Coloração histológica usando seções de tecido flutuantes livres
25 de agosto de 2020
A técnica de flutuação livre permite que os pesquisadores realizem colorações histológicas, incluindo imuno-histoquímica em seções de tecido fixas para visualizar estruturas biológicas, tipo de célula e expressão e localização de proteínas. Esta é uma técnica histoquímica eficiente e confiável que pode ser útil para investigar uma infinidade de tecidos, como cérebro, coração e fígado.
Esta técnica de flutuação livre pode ser usada para realizar imuno-histoquímica diminuída em amostras de tecido cerebral de camundongo. A técnica de flutuação livre oferece várias vantagens. A aquisição de cortes de tecido mais espessos, a realização de estudos em larga escala, utilizando 30 a 40 cortes por alíquota e o armazenamento a longo prazo das amostras.
Se você estiver tentando essa técnica pela primeira vez, recomendamos que você pratique a montagem de seções que não são críticas para o seu experimento para obter experiência com o método. Pelo menos uma a duas horas antes do seccionamento, aclimatar as amostras de interesse no criostato na temperatura apropriada de corte do tecido. Quando os lenços estiverem prontos.
use o criostato para adquirir seções de 20 a 50 mícrons de espessura e coloque as seções em inserções individuais em poços preenchidos com PBS de uma placa de seis ou 12 poços. Quando todas as seções tiverem sido adquiridas, cubra as amostras com aproximadamente seis mililitros por lavagem por três lavagens de cinco minutos antes de transferir cada poço de seções para dois tubos de microcentrífuga de mililitros, contendo de um a 1,5 mililitros de solução de armazenamento por tubo. Em seguida, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até a coloração.
Para coloração de seção de tecido, equilibre as amostras à temperatura ambiente por 10 a 20 minutos antes de decantar as seções em inserções em uma nova placa de seis poços. Quando toda a solução de armazenamento tiver sido drenada, mova as inserções para novos poços, contendo aproximadamente seis mililitros de TBS por poço por três lavagens por cinco minutos com TBS fresco por lavagem em um agitador orbital em baixa velocidade à temperatura ambiente. Após a última lavagem, adicione sete mililitros de solução permeabilizante de bloqueio recém-preparada a cada poço para uma incubação de 30 minutos no agitador à temperatura ambiente.
No final da incubação, adicione um mililitro da solução de anticorpo primário de interesse a um tubo de microcentrífuga de dois mililitros por inserto e transfira todas as seções de cada inserto para o tubo de dois mililitros apropriado. Em seguida, coloque os tubos em um misturador rotativo. Adicione cerca de sete rotações por minuto para uma incubação noturna a quatro graus Celsius.
Na manhã seguinte, transvase as seções de cada tubo em inserções de poço individuais em uma nova placa de seis poços e lave as seções duas vezes por 30 segundos por lavagem e uma vez por 10 minutos em TBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, transferir os grupos de secções para tubos individuais de microcentrífuga de dois mililitros, contendo um mililitro da solução de anticorpos secundários adequada por tubo, e incubar as amostras durante duas horas à temperatura ambiente num agitador orbital a baixa velocidade, protegido da luz. No final da incubação, decantar as secções em inserções numa nova placa de seis poços e lavar as amostras duas vezes durante 30 segundos e uma vez durante 15 minutos em TBS fresco por lavagem, protegido da luz.
Após a última lavagem, transvase as seções em uma câmara histológica retangular de vidro, três quartos preenchidos com TBS e mergulhe uma lâmina de vidro na TBS. Usando um pincel fino e uma lâmpada de aumento, se desejar, persuada cuidadosamente as seções em direção à lâmina e bata suavemente uma seção na lâmina, certificando-se de que não haja rugas ou dobras. Quando todas as secções tiverem sido captadas para uma lâmina, deixe-as secar durante cerca de 10 a 15 minutos à temperatura ambiente, protegidas da luz, até que fiquem opacas e aplique um meio de montagem aquoso adequado às secções.
Use uma pinça para colocar uma lamínula no meio e use um pedaço de papel de filtro para pressionar firmemente a lamínula para remover qualquer excesso de meio. As seções podem então ser fotografadas, usando um microscópio apropriado ou armazenadas em uma caixa de lâminas escura ajustada a quatro graus Celsius. Conforme observado nessas imagens representativas, a análise imuno-histoquímica fluorescente, usando o método de flutuação livre, pode ser realizada em seções de tecido cerebral de camundongo para examinar a expressão de proteínas ácidas fibrilares gliais.
Essa abordagem também é apropriada para revelar proteínas de baixa expressão, como GFP, em uma amostra de cérebro de camundongo transgênico de baixa expressão ou em protocolos de coloração histoquímica não fluorescente, como violeta de cresila. Outros tecidos periféricos também são passíveis de uso desta técnica sem necessidade de modificações, conforme observado para essas amostras de tecido hepático que expressam GFP de baixo nível. A coisa mais importante a lembrar com a técnica de flutuação livre é ser gentil com as seções, especialmente durante as transferências e quando as amostras estão nos agitadores ou rotadores.
Além de uma coloração de imunofluorescência, este método pode ser facilmente modificado para outras colorações histoquímicas, como hematoxilina e eosina e violeta de cresila, ou para imuno-histoquímica de cromogênio.
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Visão Geral
A técnica de seções livres em suspensão é utilizada para realizar imunohistoquímica em cortes de tecido fixado, permitindo a visualização de estruturas biológicas, tipos celulares e expressão proteica. Este método é particularmente eficaz para investigar diversos tecidos, como cérebro, coração e fígado, e oferece vantagens como cortes de tecido mais espessos e adequação para estudos em larga escala.
Principais Componentes do Estudo
Área de Pesquisa
- Histologia
- Imunohistoquímica
- Análise de tecidos
Contexto
- As vantagens da técnica de seção livre incluem um manuseio mais fácil e a possibilidade de armazenamento prolongado das amostras.
- Este método é aplicável a diversos tipos de tecidos biológicos sem necessidade de modificações.
- Ele melhora a detecção de proteínas com baixa expressão em diversos tipos de amostras.
Métodos Utilizados
- Coloração imunohistoquímica
- Amostras de tecido cerebral de camundongo
- Microscopia fluorescente
Resultados Principais
- A técnica permite a identificação da expressão da proteína ácida fibrilar glial.
- Ela demonstra eficácia em contextos de baixa expressão proteica, como em amostras de camundongos transgênicos para GFP.
- Outros métodos de coloração, como hematoxilina e eosina, também podem ser aplicados utilizando esta técnica.
Conclusões
- O estudo destaca a versatilidade da técnica de flutuação livre para coloração e análise de tecidos.
- É fundamental que os pesquisadores manipulem as amostras com cuidado para manter a integridade durante a experimentação.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A técnica de imunohistoquímica em suspensão permite o processamento eficiente de cortes espessos de tecido para estudos em larga escala, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pesquisas de neurociência e tecidos periféricos. Ao melhorar a penetração de anticorpos e permitir o manuseio em lote de 30 a 40 cortes por alíquota, ela aumenta a reprodutibilidade e a produtividade em fluxos de trabalho de descoberta. Essa abordagem é particularmente valiosa para o estudo de padrões de expressão proteica em tecidos complexos, como o cérebro, onde a reconstrução tridimensional de projeções neurais orienta a confiança no alvo e a priorização de portfólios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a visualização da expressão e localização de proteínas em cortes de tecidos espessos, apoiando a validação funcional de alvos e a elucidação de vias.
- Valor Operacional: Facilita o manuseio de grande número de cortes por alíquota, reduzindo o trabalho em campanhas de triagem em larga escala de biomarcadores.
- Valor Preditivo: Melhora a penetração de anticorpos em comparação com métodos em lâminas, aumentando a confiabilidade na detecção de alvos de baixa abundância, como GFP em modelos transgênicos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Compatível com múltiplas colorações histoquímicas, incluindo hematoxilina e eosina, violeta cresílico e imunohistoquímica com cromógeno, permitindo o desenvolvimento flexível de ensaios.
- Valor Operacional: Os cortes permanecem suspensos na solução durante a coloração, garantindo exposição uniforme aos reagentes e minimizando a variabilidade entre réplicas.
- Escalabilidade: Permite armazenamento de longo prazo a -80°C, possibilitando o processamento em lotes e análises retrospectivas em fluxos de descoberta.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Aplicável tanto ao sistema nervoso central quanto a tecidos periféricos (por exemplo, fígado, coração) sem modificações no protocolo, permitindo a validação cruzada entre alvos.
- Redução de Riscos Mecanística: Permite a reconstrução tridimensional de projeções axonais e dendríticas, fornecendo contexto estrutural para a análise de engajamento do alvo e de vias.
- Avanço com Base no Nível de Risco: Gera dados quantitativos de expressão proteica com resolução espacial, que orientam decisões de avançar ou interromper estudos na seleção pré-clínica de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método de flutuação livre insere-se no continuum de descoberta, desde a testagem inicial de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos promissores e validação pré-clínica, particularmente na neurociência e na avaliação de toxicidade sistêmica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação baseada em hipóteses de padrões de expressão proteica em tecidos fixados, permitindo insights mecanicistas sobre a biologia do alvo.
- Triagem: Gera sinais quantitativos reprodutíveis por fluorescência ou cromogênicos, adequados para plataformas automatizadas de imagem e triagem baseada em imagem.
- Análises: Produz dados de expressão com resolução espacial que podem ser quantificados e comparados entre condições experimentais para avaliar a modulação do alvo.
- Pesquisa Translacional: Permite consistência entre modelos de descoberta e pré-clínicos ao aplicar protocolos idênticos de coloração entre espécies e tipos de tecidos.
- Reutilização Corporativa: Representa uma plataforma padronizada e adaptável para análise histológica que pode ser implementada em múltiplos projetos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a sensibilidade e especificidade da detecção em imunohistoquímica, reduzindo resultados falso-negativos em estudos de validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza os procedimentos de manipulação de tecidos e coloração, melhorando a reprodutibilidade entre laboratórios e reduzindo a variabilidade técnica.
- Valor Estratégico: Aumenta a produtividade em triagens baseadas em histologia, diminuindo o custo por amostra e acelerando os ciclos de desmistificação de alvos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização de alvos baseada em dados, fornecendo leituras teciduais confiáveis e multiparamétricas que informam a plausibilidade biológica e as margens de segurança.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em histologia, corte de tecidos e métodos de detecção por imunofluorescência ou cromogênicos.
- Depende do acesso a criostato, micrótomo, agitadores orbitais, misturadores rotativos e microscópios de fluorescência ou campo claro.
- Necessita de tampões padronizados de bloqueio, permeabilização e lavagem para minimizar a ligação inespecífica e garantir a consistência da coloração.
- Requer otimização das concentrações de anticorpos e dos tempos de incubação para cada alvo e tipo de tecido, especialmente para proteínas de baixa abundância.
- Exige manipulação cuidadosa e suave de seções em flutuação livre para evitar danos mecânicos durante as transferências e etapas de incubação.
