Derivação, Expansão, Criopreservação e Caracterização de Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

Os BMECs gerados a partir de iPSC fornecem novos modelos experimentais para estudar a função e disfunção da barreira hematoencefálica. Usamos este protocolo para examinar se os BMECs mantêm suas propriedades de barreira após a expansão e criopreservação. Essa técnica permite a geração de BMECs específicos da doença de pacientes com distúrbios nos quais a ruptura da barreira hematoencefálica desempenha um papel na fisiopatologia da doença.

Para induzir a diferenciação de BMEC de iPSCs humanas, lave a cultura de iPSC confluente com DPBS uma vez antes de incubar as células com o volume apropriado de EDTA enzimático por aproximadamente cinco minutos a 37 graus Celsius. Quando uma única suspensão celular tiver sido obtida, coletar as células por centrifugação e ressuspender o pellet em um volume apropriado de meio de células-tronco suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolar para contagem. Dilua as células para 1,56 vezes 10 elevado ao quarto de células por centímetro cúbico de concentração e semeie dois mililitros de células em poços individuais de um fundo plano de seis poços.

Após 24 horas na incubadora de cultura de células, substitua o sobrenadante em cada poço por meio E6 e retorne a placa à incubadora por mais quatro dias. Para purificar os BMECs derivados de iPSC, cubra as placas de subcultura com o volume apropriado de uma solução de colágeno IV e fibronectina recém-preparada por poço e incube as placas por no mínimo duas horas a 37 graus Celsius. No sexto dia de diferenciação, colete as células por centrifugação e ressuspenda os pellets no volume apropriado de meio fresco livre de soro endotelial humano suplementado com B27, fator de crescimento de fibroblastos básicos e ácido retinóico.

Para análise TEER, coloque as células diferenciadas em cada poço de uma placa filtrada de 12 transpoços revestida com colágeno e fibronectina. Para análise da atividade do transportador de efluxo, coloque as células em cada poço de uma placa de fundo plano de 24 poços revestida com colágeno e fibronectina. Após 24 horas de subcultura, substituir o sobrenadante em cada alvéolo por meio fresco sem soro endotelial humano, suplementado apenas com suplemento de B27.

Para medir as propriedades da barreira hematoencefálica dos BMECs usando TEER, carregue o instrumento TEER durante a noite e limpe levemente o instrumento e os eletrodos do pauzinho com etanol a 70% antes de colocá-los na capa de segurança. Ligue a energia e calibre o ohmímetro de acordo com as especificações do fabricante. Conecte os eletrodos e enxágue-os uma vez com etanol 70% e uma vez com DPBS.

Coloque a extremidade mais curta do eletrodo na câmara atípica do inserto e a extremidade mais longa na câmara basolateral de um poço em branco. Depois de medir a resposta de controle negativo, enxágue rapidamente os eletrodos conforme demonstrado e meça o primeiro poço experimental. Depois que todas as medições forem registradas, enxágue os eletrodos dos pauzinhos novamente, limpe suavemente os eletrodos e deixe-os secar ao ar na capa de segurança.

Para avaliar a atividade do transportador de efluxo das células, no oitavo dia de cultura, trate o número apropriado de poços com uma solução inibidora do transportador de efluxo 10 micromolares e coloque em uma incubadora por uma hora a 37 graus Celsius. No final da incubação, trate as células com uma solução de substrato transportador de efluxo 10 micromolares por uma hora na incubadora. No final da incubação, lave cada poço duas vezes com 500 microlitros de DPBS por poço antes de lisar as células com 500 microlitros de DPBS suplementados com 5% de Triton-X por poço.

Após cinco minutos, use um leitor de microplacas para medir a fluorescência das células lisadas com uma excitação de 485 nanômetros e uma emissão de 530 nanômetros. Para poços não usados no ensaio do transportador, lave as células duas vezes com DPBS antes de fixar com 4% de paraformaldeído por quantificação de núcleos celulares. Após um dia de cultivo em meio E6, a morfologia celular é semelhante à das iPSCs.

No quarto dia, as células são visivelmente distintas das iPSCs e cobrem a maior parte do poço. Dois dias de cultivo em meio livre de soro endotelial humano induzem uma aparência alongada e de paralelepípedos nas células. No oitavo dia, as células individuais formam um padrão de paralelepípedos maioritariamente grande.

Um ensaio de germinação pode ser realizado para demonstrar o potencial angiogênico de BMECs derivados de iPSC. Isso leva ao desenvolvimento de estruturas semelhantes a tubos após três dias de tratamento com fator de crescimento. Os BMECs derivados de iPSC gerados usando este protocolo co-expressaram proteínas de junção apertada expressas em células endoteliais no cérebro, pulmão, fígado e rim, bem como marcadores endoteliais vasculares expressos na barreira hematoencefálica.

Como observado, 48 horas após a subcultura e a mudança do meio, os BMECs derivados de iPSC demonstram valores de TEER dentro da faixa descrita para BMECs derivados de iPSC que foram co-cultivados com astrócitos primários de ratos. A atividade do transportador de efluxo também foi observada nesta fase. Após a criopreservação, as medições de TEER são menores em comparação com BMECs recém-derivadas.

A análise de Western blot revela níveis reduzidos de marcadores de junção apertada, como a oclusina, enquanto a imunocitoquímica mostra padrões sardentos e/ou desgastados de proteínas de junção apertada. Uma densidade de iPSC muito alta ou muito baixa afetará a eficiência de diferenciação e afetará o desenvolvimento de propriedades apropriadas da barreira hematoencefálica. Este método permite a investigação das propriedades de barreira, sinalização celular e atividade do transportador usando BMECs individualizados para modelar a fisiologia e fisiopatologia da função de barreira hematoencefálica.