Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

Este método é significativo porque pode ser usado em diversas espécies bacterianas para identificar genes essenciais, genes de resistência a antibióticos e genes importantes para o condicionamento in vivo durante a infecção. A principal vantagem desta técnica é o compartilhamento mecânico de DNA genômico e edição Poly-CTL, que eliminam a necessidade de enzimas de restrição caras, radiação adaptadora e purificação de gel. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de infecções bacterianas problemáticas, pois genes identificados como importantes para infecção ou resistência a antibióticos, poderiam servir como alvos para novas terapêuticas antimicrobianas.

Este método pode fornecer insights sobre genótipos complexos, relações de fenótipo entre espécies bacterianas gram-negativas e gram-positivas, e melhorar nossa compreensão atual da genética bacteriana. Para começar, transfira culturas noturnas para tubos cônicos de 50 mililitros e pelotas tanto culturas de receptores quanto de doadores usando centrifugação a 5.000 vezes G por 7 minutos. Descarte o supernaspeso.

Use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para suspender a pelota de cepa do doador em 4,5 mililitros de LB suplementados com ácido diaminopimelic. Transfira a cepa do doador re-suspensa para o tubo de tensão do receptor. E distribua imediatamente a suspensão de acasalamento como gotículas de 100 microliter individuais em placas de ágar LB, suplementadas com ácido diaminopimelic Incubar as placas em temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, transfira cuidadosamente as placas para a incubadora Celsius de 37 graus e permita que as culturas acasalem por uma hora. Após a incubação adicione 1,5 mililitros de LB em cada placa e colde as bactérias em um tubo cônico de 50 mililitros. Pelota as células acasaladas usando centrifugação a 5.000 vezes G durante sete minutos.

Em seguida, descarte o supernasce e suspenda novamente as células em 10 mililitros de LB, para remover o ácido diaminopimelic residual Pellet as células novamente, e repetir a lavagem com LB. Quando terminar, use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para suspender a pelota em 10 mililitros de LB, suplementada com 25% de glicerol. Espalhe as células em placas, de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, incubar as placas a 37 graus Celsius, durante a noite.

Crie uma alíquota mililitro das bactérias restantes e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Despeje uma alíquota do acasalamento congelado no gelo. Em seguida, use contas de vidro estéreis para espalhar 150 microliters da diluição, em cada 30 por 150 milímetros placa de ágar Luria-Bertani, suplementada com Kanamicina.

Descarte o tubo usado contendo excesso de acasalamento e incubar placas a 37 graus Celsius por 14 horas. Após a incubação, a colônia forma unidades em cada placa para estimar o total de mutantes na biblioteca transposon. Conte 20% de pelo menos três placas para determinar a estimativa de contagem da colônia para todo o grupo de placas.

Depois de calcular o rendimento estimado da colônia, adicione de três a cinco mililitros de LB a cada placa, e raspe as bactérias usando uma ferramenta de raspagem estéril. Puxe as suspensões bacterianas de todas as placas em tubos cônicos de 50 mililitros, e pelota as suspensões por centrifugação a 5.000 vezes G, por sete minutos. Descarte o supernascer e suspenda a pelota em cinco mililitros de LB, suplementado com 30% de glicerol.

Então, faça uma alíquota mililitro da biblioteca transposon em criovias e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Diluir o gDNA com tampão de TE para uma concentração de 250 nanogramas por microliter, em um volume total de 200 microliters, e colocá-lo no sônico de banho de água. Sonicar o DNA para produzir fragmentos de aproximadamente 300 nucleotídeos.

Confirme que o DNA é cortado executando 10 microliters de DNA não esquecido e 10 microliters de DNA cortado, em um gel assado de 1% de porco. Repita a sônica, se necessário. Para adicionar a cauda de semente de Polly à extremidade três prime do DNA puro, configure a reação política como descrito no manuscrito do texto e incubar os tubos de reação por uma hora a 37 graus Celsius.

Para purificar a reação da política, adicione 40 microliters de tamanho de seleção de contas paramagnéticas a cada amostra e vórtice do tubo de reação. Incubar amostras em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, centrifuá-los brevemente para coletar o líquido na parte inferior do tubo.

Transfira os tubos para um rack magnético e incuba-os à temperatura ambiente por dois minutos ou até que a solução esteja clara. Remova cuidadosamente o supernascer e adicione 200 microliters de recém-preparado, 80% etanol, sem perturbar as contas. Incubar as amostras até que a solução esteja clara.

Em seguida, retire o supernaspe e repita a lavagem do etanol. Centrifufique brevemente os tubos e coloque-os de volta no rack magnético, para remover qualquer líquido restante. Incubar as amostras à temperatura ambiente, por dois a cinco minutos, para permitir que sequem.

E adicione 25 microliters de água a cada tubo. Vórtice-los por aproximadamente cinco segundos ou pipeta para cima e para baixo. Em seguida, centrifufique os tubos para coletar líquido na parte inferior.

Transfira os tubos para o rack magnético e deixe-os descansar por aproximadamente dois minutos até que a solução esteja clara. Então, transfira o supernatante para um novo tubo sem perturbar as contas. Este protocolo foi usado para gerar uma biblioteca transposon de alta densidade na cepa A-baumannii ATCC 17978, através da conjugação bacteriana usando auxotrofo E-coli MFD DAP, que replica o plasmídeo pJNW684.

A biblioteca mutante transposon A-baumannii foi usada para identificar fatores de aptidão, importantes para a resistência à Colistina sob concentrações subibitórias do antimicrobiana. Depois de esgotar a biblioteca mutante de genes que contribuem para a resistência colistina, o gDNA total da tração da biblioteca restante foi isolado do controle e culturas experimentais. O gDNA foi fragmentado com tesoura mecânica e uma cauda de política foi adicionada aos fragmentos de DNA em preparação para o sequenciamento.

As concentrações de DNA foram calculadas e as amostras foram analisadas por meio de eletroforese capilar baseada em chip, para confirmar construções bem sucedidas da biblioteca. A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este procedimento é ajustar o volume de acasalamento, com base na contagem de CFU para cepas específicas de alvos para gerar uma biblioteca mutante de alta resolução. Além disso, a cepa receptora deve ser sensível ao marcador de resistência a antibióticos, usando o transposon antes da mutagênese.

Após este procedimento, a exclusão genética ou o método de dizer som podem ser realizados para eliminar cabeças individuais obtidas a partir de resultados de sequenciamento e validar genes de interesse em condições contestadas.