepse murina neonatal, que não foi completamente examinada até o momento. Esperamos que este modelo também possa ser adaptado para estudar outras infecções bacterianas críticas durante o início da vida.

Este protocolo induziu a sepse bacteriana em camundongos neonatais, e utilizamos imagens intravitais longitudinais, enumeração de bactérias no sangue, avaliações histológicas da patologia e perfis inflamatórios de expressão de citocinas para estudar o curso da doença. Foram observados sinais de morbidade em filhotes neonatais infectados com inóculos baixos (~2 x 106 CFUs) e altos (~7 x 106 UFC) de E.coli ao longo do tempo. Os filhotes que receberam o maior inóculo apresentaram sinais mais p...

A infecção de camundongos neonatais com bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulta em uma infecção séptica com inflamação pulmonar significativa e patologia pulmonar. Aqui, descrevemos procedimentos para modelar e estudar mais a sepse neonatal utilizando imagens intravitais longitudinais em paralelo com a enumeração de cargas bacterianas sistêmicas, perfil inflamatório e histopatologia pulmonar.

Um modelo de imagem neonatal de sepse bacteriana gram-negativa

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Nosso protocolo permite a disseminação bacteriana e o rastreamento de cargas em um modelo experimental de sepse neonatal em tempo real, e a capacidade de correlacionar outros marcadores da doença com a carga do patógeno. Este protocolo permite analisar longitudinalmente a sepse em camundongos neonatais individuais, proporcionando a oportunidade de observar e comparar dinâmicas de infecção e disseminação bacteriana em tempo real. Testes pré-clínicos de intervenções para sepse neonatal podem ser realizados com este método, permitindo o monitoramento dos efeitos do controle hospedeiro das bactérias.Comece colocando filhotes com correspondência etária em grupos de lixo de alta ou baixa dose dentro de um armário de nível dois de biossegurança. No terceiro ou quarto dia pós-natal, registo os pesos de todos os filhotes antes da inoculação. Carregue seringas de insulina com PBS ou o inóculo E.coli lux de alta ou baixa dose no armário de biossegurança e coloque as seringas carregadas no gelo.Coloque o recém-nascido para ser injetado em uma superfície limpa dentro do armário de biossegurança e levante a pele na nuca como se para esfolar o filhote. Insira a agulha chanfrada logo abaixo da pele no espaço criado entre a pele e o músculo. Quando a agulha pode ser sentida sob a pele, injete 50 microliters do inoculante enquanto libera simultaneamente a porção beliscada da pele para evitar o fluxo de costas, em seguida, remova a agulha lentamente e com cuidado.Quando todos os filhotes tiverem sido injetados da mesma maneira, devolva os filhotes para suas barragens. Imediatamente após a injeção e nos pontos de tempo experimentais apropriados posteriormente, coloque a gaiola com e.coli lux infectados camundongos neonatais e barragem em uma capa de fluxo laminar de nível dois de biossegurança e abra o software no computador micro CT. Depois de inicializar o sistema e esperar que a temperatura do palco seque a 37 graus Celsius e a temperatura do CCD para travar a 90 graus Celsius negativos, coloque até quatro filhotes anestesiados na caixa de imagem na câmara de imagem na posição propensa.Feche a porta da câmara de imagem e selecione a opção de imagem de luminescência. Selecione o filtro aberto e o próximo e defina o filtro de excitação para bloquear e o filtro de emissão para abrir. Selecione 500, 520, 560, 580, 600 e 620 nanômetros.Em seguida, imagem os filhotes antes de devolvê-los para a gaiola com a represa com monitoramento até a recuperação da anestesia. No ponto final experimental apropriado, em um armário de biossegurança, dou o recém-nascido eutanizado com 70% de etanol para evitar contaminação e colocar o animal no lado direito. Use fórceps para agarrar a pele entre o abdômen e a perna esquerda traseira e use uma tesoura cirúrgica de ponta fina para fazer uma incisão na pele.Em seguida, continue a incisão em direção à parte de trás do animal até que todo o baço seja exposto. Use as fórceps e a tesoura para remover o baço do abdômen e colocá-lo na solução apropriada para sua aplicação a jusante. Para obter os pulmões, retire completamente a pele do peito e entre na base do esterno com a tesoura mantida verticalmente, corte para cima até que a caixa torácica seja dividida.Use fórceps para agarrar os pulmões direito e esquerdo individualmente e remover os pulmões da cavidade torácica. Remova o coração do tecido pulmonar com uma tesoura. Em seguida, coloque o pulmão na solução apropriada para sua aplicação a jusante.Para realizar um ensaio de morte bacteriana in vitro, coloque o baço não infectado em um coador de nylon de 40 micrômetros dentro de uma placa petri estéril de 60 milímetros contendo cinco mililitros de PBS suplementados com soro bovino 10% fetal e use um estéril êrgula de seringa de três mililitros para desagregar o tecido em uma única suspensão celular. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e colete-as por centrifugação. Resuspend a pelota em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos por três a quatro baços.Depois de cinco minutos em temperatura ambiente, lave os baços em PBS e resuspenja a pelota em 250 microliters de PBS complementados com albumina de soro bovino e dois milimões EDTA para contar. Em seguida, isole as células positivas Ly6 B2 com as contas imunomagnéticas apropriadas de acordo com o protocolo do fabricante e semee as células positivas Ly6 B2 enriquecidas em uma única vez 10 para as cinco células por 100 microliters de densidade completa por poço em uma placa preta ou branca de 96 poços. Prepare o inóculo bacteriano na multiplicidade desejada de infecção em um volume final de 100 microliters por poço e adicione 100 microliters de inóculo bacteriano ou médio sozinho a cada poço para uma incubação de uma hora na incubadora de cultura celular.Ao final da incubação, substitua o meio por 200 microliters de meio fresco completo suplementado com 100 microgramas por mililitro de gentamicina para remover qualquer bactéria extracelular restante e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais duas horas. No final da incubação e em cada ponto de tempo experimental posteriormente, use um leitor de placas para medir a luminescência em cada poço da placa de cultura tampada antes de devolver a placa à incubadora de cultura celular até a próxima leitura. Enquanto a maioria dos animais apresenta altos níveis de bactérias no sangue em 24 horas após a infecção, alguns filhotes têm bactérias baixas ou indetectáveis no sangue, sugerindo a liberação da infecção por este ponto de tempo.Além disso, as células esplênicas positivas Ly6 B2 neonatais infectadas com e.coli bioluminescente por uma hora antes da remoção de bactérias extracelulares e posterior tratamento de gentamicina expressaram um alto nível de luminescência em três horas que diminui ao longo do tempo indicativo de liberação bacteriana. A imagem animal viva das bactérias luminescentes confirma ainda mais o aumento da disseminação e crescimento de bactérias em filhotes neonatais ao longo do tempo em 10 e 24 horas após a infecção. A imagem intravital em conjunto com a microC facilita a identificação de focos de infecção dentro do cérebro, pulmões e outros tecidos periféricos.Os pulmões de alguns camundongos altamente infectados demonstram regiões opacas consistentes com consolidação inflamatória que co-localizou sinais bacterianos luminescentes. Estas regiões de exsudato inflamatório presumido não são observadas em pulmões de controle não infectados. Um aumento significativo na expressão inflamatória da citocina em relação aos controles também é observado em grupos de baixo e alto inóculo, correlacionando-se com um notável espessamento da parede alveolar, aumento da hemorragia alveolar e infiltração inflamatória nesses animais.As coisas mais importantes a se lembrar são executar a técnica adequada ao realizar as injeções e prestar atenção rigorosa aos recém-nascidos ao administrar a anestesia. Utilizando essa técnica, podemos visualizar a sepse neonatal em tempo real para estudar intervenções e hospedar terapias direcionadas visando melhorar a resposta imune.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Seman, B. G., et.al. Modelo de imagem neonatal da sepse bacteriana Gram-negativa. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o isolamento de neutrófilos e monócitos inflamatórios de baços de camundongos neonatais e sua aplicação em um ensaio luminescente que mata bactérias. Ele cobre dissociação mecânica, lise de glóbulos vermelhos, enriquecimento celular baseado em esferas magnéticas, incubação bacteriana e proteção antibiótica. Leituras de luminescência temporizadas indicam internalização...

Avaliação In Vitro da Morte Bacteriana por Fagocitos Esplênicos de Camundongos Neonatais

Fonte: Seman, B. G., et al. Um modelo de imagem neonatal para sepse bacteriana gram-negativa. J. Vis. Exp. (2020)O vídeo demonstra um modelo neonatal de camundongo para estudar infecção sistêmica usando bactérias bioluminescentes encapsuladas. Filhotes neonatais são injetados com suspensões bacterianas de alta ou baixa dose e retornados à mãe para cuidados pós-natais. As bactérias encapsuladas escapam da detecção imune precoce, se espalham sistêmicamente e são visualizadas ao longo do tempo por...

Modelagem da Infecção em Camundongos Neonatais Usando Bactérias Bioluminescentes Encapsuladas

Aqui, é descrito um procedimento para o estabelecimento de uma infecção sistémica no rato neonatal com culturas de Escherichia coli K1. Este procedimento não-invasivo permite a colonização do tracto gastrointestinal, a translocação do agente patogénico para a circulação sistémica, e invasão do sistema nervoso central no plexo coróide.

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A encefalopatia hipóxico-isquêmica após asfixia perinatal pode ser estudada usando modelos animais. Demonstramos os procedimentos necessários para estabelecer um modelo de leitão de encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal.

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A encefalopatia da prematuridade engloba as anormalidades do sistema nervoso central associadas à lesão do parto prematuro. Este relatório descreve um modelo de rato clinicamente relevante de hipóxia-isquemia sistêmica transitória in utero e administração intra-amniótica de lipopolissacarídeo (LPS) que imita a corioamnionite e o impacto relacionado de estímulos infecciosos e subperfusão placentária no desenvolvimento do SNC.

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Este protocolo fornece as etapas necessárias para estabelecer e avaliar a sepse neonatal em ratos de 7 dias de idade.

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Desenvolvemos um modelo de coioamnionite para simular a exposição fetal à inflamação materna (FEMI) sem complicações de organismos vivos para examinar os efeitos do FEMI no desenvolvimento do trato intestinal da prole. Isso permite o estudo de causas mecanicistas para o desenvolvimento de lesões intestinais após a coioamnionite.

Um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido

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Um modelo de camundongo neonatal de enterocolite necrosante e isolamento da lâmina própria para perfil de células imunes

Aprenda a modelar sepse neonatal em camundongos usando E. coli bioluminescente para rastreamento em tempo real da disseminação bacteriana. Este protocolo permite análise longitudinal da dinâmica da infecção e testes pré-clínicos de intervenções.

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