Um procedimento de ChIP-Seq semiautônomo para estudos epigenéticos em larga escala

Este protocolo é significativo na medida em que permite a análise ChIP-Seq de alto rendimento de amostras primárias para entender melhor os mecanismos cis-regulatórios e sua implicação na doença. As principais vantagens deste método são a reprodutibilidade dos dados e a redução drástica do tempo prático de laboratório. Para cisalhamento da cromatina, adicione 70 microlitros de tampão de lise completo, fresco e à temperatura ambiente a um pellet celular fixado com glicina, congelado e descongelado de interesse, para uma incubação de um minuto à temperatura ambiente, seguido por um minuto de ressuspensão sem bolhas.

Incube a amostra por mais um minuto em temperatura ambiente, antes de colocar as células no gelo. Transfira o pellet ressuspenso para um tubo de baixa ligação de 0,65 mililitro no gelo, antes de carregar o tubo no suporte do tubo de um sonicador. Preencha as lacunas com tubos de equilíbrio contendo 70 microlitros de água e deixe as células se estabilizarem no banho-maria por cerca de um minuto antes de iniciar a sonicação.

Após três ciclos, remova as amostras do sonicador para um vórtice suave e gire os tubos antes de colocá-los de volta no suporte. Para modificação de histonas, adicione 100 microlitros de tampão tC1 completo a cada tubo de duas tiras de oito tubos de chip e transfira 20 microlitros de cada uma das 16 amostras compartilhadas de cromatina para tubos individuais das tiras de oito tubos de chip. Lave os tubos de cromatina com 80 microlitros de tampão tC1 completo e agrupe as lavagens nos tubos apropriados das tiras de oito tubos de cavacos para um volume final de 200 microlitros de solução por tubo.

Adicione o volume apropriado de anticorpo a 500 microlitros de tampão TBW1 e rapidamente vórtice e giro de pulso. Em seguida, adicione 70 microlitros de tBW1 e 30 microlitros de solução de anticorpos a cada tubo de uma nova tira de oito tubos de chip. Em seguida, vortex completamente um recipiente de solução de grânulos de proteína A e adicione cinco microlitros de grânulos por 0,5 microgramas de anticorpo a uma nova tira de tubo.

Gire a tira de grânulos por pulso e preencha a última linha do manipulador de líquido de cavacos com tiras de oito tubos de cavacos rotuladas e vazias. Em seguida, siga as especificações do programa chip 16-I pure 200 D para a colocação do restante das tiras e carregue os buffers nas posições corretas. Após o sequenciamento, capture as esferas em um ímã de tira de oito tubos e transfira 25 microlitros de tampão de marcação para cada tubo.

Com os tubos removidos do ímã, misture delicadamente, até que as soluções de esferas fiquem homogêneas, antes de colocar os tubos retampados em um ThermoMixer pré-aquecido por três minutos. No final da incubação, remova as tiras de oito tubos de cavacos na última fileira do manipulador de líquido de cavacos e adicione dois microlitros de Rnase A a cada amostra. Em seguida, gire os tubos retampados e misture suavemente, até que as soluções de esferas fiquem homogêneas.

Para uma purificação dos fragmentos de DNA marcados, transfira 100 microlitros das amostras de DNA reticulado D em tubos individuais de 1,5 mililitro e lave os tubos com 100 microlitros de tampão de ligação de DNA por tubo. Pulse as lavagens nos tubos apropriados e carregue as amostras em colunas. Coloque as colunas em novos tubos de coleta de 1,5 mililitro e adicione nove microlitros de tampão Tris-EDTA a 55 graus Celsius diretamente nas matrizes da coluna.

Após um minuto, centrifugue as colunas e transfira os nove microlitros de eluído de cada coluna para uma nova tira de oito tubos no gelo. Eluir os fragmentos de DNA novamente conforme demonstrado, mas com oito microlitros de tampão Tris-EDTA e agrupar o eluído com a solução de fragmento de DNA previamente colhida. Para amplificar as amostras de fragmentos de DNA purificadas, misture as amostras com uma pipeta multicanal e execute um programa de amplificação com o número apropriado de ciclos.

Após a amplificação, use um ímã de placa para capturar as contas e descarte o sobrenadante. Lave as esferas três vezes com 200 microlitros de etanol fresco a 80% por lavagem, sem interromper o pellet do grânulo. Após a última lavagem, use uma ponta de pipeta de 20 microlitros para remover o excesso de etanol e deixe os grânulos secarem por 10 minutos ou até que apareçam rachaduras nos grânulos do grânulo.

Adicione 40 microlitros de água pré-aquecida a cada amostra seca e sele a placa antes de fazer o vórtice completo e gire brevemente por pulso. Em seguida, quantifique o DNA, usando um ensaio de quantificação de fluorescência, de acordo com protocolos padrão. As medidas de tamanho do fragmento de cromatina cisalhada demonstram grande reprodutibilidade, sendo observadas mais de 70% das amostras entre 100 e 500 pares de bases por 14 ciclos.

Conforme ilustrado, o ciclo em que a intensidade da amostra marcada é metade do máximo médio é ideal para a determinação do ciclo. Os melhores dados de sequenciamento são obtidos quando mais de 85% dos fragmentos de DNA variam entre 200 a 1000 pares de bases. Nessas trilhas de enriquecimento representativas para quatro loci gênicos, trilhas individuais para cada amostra mostram uma alta qualidade de mapeamento e relação sinal-ruído.

Os dois primeiros loci abrigam genes bem expressos nesses tipos de células, enquanto os genes nos dois últimos loci não são expressos e servem como controles de fundo. Para a maioria das comparações pareadas, os índices de correlação de Pearson mostram mais de 90% de correlação, sugerindo um alto nível de consistência entre as réplicas biológicas. Enquanto os loci específicos do tipo de célula exibem um alto enriquecimento nas células apropriadas, um gene de manutenção mostra uma modificação de histona muito consistente.

A análise de correlação entre o conjunto de dados ChIP-Seq realizada a partir de amostras com menos de 100.000 células ainda demonstra uma alta reprodutibilidade e correlação até 10.000 células. No entanto, há um aumento do histórico à medida que o número de células é reduzido, bem como uma diminuição em seus coeficientes de correlação. A lise adequada das células é essencial para gerar dados de alta qualidade, pois descobrimos que a lise celular incompleta afeta o restante do protocolo.

Usando este método, muitas modificações diferentes de histonas e fatores de transcrição podem ser testados em vários tipos de células de interesse para aprofundar nossa compreensão dos elementos cis-reguladores.