Coloração histológica usando seções de tecido flutuantes livres

Esta técnica de flutuação livre pode ser usada para realizar imuno-histoquímica diminuída em amostras de tecido cerebral de camundongo. A técnica de flutuação livre oferece várias vantagens. A aquisição de cortes de tecido mais espessos, a realização de estudos em larga escala, utilizando 30 a 40 cortes por alíquota e o armazenamento a longo prazo das amostras.

Se você estiver tentando essa técnica pela primeira vez, recomendamos que você pratique a montagem de seções que não são críticas para o seu experimento para obter experiência com o método. Pelo menos uma a duas horas antes do seccionamento, aclimatar as amostras de interesse no criostato na temperatura apropriada de corte do tecido. Quando os lenços estiverem prontos.

use o criostato para adquirir seções de 20 a 50 mícrons de espessura e coloque as seções em inserções individuais em poços preenchidos com PBS de uma placa de seis ou 12 poços. Quando todas as seções tiverem sido adquiridas, cubra as amostras com aproximadamente seis mililitros por lavagem por três lavagens de cinco minutos antes de transferir cada poço de seções para dois tubos de microcentrífuga de mililitros, contendo de um a 1,5 mililitros de solução de armazenamento por tubo. Em seguida, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até a coloração.

Para coloração de seção de tecido, equilibre as amostras à temperatura ambiente por 10 a 20 minutos antes de decantar as seções em inserções em uma nova placa de seis poços. Quando toda a solução de armazenamento tiver sido drenada, mova as inserções para novos poços, contendo aproximadamente seis mililitros de TBS por poço por três lavagens por cinco minutos com TBS fresco por lavagem em um agitador orbital em baixa velocidade à temperatura ambiente. Após a última lavagem, adicione sete mililitros de solução permeabilizante de bloqueio recém-preparada a cada poço para uma incubação de 30 minutos no agitador à temperatura ambiente.

No final da incubação, adicione um mililitro da solução de anticorpo primário de interesse a um tubo de microcentrífuga de dois mililitros por inserto e transfira todas as seções de cada inserto para o tubo de dois mililitros apropriado. Em seguida, coloque os tubos em um misturador rotativo. Adicione cerca de sete rotações por minuto para uma incubação noturna a quatro graus Celsius.

Na manhã seguinte, transvase as seções de cada tubo em inserções de poço individuais em uma nova placa de seis poços e lave as seções duas vezes por 30 segundos por lavagem e uma vez por 10 minutos em TBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, transferir os grupos de secções para tubos individuais de microcentrífuga de dois mililitros, contendo um mililitro da solução de anticorpos secundários adequada por tubo, e incubar as amostras durante duas horas à temperatura ambiente num agitador orbital a baixa velocidade, protegido da luz. No final da incubação, decantar as secções em inserções numa nova placa de seis poços e lavar as amostras duas vezes durante 30 segundos e uma vez durante 15 minutos em TBS fresco por lavagem, protegido da luz.

Após a última lavagem, transvase as seções em uma câmara histológica retangular de vidro, três quartos preenchidos com TBS e mergulhe uma lâmina de vidro na TBS. Usando um pincel fino e uma lâmpada de aumento, se desejar, persuada cuidadosamente as seções em direção à lâmina e bata suavemente uma seção na lâmina, certificando-se de que não haja rugas ou dobras. Quando todas as secções tiverem sido captadas para uma lâmina, deixe-as secar durante cerca de 10 a 15 minutos à temperatura ambiente, protegidas da luz, até que fiquem opacas e aplique um meio de montagem aquoso adequado às secções.

Use uma pinça para colocar uma lamínula no meio e use um pedaço de papel de filtro para pressionar firmemente a lamínula para remover qualquer excesso de meio. As seções podem então ser fotografadas, usando um microscópio apropriado ou armazenadas em uma caixa de lâminas escura ajustada a quatro graus Celsius. Conforme observado nessas imagens representativas, a análise imuno-histoquímica fluorescente, usando o método de flutuação livre, pode ser realizada em seções de tecido cerebral de camundongo para examinar a expressão de proteínas ácidas fibrilares gliais.

Essa abordagem também é apropriada para revelar proteínas de baixa expressão, como GFP, em uma amostra de cérebro de camundongo transgênico de baixa expressão ou em protocolos de coloração histoquímica não fluorescente, como violeta de cresila. Outros tecidos periféricos também são passíveis de uso desta técnica sem necessidade de modificações, conforme observado para essas amostras de tecido hepático que expressam GFP de baixo nível. A coisa mais importante a lembrar com a técnica de flutuação livre é ser gentil com as seções, especialmente durante as transferências e quando as amostras estão nos agitadores ou rotadores.

Além de uma coloração de imunofluorescência, este método pode ser facilmente modificado para outras colorações histoquímicas, como hematoxilina e eosina e violeta de cresila, ou para imuno-histoquímica de cromogênio.