Imagem óptica baseada em fotodiodo para dinâmica de rede de gravação com resolução de neurônio único em invertebrados não transgênicos

Este artigo representa uma descrição detalhada de como usar uma matriz de fotodiodos e corantes sensíveis à voltagem para registrar potenciais de ação de um grande número de neurônios simultaneamente. Em comparação com a imagem de cálcio da atividade neural, que é indireta, os corantes sensíveis à voltagem que usamos registram potenciais de ação diretamente semelhantes aos registros de eletrodos afiados, mas em muitos neurônios simultaneamente. Nosso fluxo de trabalho de imagem óptica pode ser adaptado para visualizar rapidamente a atividade da rede com resolução de neurônio único e potencial de ação único em uma variedade de invertebrados não transgênicos e até mesmo sistemas de vertebrados.

Além disso, demonstrando os procedimentos em nosso protocolo estará Evan Hill, do meu laboratório. Comece anestesiando um animal Aplysia californica de 40 gramas e prendendo-o com o lado ventral para cima em uma placa de dissecação forrada com cera. Usando uma tesoura de dissecção, faça uma incisão na linha média de dois a três centímetros ao longo da extensão mais anterior do pé e prenda as abas do pé em ambos os lados da incisão para revelar parte do sistema nervoso central e da massa bucal.

Use fórceps e tesouras de dissecção para dissecar cuidadosamente a massa bucal, revelando os gânglios cerebrais, e cortar os nervos que inervam o corpo do animal para extirpar o sistema nervoso central, deixando um longo comprimento do nervo a ser estimulado. Use pinos minucianos para posicionar o sistema nervoso central em um prato revestido de elastômero cheio de solução salina e perfunda o prato com solução salina passada por um dispositivo de resfriamento Peltier para manter a temperatura de preparação em 15 a 16 graus Celsius. Use a pinça e a tesoura de microdissecção para remover o excesso de tecido conjuntivo dos nervos e dissecar uma porção superficial da bainha no gânglio ou gânglios a serem visualizados.

Em seguida, mergulhe o sistema nervoso central limpo em uma solução de glutaraldeído a 0,5% em solução salina por 20 segundos antes de retornar o sistema nervoso central ao prato revestido com elastômero perfundido com solução salina para enxaguar o excesso de glutaraldeído. Para preparar uma solução de trabalho de corante sensível à voltagem, adicione 500 microlitros de solução salina a uma alíquota sólida previamente preparada de RH 155 para atingir uma concentração final de corante de 0,3 miligramas por mililitro. E use um microdispensador portátil para carregar 200 microlitros de solução em um pedaço de tubo de polietileno com um diâmetro semelhante ao do gânglio a ser corado.

Usando um micromanipulador, coloque cuidadosamente a extremidade do tubo sobre o gânglio alvo, abaixando o tubo até formar uma vedação confortável sobre o gânglio. Gire o botão aplicador do microdispensador a cada cinco minutos por uma hora para forçar mais corante no gânglio, verificando a amostra em 30 minutos para confirmar se a coloração adequada está ocorrendo. Após a coloração, mantendo as luzes apagadas, coloque um material tampão apropriado à esquerda e à direita de onde a preparação será colocada na câmara de imagem contendo solução salina e, em seguida, mergulhe o sistema nervoso central na câmara.

Pressione um pedaço de lamínula de tamanho adequado sobre o tecido e pressione firmemente a lamínula para achatar o tecido sem danificar os neurônios. Em seguida, coloque a câmara de imagem sob um microscópio de dissecação. Se estimular um nervo para provocar um programa motor fictício, derreta cuidadosamente um segmento de tubo de polietileno PE100 sobre uma chama enquanto puxa suavemente ambas as extremidades do segmento do tubo e corta o cone resultante no ponto desejado.

Em seguida, conecte um pedaço de tubo de polímero flexível de paredes espessas à extremidade traseira de um eletrodo de sucção de polietileno. Em seguida, use uma seção da boca para criar pressão negativa e puxe um pequeno volume de solução salina através da extremidade cônica do eletrodo de sucção. Desenhe a extremidade do nervo a ser estimulado no eletrodo sob o microscópio e confirme se a solução salina no eletrodo não possui bolhas que possam interromper a condução elétrica.

Para imagens do gânglio, mova a câmara para o equipamento de imagem e inicie a perfusão salina através da câmara de registro. Coloque uma sonda de temperatura perto da preparação e defina a temperatura conforme apropriado para a espécie que está sendo fotografada. Coloque um fio de prata clorado no eletrodo de sucção, certificando-se de que ele entre em contato com a solução salina no eletrodo e coloque um fio de cloreto de prata na solução salina do banho perto do eletrodo de sucção.

Abaixe a lente de imersão em água na solução salina e feche o diafragma de base. Levante ou abaixe o condensador do subestágio e ajuste o foco até que as bordas do diafragma estejam em foco nítido, criando iluminação Kohler. Concentre-se na região da preparação a ser fotografada e adquira uma imagem do gânglio de interesse com a câmera digital parfocal.

Defina a chave de ganho do painel de controle para 1X e clique no botão de intensidade da luz em repouso para verificar a intensidade média da luz em repouso dos diodos. Ajuste o nível de tensão enviado de um estimulador para a fonte de alimentação da lâmpada LED e continue verificando o nível médio de intensidade da luz em repouso até que esteja na faixa desejada. Em seguida, defina a chave de ganho do painel de controle para 100X para a gravação e verifique novamente se a mola ou a mesa de ar está flutuando.

Com as luzes ainda apagadas, defina a duração, o caminho e o nome do arquivo no software de imagem e clique em obter dados para adquirir arquivos até a capacidade da RAM disponível do computador. Tome cuidado para permanecer imóvel durante a gravação, pois pequenas vibrações podem introduzir grandes artefatos nos dados de gravação óptica. Para visualizar os dados imediatamente após a aquisição, use a função sobreposta para sobrepor os dados coletados por todos os 464 diodos sobre a imagem do gânglio e clique em qualquer um dos diodos representados no software para expandir os dados registrados em uma tela de rastreamento separada.

Para obter um alinhamento exato dos diodos em relação à preparação, insira os fatores X, Y e de ampliação conforme determinado por um teste de orifício. Para maximizar a visibilidade do potencial de ação e melhorar o rendimento do neurônio para a classificação de pico subsequente, imponha um filtro Butterworth passa-banda com cortes de cinco e 100 Hertz para remover o ruído de baixa e alta frequência. Para salvar os dados ópticos filtrados como um arquivo de texto para análise subseqüente, na tela de página, marque a caixa Filtro TP.

E na guia de saída, selecione salvar página como ASCII. Em seguida, insira um nome de arquivo apropriado na caixa de diálogo exibida. O contato da pele com seu predador estrela do mar desencadeia o mergulho de fuga da Tritonia diomedia, que consiste em uma série rítmica de flexões de corpo inteiro que a impulsionam para a segurança.

Nesta figura, são mostrados dados brutos e filtrados de 20 diodos que registram a atividade antes, durante e após a estimulação do nervo pedal três. Imediatamente após a aquisição, os sinais medidos por todos os 464 diodos da matriz de gravação podem ser exibidos topograficamente sobre uma imagem da preparação no software de imagem. Nesta análise, a classificação de pico dos traços de diodo filtrado com análise de componentes independentes, ou ICA, produziu 53 traços neuronais únicos, 30 dos quais são mostrados aqui.

Um estímulo de cauda fortemente aversivo para Aplysia californica provoca ondas repetidas de uma resposta de fuga rítmica de duas partes que consiste em um período de galope de vários ciclos de estocadas de cabeça e puxões de cauda que movem o animal rapidamente para frente e um período de rastejamento subsequente. Nesta análise representativa, um minuto em uma gravação óptica contínua de 20 minutos, o nervo pedal nove foi estimulado para eliciar a sequência do programa motor de galope. As distribuições espaciais gaussianas probabilísticas dos sinais de todos os 81 neurônios registrados foram mapeadas no gânglio.

A redução da dimensionalidade aplicada ao registro completo revelou que as fases de galope e rastejamento do programa de fuga ocuparam áreas distintas e formam trajetórias diferentes no espaço do componente principal. Ao tentar este protocolo, considerações importantes incluem: otimizar a coloração, minimizar a vibração e direcionar luz suficiente através da preparação para o PDA, minimizando o fotobranqueamento do corante. Exemplos de análise pós-aquisição que revelaram insights de rede em nível populacional incluem detecção de conjunto funcional por meio de agrupamento de consenso em algoritmo de aprendizado não supervisionado e redução de dimensionalidade usando análise de componentes principais.

A combinação de nosso sistema de imagem baseado em matriz de fotodiodos e nosso uso de corantes absorventes sensíveis à tensão permite o monitoramento da evolução dinâmica da rede por longos períodos de tempo.