Name: Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Aprenda a isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibro-inflamatórias de tecido adiposo branco intra-abdominal murino usando FACS ou separação por imunomagnetismo. Este método permite estudar dinâmicas celulares em doenças metabólicas.

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Os autores agradecem a Lisa Hansen e Kirsten Vestergaard pela excelente assistência técnica, e a P. Scherer, N. Joffin e C. Crewe pela leitura crítica do manuscrito. Os autores agradecem ao Núcleo de Citometria de Fluxo da UTSW pela excelente orientação e assistência no desenvolvimento dos protocolos descritos aqui. R.K.G. é suportado pelo NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 e NIDDK R01 DK119163. J.P. é patrocinado por um prêmio de pré-doutorado do Innovation Fund Denmark.

Todos os protocolos e procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidados com Animais do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas.
1. Isolamento da fração vascular estromal (SVF) do tecido adiposo branco gonadal
<ol><li>Disseque o tecido adiposo branco gonadal de camundongos de 6 a 8 semanas de idade e coloque as almofadas de gordura em 1x solução de PBS.</li>
	<li>Combine até 4 depósitos de gordura (recomenda-se 2-4 depósitos de 1-2 camundongos) e pique o tecido em um béquer de 10 mL contendo 200 μL de tampão de digestão (1x HBSS, 1,5% BSA e 1 mg / mL de colagenase D).</li>
	<li>Transfira o tecido picado para um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 10 mL de tampão de digestão.</li>
	<li>Incubar a mistura a 37 °C em banho-maria durante 1 h agitando.</li>
	<li>Filtrar o tecido digerido através de um filtro de células de 100 μm para remover o tecido não digerido.</li>
	<li>Dilua a amostra filtrada para 30 mL com PBS contendo 2% de FBS e centrifugue a 600 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire o sobrenadante, que contém adipócitos maduros.</li>
	<li>Prossiga imediatamente para o método de isolamento celular preferido.</li>
</ol>2. Isolamento de APCs e FIPs usando FACS
<ol><li>Dissolva o pellet em 1 mL de tampão de lise de 1x eritrócitos agitando o tubo suavemente.</li>
	<li>Incubar em RT por 1-2 min.</li>
	<li>Adicione 10 mL de 2% de FBS / PBS e passe por um filtro de células de 40 μm em um tubo de centrífuga limpo de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspire o meio e ressuspenda o pellet em 400-800 μL de 2% de FBS / PBS contendo bloco Fc (1:200).</li>
	<li>Incubar a 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Transfira 400 μL-800 μL de suspensões celulares contendo ≤106 células por mL para tubos de 1,5 mL e adicione anticorpos. As concentrações de anticorpos estão listadas na seção Tabela de Materiais .<ol><li>Prepare tubos de controle separados para 1) células não coradas, 2) controles de cor única e 3) controles FMO (fluorescência menos um).</li>
		<li>Corar as amostras com anticorpos PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar a 4 °C durante 15 min protegido da luz.</li>
	<li>Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspire o meio e ressuspenda as células em 400 μL de 2% de FBS / PBS.</li>
	<li>Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspire o meio e ressuspenda as células em 400-800 μL de 2% de FBS / PBS. Em seguida, passe por tampas de filtro de 40 μm em tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL para FACS.</li>
	<li>Siga as etapas a seguir para fechar.<ol><li>Use controles sem coloração e de cor única para compensação.</li>
		<li>Use os controles FMO para definir portas experimentais.</li>
		<li>Use a estratégia de gating mostrada na Figura 1 para obter APCs e FIPs. APCs de porta como células CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C- CD9- e FIPs como células CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+ .</li>
	</ol></li>
	<li>Colete as células classificadas em tubos contendo 500 μL de soro 100% e mantenha as células no gelo.</li>
	<li>Centrifugar as células a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Adicione 2% de FBS / PBS para lavar as células centrifugando novamente a 600 x g por 5 min a 4 ° C. Rejeitar o sobrenadante e utilizar as células peletizadas.</li>
	<li>Ressuspenda as células peletizadas no volume apropriado de meio de cultura APC gonadal (para cultura de células) ou tampão apropriado para análise subsequente.</li>
</ol>3. Separação imunomagnética de frações adipogênicas e não adipogênicas
<ol><li>Isole o SVF do tecido adiposo branco gonadal seguindo as etapas 1.1-1.7.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet SVF em 10 mL de 1x tampão MS disponível comercialmente.</li>
	<li>Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm.</li>
	<li>Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células peletizadas em 100 μL de 1x MS Buffer.</li>
	<li>Realize a depleção de células CD31+ e CD45+ conforme discutido abaixo (Figura 2A, Etapa 1). Isso é feito para remover células de linhagem endotelial e hematopoiética.<ol><li>Conte as células usando um contador de células e ajuste a concentração para ≤ 1 x 108 células / mL.</li>
		<li>Adicione os anticorpos CD31 e CD45 conjugados com biotina à suspensão celular, cada um na concentração de ≤ 0,25 μg por 106 células e incube em gelo por 15 min.</li>
		<li>Lave as células adicionando 4 mL de 1x MS Buffer.</li>
		<li>Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet com 100 μL de tampão 1x MS.</li>
		<li>Adicione 10 μL de nanoesferas de estreptavidina e incube as células no gelo por 15 min.</li>
		<li>Lave as células adicionando 4 mL de tampão 1x MS.</li>
		<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C e, em seguida, aspirar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspenda as células em 2,5 mL de tampão 1x MS e transfira para um tubo de polipropileno de 5 mL.</li>
		<li>Coloque o tubo no suporte magnético por 5 min.</li>
		<li>Colete células não marcadas despejando a suspensão celular em um tubo de centrífuga limpo de 15 mL. NOTA: Evite sacudir ou enxugar as gotículas pendentes, pois isso leva à contaminação por uma fração celular indesejada.</li>
		<li>Remova o tubo do ímã e repita as etapas 3.6.9. ao ponto 3.6.11. mais duas vezes para um total de 3 lavagens.</li>
	</ol></li>
	<li>Separação das fracções adipogénicas e não adipogénicas (figura 2A, passo 2)<ol><li>Continue trabalhando com fração não rotulada (ou seja, fração CD45-CD31-).</li>
		<li>Centrifugue o tubo de 15 ml contendo células não marcadas a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão 1x MS.</li>
		<li>Adicione anticorpos LY6C e CD9 conjugados com biotina, respectivamente, a uma concentração de ≤ 0,25 μg por 106 células e incube em gelo por 15 min.</li>
		<li>Siga as etapas 3.6.3. para 3.6.12. para completar a segunda separação.</li>
		<li>Colete frações não ligadas. Células não marcadas (LY6C-CD9-) representam fração adipogênica contendo APCs (Figura 2A, Etapa 3).</li>
		<li>Remova o tubo do ímã, ressuspenda e elua as células ligadas em 1x tampão MS. Eluatos ou fração marcada (LY6C+ CD9+), representa fração não adipogênica contendo FIPs (Figura 2A, Etapa 3).</li>
		<li>Centrifugar fracções marcadas e não marcadas a 600 x g durante 5 min para granular células a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Proceder imediatamente à cultura de células (etapa 6) ou utilizar precursores indiferenciados para as análises preferidas (etapa 4 e/ou etapa 5).</li>
</ol>4. Avaliar a pureza das frações adipogénicas e não adipogénicas por citometria de fluxo
<ol><li>Ressuspenda frações de células isoladas em 200-400 μL de 2% de FBS / PBS contendo bloco Fc (1: 200).</li>
	<li>Incubar a 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para tubos de 1,5 mL e adicione anticorpos. As concentrações de anticorpos estão listadas na Tabela de Materiais.<ol><li>Prepare tubos de controle separados para 1) células não coradas, 2) controles de cor única e 3) controles FMO.</li>
		<li>Às amostras, adicione os anticorpos CD45, CD31, CD9 e LY6C.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar a 4 °C durante 15 min protegido da luz.</li>
	<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 400 μL de 2% de FBS / PBS.</li>
	<li>Centrifugue a suspensão a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 400-800 μL de 2% FBS / PBS. Filtre através de tampas de filtro de 40 μm em tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL para análise por citometria de fluxo.</li>
	<li>Análise de citometria de fluxo para avaliar a pureza<ol><li>Use controles sem coloração e de cor única para compensação.</li>
		<li>Use os controles FMO para definir portas experimentais.</li>
		<li>Use a estratégia de gating para células ativas e únicas, conforme mostrado na Figura 2B.</li>
		<li>Execute o gating conforme mostrado na Figura 2B para CD45, CD31, LY6C e CD9.</li>
		<li>Use o software de citometria de fluxo para avaliar as frequências das células CD45- CD31- LY6C- CD9- (APCs) e células CD45- CD31- LY6C+ (FIPs) dentro de frações isoladas.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Análise de expressão gênica usando PCR quantitativo para avaliar a pureza de FIPs e APCs
<ol><li>Extraia o mRNA de células isoladas magneticamente ou FACS usando o kit de extração disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Use 1 μg de RNA para sintetizar o cDNA usando um kit de transcriptase reversa de cDNA (consulte a Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Determine os níveis relativos de mRNA de genes seletivos de APC e FIPs (Tabela 1) por PCR quantitativo usando SYBR green PCR master mix.<ol><li>Configure a reação da amostra para PCR da seguinte forma: 5 μL de corante verde 2x SYBR, 1 μL de cDNA (~ 50 ng / μL), 0,5 μL de cada primer direto e reverso (10 μM) e 3 μL de água.</li>
		<li>Use as seguintes condições de PCR padrão para a execução de PCR quantitativa: estágio de espera: 50 °C por 2 min, 95 °C por 10 min; Estágio de PCR (40 ciclos): 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Normalize os valores para os níveis do gene de manutenção da casa (Rps18) calculando ΔΔ-Ct.</li>
	<li>Para avaliar a significância estatística, realizar o teste t de Student não pareado.</li>
</ol>6. Cultura e diferenciação celular
<ol><li>Centrifugar células isoladas magneticamente ou FACS a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet em 500 μL de meio de cultura APC gonadal e coloque 40K células/poço de cada fração em uma placa de cultura de 48 poços.</li>
	<li>Substitua a mídia a cada 1-2 dias. As APCs começarão a sofrer diferenciação em adipócitos à medida que se aproximam da confluência. As PIFs mantidas no mesmo meio são resistentes à adipogênese.</li>
</ol>

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</ol>

T.A.P. é funcionário e acionista da Novo Nordisk A/S

A cepa de camundongos C57BL/6 é a cepa de camundongo mais usada em estudos de obesidade induzida por dieta. Camundongos C57BL/6 ganham peso rapidamente quando colocados em uma dieta rica em gordura (HFD) e desenvolvem algumas das características proeminentes da síndrome metabólica associada à obesidade (por exemplo, resistência à insulina e hiperlipidemia). Notavelmente, a expansão do WAT que ocorre em associação com a alimentação com dieta rica em gordura (HFD) ocorre de maneira específica do depósito 19,20,21,22,23.<su...

O tecido adiposo branco (TAB) representa o principal local de armazenamento de energia em mamíferos. Dentro desse tecido, os adipócitos, ou "células de gordura", armazenam o excesso de calorias na forma de triglicerídeos, embalados em grandes gotículas lipídicas uniloculares. Além disso, os adipócitos secretam uma infinidade de fatores que regulam vários aspectos da homeostase energética 1,2,3. Os adipócitos constituem a maior parte do volume de TAB; no entanto, os adipócitos representam apenas menos de 50% do total de células encontradas no WAT 4,5. O compartimento não adipócitos do TAB, ou fração estromal-vascular (SVF), é bastante heterogêneo e contém células endoteliais vasculares, células imunes residentes em tecidos, fibroblastos e populações de células precursoras de adipócitos (APC).
O WAT é excepcional em sua notável capacidade de expandir em tamanho à medida que a demanda por armazenamento de energia aumenta. A manutenção dessa plasticidade tecidual é essencial, pois o armazenamento adequado de lipídios no WAT protege contra a deposição de lipídios ectópicos deletérios em tecidos não adiposos6. A maneira pela qual os depósitos individuais de WAT sofrem essa expansão em resposta ao excesso calórico é um determinante crítico da sensibilidade à insulina no cenário de obesidade7. A expansão patológica do TAB, observada em indivíduos obesos com síndrome metabólica, é caracterizada pela expansão preferencial dos depósitos viscerais do TAB em detrimento do tecido adiposo subcutâneo metabolicamente favorável. Além disso, a resistência à insulina na obesidade está associada ao remodelamento patológico do TAB. Caracteriza-se por crescimento hipertrófico dos adipócitos existentes (aumento de tamanho), angiogênese inadequada, inflamação metabólica crônica, acúmulo de componentes da matriz extracelular (fibrose) e hipóxia tecidual 8,9. Esses fenótipos de obesidade WAT estão associados à esteatose hepática e resistência à insulina, semelhante ao que é observado na condição de lipodistrofia (ausência de WAT funcional). Em contraste, a expansão saudável do WAT é observada na população obesa metabolicamente saudável e é caracterizada pela expansão preferencial do WAT subcutâneo protetor e expansão do depósito através da hiperplasia dos adipócitos10. O recrutamento de novos adipócitos é mediado pela diferenciação de adipócitos de novo de células precursoras de adipócitos (APCs) (denominada "adipogênese"). A hiperplasia de adipócitos coincide com graus relativamente mais baixos de fibrose WAT e inflamação metabólica 6,11. Uma infinidade de tipos de células dentro do microambiente WAT influencia diretamente a saúde e a capacidade de expansão do WAT na obesidade12. Como tal, definir a função dos vários tipos de células presentes no WAT continua sendo uma alta prioridade para o campo.
Na última década, várias estratégias foram empregadas para definir e isolar APCs nativos de WAT SVF13 humano e de camundongo. Tais estratégias isolam APCs com base na expressão da superfície celular de marcadores comuns de células-tronco/progenitoras mesenquimais usando técnicas de separação celular baseadas em anticorpos. Essas abordagens incluem classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), usando anticorpos marcados com fluoróforo, ou separação de esferas imunomagnéticas (ou seja, anticorpos quimicamente modificados). As proteínas de superfície celular direcionadas para o isolamento de APCs incluem PDGFRα, PDGFRβ, CD34 e SCA-1. Essas abordagens ajudaram a enriquecer os APCs; no entanto, as populações de células isoladas com base nesses marcadores são bastante heterogêneas. Estudos muito recentes de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) destacaram a heterogeneidade molecular e funcional das células estromais dentro da fração estromal-vascular isolada (SVF) do WAT murino 14,15,16,17. A partir de nosso próprio scRNA-seq e análises funcionais, identificamos e caracterizamos subpopulações de células perivasculares PDGFRβ+ imunomoduladoras e adipogênicas funcionalmente distintas no compartimento estromal do WAT intra-abdominal em camundongos adultos15. Os precursores fibroinflamatórios, ou FIPs, representam uma subpopulação proeminente de células PDGFRβ+ e podem ser isolados com base na expressão de LY6C (células LY6C+ PDGFRβ+)15. As PIF carecem de capacidade adipogênica, exercem forte resposta pró-inflamatória a vários estímulos, produzem colágeno e secretam fatores antiadipogênicos15. A atividade pró-inflamatória e fibrogênica dessas células aumenta em associação com a obesidade em camundongos, implicando essas células como reguladoras do remodelamento do WAT. A subpopulação LY6C- CD9- PDGFRβ+ representa células precursoras de adipócitos (APCs). Essas APCs são enriquecidas na expressão de Pparg e outros genes pró-adipogênicos e prontamente se diferenciam em adipócitos maduros in vitro e in vivo15. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento dessas populações de células distintas de depósitos intra-abdominais de WAT de camundongos adultos usando FACS e separação de esferas imunomagnéticas com anticorpos biotinilados. Este protocolo pode ser usado para isolar subpopulações progenitoras adiposas funcionalmente distintas de vários depósitos intra-abdominais de WAT de camundongos machos e fêmeas adultos15. Estudar essas populações de células funcionalmente distintas isoladamente pode contribuir muito para nossa compreensão atual dos mecanismos moleculares que regulam a adipogênese e a remodelação do tecido adiposo intra-abdominal na saúde e na doença.
O protocolo abaixo detalha o isolamento de progenitores adiposos do WAT epididimal murino; no entanto, o mesmo procedimento pode ser usado para isolar as células correspondentes dos depósitos de WAT mesentérico e retroperitoneal de camundongos machos e fêmeas15. Um protocolo detalhado sobre como identificar e isolar esses depósitos em camundongos pode ser encontrado em Bagchi et al.18. Este protocolo foi otimizado para o uso de camundongos de 6 a 8 semanas de idade. A frequência e a capacidade de diferenciação das APCs podem diminuir em associação com o envelhecimento.

<table><tbody><tr><td><forte>Preparação Mecânica de Tecidos e Isolamento SVF</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 e 100 &micro; filtros de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340/352360</td><td></td></tr><tr><td>1X solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>tubos de polipropileno de 5ml</td><td>Tampão</td> de digestão <td>Fisher Scientific 352053</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestion Buffer (para 10mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>10 mg de colagenase D (1 mg/ml cc final)</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>0,15 g de BSA (1,5% cc final)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immunomagnetic separação de APCs e não-APCs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5X MojoSort Buffer (MS buffer)</td><td>BioLegend</td><td>480017</td><td></td></tr><tr><td>5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)</td><td>BioLegend</td><td>480019</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; L MojoSort Streptavidin Nanobeads</td><td>BioLegend</td><td>480015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verificação de Pureza e FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Tampão de Lise de Glóbulos Vermelhos</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Fc block (Mouse CD16/CD32)</td><td>eBioscience</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotina CD45</td><td>BioLegend</td><td>103103</td><td>Concentração: &le; 0,25 &micro; g por 10 ^ 6 células Espécie: Mouse Clone: 30-F11</td></tr><tr><td>Biotina CD31</td><td>BioLegend</td><td>102503</td><td>Concentração: &le; 0,25 &micro; g por 10^6 células Espécie: Mouse Clone: MEC13.3</td></tr><tr><td>Biotina CD9</td><td>BioLegend</td><td>124803</td><td>Concentração: &le; 0.25 &micro; g por 10^6 células Espécie: Mouse Clone: MZ3</td></tr><tr><td>Biotina LY6C</td><td>BioLegend</td><td>128003</td><td>Concentração: &le; 0,25 &micro; g por 10^6 células Espécie: Mouse Clone: HK1.4</td></tr><tr><td>CD31-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>102419</td><td>Concentração: Diluição 1:400 Espécie: Mouse Clone: 390</td></tr><tr><td>CD45-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>103131</td><td>Concentração: Diluição 1:400 Espécie: Mouse Clone: 30-F11</td></tr><tr><td>CD140b PDGFR&beta;-PE</td><td>BioLegend</td><td>136006</td><td>Concentração: Diluição 1:50 Espécie: Mouse Clone: APB5</td></tr><tr><td>LY6C-APC</td><td>BioLegend</td><td>128016</td><td>Concentração: Diluição 1:400 Espécie: Mouse Clone: HK1.4</td></tr><tr><td>CD9-FITC</td><td>BioLegend</td><td>124808</td><td>Concentração: Diluição 1:400 Espécie: Mouse Clone: MZ3</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cultura de células e Diferenciação</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Gonadal APC Meios de cultura (para 500mL)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>288 mL DMEM com 1 g/L de glicose</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>192 mL MCDB201</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Soro fetal bovino (FBS)** lote#14E024</td><td>Sigma</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 100% ITS premix</td><td>BD Bioscience</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 10 mM L-ácido ascórbico-2-2fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; L 100 g/ml FGF-básico</td><td>R& D systems</td><td>3139-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pen/Strep</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>500 &micro; L Gentamycin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>**NOTA: A capacidade adipogênica dos APCs primários pode variar de lote para lote de FBS comercial. Vários lotes/fontes de FBS devem ser testados.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de subpopulações de células estromais adipogênicas e fibro-inflamatórias de depósitos adiposos intra-abdominais murinos

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

A fração estromal-vascular (FVS) do tecido adiposo branco (TAB) é notavelmente heterogênea e consiste em vários tipos de células que contribuem funcionalmente para a expansão e remodelação do TAB na idade adulta. Uma tremenda barreira para estudar as implicações dessa heterogeneidade celular é a incapacidade de isolar prontamente subpopulações celulares funcionalmente distintas do WAT SVF para análises in vitro e in vivo. A tecnologia de sequenciamento de célula única identificou recentemente subpopulações de células perivasculares PDGFRβ+ fibroinflamatórias e adipogênicas funcionalmente distintas em depósitos intra-abdominais de WAT de camundongos adultos. Os progenitores fibro-inflamatórios (denominados "FIPs") são células produtoras de colágeno não adipogênico que podem exercer um fenótipo pró-inflamatório. As células precursoras de adipócitos PDGFRβ+ (APCs) são altamente adipogênicas tanto in vitro quanto in vivo após o transplante de células. Aqui, descrevemos vários métodos para o isolamento dessas subpopulações de células estromais de depósitos intra-abdominais murinos de WAT. FIPs e APCs podem ser isolados por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou aproveitando a tecnologia de esferas imunomagnéticas baseadas em anticorpos biotinilados. As células isoladas podem ser usadas para análise molecular e funcional. Estudar as propriedades funcionais da subpopulação de células estromais isoladamente expandirá nosso conhecimento atual da remodelação do tecido adiposo sob condições fisiológicas ou patológicas no nível celular.

Este protocolo descreve duas estratégias que permitem o isolamento de populações distintas de células estromais de depósitos intra-abdominais de WAT de camundongos adultos. APCs e FIPs podem ser isolados por FACS (Figura 1) ou separação imunomagnética de esferas com anticorpos biotinilados (Figura 2). Ambas as abordagens utilizam reagentes e anticorpos que estão disponíveis comercialmente. A separação imunomagnética do grânulo leva à separação de células adipogê...

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

O protocolo permite que os investigadores isolem subpopulações funcional e molecularmente distintas de células estromais de tecido adiposo branco perigonadal de modelos de camundongos de interesse. A vantagem dessa técnica é que todas as ferramentas e reagentes estão amplamente disponíveis. Demonstrando o procedimento estará Lavanya Vishvanath, analista sênior de pesquisa de laboratório do laboratório do Dr. Rana Gupta.Após o isolamento das células vasculares estromais do tecido adiposo branco gonadal, ou WAT, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos por um a dois minutos de incubação em temperatura ambiente. Pare a lise com 10 mililitros de 2% FBS e PBS e filtre as células através de um filtro de células de 40 mícrons em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Coletar as células por centrifugação e ressuspender o pellet em 400 a 800 microlitros FBS e PBS, suplementado com bloco FC.Após uma incubação de 10 minutos a quatro graus Celsius, transfira 400 a 800 microlitros de células para o número apropriado de tubos para coloração de anticorpos conjugados com fluorescência e rotule as células com os anticorpos controle e experimentais de interesse a quatro graus Celsius por 15 minutos, protegidos da luz. No final da incubação, pelete as células por centrifugação e lave as células em 400 microlitros de FBS e PBS frescos por tubo. Após a lavagem, ressuspenda os pellets em 400 a 800 microlitros de FBS e PBS frescos por tubo e filtre as células através de tampas de filtro de 40 mícrons em tubos de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros para FACS.Defina as portas de compensação e experimentais para obter as células apresentadoras de antígenos e progenitores fibroinflamatórios. Após a classificação das células, coletar e lavar as células por centrifugação e ressuspender os pellets em 500 microlitros de meio de cultura celular apresentador de antígeno gonadal por fração. Para a separação imunomagnética das frações de células adipogênicas e não adipogênicas, ressuspenda o pellet vascular estromal em 10 mililitros de tampão MS e filtre as células através de um filtro de 40 mícrons.Após a contagem, coletar as células por centrifugação e ressuspendê-las em não mais do que 10 vezes o oitavo células por mililitro de concentração de tampão MS. Em seguida, adicione não mais do que 0,25 gramas de anticorpo conjugado com biotina anti-CD31 e anti-CD45 por um vezes dez às seis células para uma incubação de 15 minutos no gelo. No final da incubação, lave as células em quatro mililitros de tampão MS por centrifugação e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão MS fresco.Adicione 10 microlitros de nanoesferas de estreptavidina às células para uma incubação de 15 minutos no gelo, seguida de outra lavagem em quatro mililitros de tampão MS. Ressuspenda o pellet em 2,5 mililitros de tampão MS fresco e transfira as células para um tubo de polipropileno de cinco mililitros. Coloque o tubo em um ímã por cinco minutos antes de decantar as células não marcadas em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros.Repita a lavagem mais duas vezes, conforme demonstrado, puxando as células não marcadas após cada lavagem, e colete as células endoteliais e hematopoiéticas depletadas por centrifugação. Ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão MS e rotule as células com não mais do que 0,25 microgramas de anticorpos Ly6C e CD-9 por um vezes 10 das sextas células por 15 minutos no gelo. No final da incubação, colete as células adipogênicas negativas para CD-9 negativas Ly6C não ligadas, conforme demonstrado, antes de coletar as células não adipogênicas positivas para Ly6C.Em seguida, coletar ambas as populações de células por centrifugação e ressuspender as células em 500 microlitros de meio de cultura celular apresentador de antígeno gonadal por fração. Para configurar culturas de células para diferenciação, coloque cada fração em quatro vezes 10 das quatro células por poço em concentração em poços individuais de uma placa de cultura de 48 poços e coloque as placas na incubadora de cultura de células por sete a 10 dias. As células precursoras de adipócitos começarão a sofrer diferenciação em adipócitos à medida que se aproximam da confluência, enquanto os progenitores inflamatórios da fibroína serão resistentes à adipogênese.Usando este protocolo, populações distintas de células estromais podem ser isoladas de depósitos intra-abdominais de WAT de camundongos adultos por FACS ou separação de esferas imunomagnéticas, conforme demonstrado. Com a separação imunomagnética do grânulo, as células adipogênicas e não adipogênicas podem ser isoladas da fração vascular estromal WAT gonadal. Conforme observado por citometria de fluxo, 75% das células dentro da fração adipogênica são células precursoras de adipócitos Ly6C negativas para CD-9, enquanto mais de 75% da fração não adipogênica, células progenitoras fibroinflamatórias positivas para Ly6C.As células precursoras de adipócitos isoladas em ambos os métodos diferenciam-se em adipócitos contendo lipídios para uma alta pureza dentro de sete a 10 dias após o plaqueamento. Em contraste, os precursores não adipogênicos permanecem semelhantes a fibroblastos e não se tornam adipócitos nas mesmas condições de cultivo. O protocolo trabalha para o isolamento de subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias do tecido adiposo branco perigonadal.Populações de células semelhantes podem ser encontradas em outros depósitos adiposos de camundongos. No entanto, sua seleção dependerá do uso de diferentes anticorpos. As populações de células isoladas por FACS e separação magnética podem ser usadas para ensaios in vitro de diferenciação celular ou ainda caracterizadas por meio de análise de expressão gênica.

isolation-adipogenic-fibro-inflammatory-stromal-cell-subpopulations

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Apresentamos as técnicas necessárias para isolar a fração vascular estromal (SVF) de depósitos de tecido adiposo inguinal (subcutâneo) e perigonadal (visceral) de camundongos para avaliar sua expressão gênica e atividade colagenolítica. Este método inclui o enriquecimento de células-tronco derivadas de alto teor adiposo (ASCs) Sca1 usando separação celular imunomagnética.

A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica<sup&gt; alta</sup&gt; células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC)

Aqui, relatamos um método para o isolamento das populações de células progênitentes de adipócitos (APC) do tecido de tecido adiposo perivascular (PVAT) usando a classificação celular celular ativada por magnética (MCS). Este método permite um maior isolamento de APC por grama de tecido adiposo quando comparado à Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

Expansão e adipogênese Indução de progenitores de adipócitos do tecido adiposo perivascular isolado pela classificação de células ativadas magnéticas

A diferenciação dos adipócitos brancos e bege de tecido adiposo vascular progenitores tem potencial para melhoria metabólica em obesidade. Descrevemos os protocolos para um CD34 + CD31 + isolamento de células endoteliais de gordura humana e uma subsequente em vitro expansão e diferenciação em adipócitos brancos e bege. Diversas aplicações a jusante são discutidas.

Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.

Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

Este protocolo fornece um método eficiente de digestão de colagenase para isolamento de adipócitos viáveis e células da fração vascular estromal-SVF da gordura visceral humana em um único processo, incluindo metodologia para obtenção de RNA de alta qualidade a partir de adipócitos e fenotipificação de macrófagos SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para análise por citometria de fluxo.

Isolamento de Adipócitos Viáveis e Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Visceral Humano Adequado para Análise de RNA e Fenotipagem de Macrófagos

Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Descrevemos o isolamento, a cultura e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, permitindo o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares.

Isolamento, Cultura e Indução Adipogênica de Pré-adipócitos Derivados da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Periaórtico de Camundongos

O tamanho e a fragilidade dos adipócitos maduros limitaram as técnicas e ferramentas disponíveis para seu estudo e isolamento. Aqui, é descrito um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros, que pode ser facilmente adaptado para diferentes depósitos adiposos e dietas de camundongos.

Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

Aqui, apresentamos um método padrão para isolar eficientemente células-tronco e adipócitos derivados do adiposo, caracterizado por redução de &gt;90% no tempo de processamento, alta viabilidade celular e ampla compatibilidade.

Isolamento Eficiente de Células-Tronco e Adipócitos Derivados do Adiposo a partir do Tecido Adiposo Suíno

Aprenda a isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibro-inflamatórias de tecido adiposo branco intra-abdominal murino usando FACS ou separação por imunomagnetismo. Este método permite estudar dinâmicas celulares em doenças metabólicas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

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